1. 引言
实验教学是高等教育的重要组成部分，是现代教学的重要方式之一，对于大学生动手能力和创新思维的培养具有极其重要的作用。但是，现在的本科实验教学多以教师为主导，以教材为依据，以验证性实验为主，导致相当一部分实验项目的实训内容过于基础，操作过于程式化和单一化，强调技术的规范和熟练，忽略了学生科研思维和能力的培养，难以激发学生的主动性、兴趣性和创造力。为改善以上实验教学的现状，综合实验教学是现高校实验教学改革的重要组成部分。
当下的《仪器分析》实验教学内容过于孤立，集中在光、电、色谱等内容上，过分侧重于各部分知识本身的独特性和整体性，只强调单一内容的理解和掌握，比较缺少光、电、色谱等内容之间的联系和交流，更缺乏的是把各部分知识的要素串联起来，从中揭示知识体系之间的本质关系和发展规律的能力。而且，受实验教材、实验学时等方面的影响，在实验内容上也以验证性实验为主，学生按部就班地操作，过程受到教师和教材的限制，课堂沉闷，不利于学生兴趣的发展和活力的体现。有鉴于此，综合实验教学应以多学科或者跨学科的实验内容为主，尽量考虑到实验方法的综合性，促进对学科的交叉性、方法的融合性、学生的创新性等方面的培养，以区别于传统的实验教学，更好地构建、培养学生的整体思维能力和科研素养及技能。
花青素是一种水溶性天然色素，属类黄酮，3,5,7,4’-四羟基黄酮阳离子的糖基化衍生物，因其在B环上存在不同的取代基，形成不同种类的花青素 [1] ，基本结构如图1所示。花青素广泛存在于水果、蔬菜和花卉等天然植物中，可使植物(叶、茎、根、花和果实)的颜色呈现红色、紫色或蓝色，具有抗炎 [2] [3] 、抗癌 [4] [5] 、抗动脉粥样硬化 [6] 和抗哮喘 [7] 等作用。迄今为止，超过635种不同类型的花色苷在自然界中被鉴定出来，自然界中含量最丰富的花色苷为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside, C3G) [8] ，黑米富含C3G，具有较高的营养价值。
注：R1和R2是H、OH、OCH3，R3是糖苷或H，R4是糖基或OH
Figure 1. Basic structure of anthocyanins
图1. 花青素基本结构
pH示差法和高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography, HPLC) [9] 常用于花青素的定量检测。官方农业化学家协会(AOAC)通常采用pH示差法测量各种植物的花青素，研究实验室和食品工业中富含花青素的水果和蔬菜 [10] [11] 。它是一种快速、简便的方法，不需要高成本的仪器。原理如图2所示，花青素在低pH时以黄酮阳离子(红色)存在，在pH4.5时转化半缩酮形式(无色) [12] ，利用不同pH下花青素结构转变引起吸光度变化，从而实现对花青素的测定 [13] [14] 。近年来，随着HPLC的广泛应用，HPLC结合紫外/可见检测/二极管阵列检测(DAD)成为最重要的色谱技术之一，可用于分离、鉴定和定量单个花青素，被认为是一种可靠的检测花青素的方法 [8] 。
运用HPLC检测C3G的研究已在大量文献中报道过，也出现运用智能手机与比色法相结合检测C3G的报道 [15] ，然而很少有研究对比pH示差法与HPLC方法检测C3G含量。结合自身科研工作和文献调研，设计了该综合实验，目的在于对比pH示差法与高效液相色谱法检测黑米中C3G的准确性，并对两种方法所得到的结果进行分析。学生自主从样品的提取溶剂、C3G的结构等方面分析pH示差法和HPLC法检测C3G结果差异的原因，进一步探究了C3G的结构特性对检测结果的影响，为实验室进行pH示差法和HPLC法评估定量检测的准确性提供了新的思路，也为实际样品中C3G的检测方法选择提供重要依据。该综合实验培养学生从实际问题出发，探索不同路径解决问题的能力，并对几种所学的仪器分析原理加以巩固，了解科学前沿的热点、掌握科学研究的方法，培养综合思维以及创新能力，可作为《仪器分析》课程的综合实验设计。
Figure 2. Predominant structural forms of anthocyanins present at different pH levels
图2. 在不同pH值下花青素的存在形式
2. 材料和方法
2.1. 材料与仪器
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品(纯度 ≥ 98%)中国四川省维克奇生物科技有限公司；甲醇色谱纯，成都市科隆化学品有限公司；氯化钾、无水乙酸钠、盐酸分析纯，成都市科龙化工试剂厂；磷酸分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；其他试剂皆为分析纯，无需进一步纯化。在整个实验过程中使用电阻率为18.25 MΩ的超纯水。
黑米(Semen Trigone.)采购于成都市场。在使用样品前，将黑米样品置于室温下避光保存。
KQ-500DE型数控超声波清洗器中国江苏昆山市超声仪器有限公司；L500医用离心机中国长沙湘仪离心机仪器有限公司；A580紫外可见分光光度计中国上海翱艺仪器有限公司；PHS-25 pH计上海艺电科学仪器股份有限公司；QE100高速粉碎机中国浙江屹立工贸有限公司；LC-20液相色谱仪日本岛津公司；HH-1数显恒温水浴锅中国常州澳华仪器有限公司。
2.2. 标准溶液的配制
C3G标准储备液：称取10 mg的C3G，溶解于5 mL的甲醇，得到2 mg/mL的储备液，置于−20℃冰箱避光保存备用。
系列标准溶液：根据需要稀释C3G储备液，用甲醇稀释储备液以获得0.5~60 mg/L浓度范围的标准溶液，避光保存，临用现配。
2.3. 缓冲溶液的配制 [16]
对pH示差法所需要的缓冲溶液进行配制。
氯化钾–盐酸缓冲溶液的制备：准确称取1.49 gKCl，用超纯水定容至100 mL；将浓HCl用超纯水稀释至浓度为0.2 mol/L。KCl溶液与0.2 mol/L HCl按照体积比25:67进行混合配制。用KCl溶液调pH至1.0 (±0.1)。
乙酸钠缓冲溶液的制备：准确称取1.64 g无水乙酸钠，用超纯水定容至100 mL，用0.2 mol/L HCl调pH至4.5 (±0.1)。
2.4. 样品处理 [17] [18]
黑米使用高速粉碎机粉碎，过80目筛，称取0.5 g黑米粉末溶于5 mL甲醇，混匀后避光超声30 min，将混合物以3000 rmp/min离心5 min。重复提取一次后，取上清液混匀，通过0.22 μm滤膜过滤。将黑米提取液避光储存于−20℃冰箱中。
2.5. pH示差法
2.5.1. 实验步骤
将所提取的黑米样品用盐酸–氯化钾缓冲液(pH1.0)和乙酸钠缓冲液(pH4.5)分别进行稀释，稀释10倍至最终体积为2 mL，在30℃下反应50 min后，以蒸馏水作为空白对照，在516 nm (λmax)和700 nm处测量两种稀释液(pH1.0盐酸–氯化钾缓冲液和pH4.5乙酸钠缓冲液)下的黑米样品的吸光度，每个样品浓度(mg/L)根据公式计算并表示为C3G的含量。
2.5.2. 经验公式计算方法 [19]
使用以下公式计算原始样品中的C3G浓度(mg/L)
其中
。
MW是C3G的分子量为449.2 g/mol；DF是稀释因子(0.2 mL样品稀释至2 mL，DF = 10)；ɛ是C3G的消光系数(L × cm−1 × mol−1) = 26,900，其中L(路径长度，cm) = 1。
2.6. 高效液相色谱分析条件
2.6.1. 波长选择
在HPLC法进行含量测定时，为了提高方法的灵敏度，降低干扰，往往选用主成分的最大吸收波长作为检测波长。因此，用紫外分光光度计在200~800 nm范围内扫描25 mg/L的C3G标准溶液。从标准溶液的紫外光谱(图3)中可看出，C3G在516 nm处有最大吸收峰，故C3G的最大吸收波长为516 nm。所以，本实验中HPLC法的紫外检测器均设置为516 nm。
2.6.2. HPLC分析条件
根据文献所描述方法 [20] 分析C3G，紫外检测器设置为516 nm，使用配备ZORBAX Eclipse Plus C18 (250 mm × 4.6mm, 5 μm)。柱温为30℃。洗脱液为流动相A (0.5%甲酸水溶液)和流动相B (0.5%甲酸甲醇溶液)。进行梯度洗脱，色谱条件为：0~6 min，B (10~20%)；6~10 min，B (20~30%)；10~15 min，B (30~35%)；15~20 min，B (35~50%)；20~24 min，B (50~90%)；24~29 min，B (90~10%)；29~30 min，B (10%)，流动相流速为1 mL/min，进样量为10 μL。
3. 结果与讨论
3.1. pH示差法
3.1.1. pH的选择
通过测量2个不同pH值(pH 3.4和2.0)下吸光度变化来确定材料中花青素含量的概念是1948年由Sondheimer等人首次提出 [21] ，他们使用pH 2.0和pH 3.4溶液之间的差异测量来确定草莓和草莓产品中花青素的浓度。从那时起，研究人员进行了方法条件的优化评估，最终提出使用pH值1.0和4.5 [14] 作为示差法的pH条件用于花青素的定量检测。pH示差法是一种根据花色苷发色团在pH 1.0~4.5之间的结构变化，从而测定单体花青素含量的方法。在pH值为1.0时，以有色的氧羰基(红色)为主；在pH值为4.5时，以半缩酮(无色)为主。pH示差法基于该反应，即使在聚合降解色素和其他干扰化合物存在的情况下，也可以准确快速地测量花青素。因此，在本研究中，选用1.0和4.5作为pH示差法的pH值用于准确检测黑米中总花青素含量。
3.1.2. 波长的选择
根据朗伯–比尔定律 [22] ，在两个不同的pH下，花青素的吸光度差值与花青素含量呈正比。通过两个pH在同一波长(花青素最大可见吸收波长)下的吸光度差值以及在700 nm处测得的用于校正略微浑浊供试液的吸光度值可求得花青素 [23] 。为确定最大吸收波长，首先将光谱仪校准为零，然后在200~800 nm范围内扫描C3G标准品(25 mg/L)的最大吸收波长。如图3所示，在516 nm处观察到强吸收峰，确定516 nm为C3G的最大吸收波长。因此，选用516 nm和700 nm作为pH示差法检测黑米中总花青素含量的波长。
3.1.3. 样品的测定
pH示差法是一种快速简便的测定花青素的方法 [24] ，花青素色素在不同pH值呈现不同的结构状态，并且吸收光谱明显发生不同。分别在516 nm (最大吸收波长)和700 nm处检测不同pH值下黑米样品的吸光度，将检测结果代入2.5.2中经验公式，计算得到黑米中C3G的结果。在检测样品的过程中，样品中存在一些胶状物质，出现浑浊外观，故检测700 nm处吸光度以校正雾度是有必要的。如表1，黑米样品中C3G的平均含量为29.95 mg/L。
Table 1. Detection results of C3G in black rice samples by pH differential method
表1. 黑米样品中C3G的pH示差法检测结果
3.2. HPLC法
在检测黑米C3G的体系中，以C3G标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立了标准曲线(图4)，线性方程为y = 26414.92828 + 16518.87766x，C3G在1~60 mg/L不同浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系(相关系数r2为0.99391)。如图5所示，在λ为516 nm处，将黑米样品提取液的HPLC色谱图与40 mg/L C3G标准液进行保留时间比较，确定黑米样品中峰1 (图6)为C3G，将峰1的峰面积代入上述线性方程，计算得到黑米提取液中C3G的含量为36.79 mg/L。
Figure 6. Chromatogram of black rice sample
图6. 黑米样品提取液的色谱图
3.3. pH示差法和HPLC法对比
通过两种方法的结果可判断(表2)，HPLC法和pH示差法检测黑米中的C3G结果比较一致。由于黑米中C3G是由甲醇提取，这种溶剂体系能使细胞变性，同时溶解花青素并使其稳定 [25] 。花青素与一般的黄酮类化合物一样，具有含极性取代基(羟基、羧基和甲氧基)的芳香环和葡萄糖苷残基，这些残基都会导致分子具有极性 [26] ，可在温和条件下用冷酸化溶剂(极性有机溶剂、水)提取花青素 [26] 。有机溶剂通常是甲醇，但也可以使用丙酮、乙醇或乙腈等。本实验中，pH示差法检测正常黑米中的C3G含量为29.95 mg/L，而HPLC法测定结果为36.79 mg/L，由此可判断pH示差法检测黑米C3G虽具有一定的准确性，但pH示差法所检测的结果相较HPLC法而言较低。导致这种结果的可能原因为花青素通常与辅色素结合，以共呈色的形式存在 [27] ，因此花青素含量越高，这种作用越强。这种现象往往会导致偏离朗伯-比尔定律 [22] 的现象出现，从而影响pH示差法对C3G的含量测定。其次，pH示差法仅针对游离状态的花青素分子，而聚合形式的花青素在pH值分别为1.0、4.5时均有吸收 [23] ，因此在pH值为1.0时，辅色素不完全转化导致游离态花青素分子较少 [28] ，可能为pH示差法结果偏低的另一个原因。HPLC是鉴别和定量样品中不同个体花青素的重要工具，其具有分辨率高、灵敏度高、不易受环境影响等优点，可用于含量低、结构复杂的花青素含量测定。pH示差法是一种简单、快速、经济的测定样品中花青素含量的方法，但由于其易受仪器、温度、溶液pH值及操作等的影响 [29] 。相比较下，HPLC法测定结果比pH示差法更加准确。
在本实验中，HPLC法和pH示差法检测黑米中的C3G结果相差不大，而HPLC方法仪器昂贵并且检测时间长，因此，在一定条件下可用pH示差法代替HPLC进行黑米中C3G的测定。
Table 2. Comparison of the determination of C3G in black rice by pH differential method and HPLC
表2. pH示差法与HPLC法测定黑米中C3G的比较
4. 结语
本实验教学模式是一种学生在教师的引导下，结合理论知识的基础上，以小组为单位，自主完成实验方案的设计，独立实施实验过程，并对实验结果进行处理和分析，得出实验结论的新型实验教学模式。该实验教学强调学生的主体地位，教师仅仅起到引导和辅助作用，学生可以在实验过程中加强对理论知识的理解和发现，提出问题并寻求解决办法，在此过程中逐渐培养自主性和创新性，从而养成科学的实验素养和创新精神。
该综合实验涵盖了仪器分析最重要的光谱、色谱两大块知识内容，包含查阅文献、实验技能培养、方案设计、数据处理和机制讨论等环节，能让学生得到较为系统的科学研究训练，全方位培养学生的科研素养与创新能力，开发学生科研探索的潜力，提升学生综合科学素质。此实验教学内容难度适中、可操作性强、综合性较强，适合仪器分析实验教学以小组式、项目制度的形式向学生开放，能充分调动学生的主观能动性，激发探究意识和创新思维。
该综合实验虽得到一些实验结果，但实验过程中仍存在着一些不足之处，之后将在以下几个方面进行改进：
(1) 实验过程需要进一步优化。本实验中从正常黑米中提取C3G的过程繁琐、耗时长，后续将进行提取过程优化，实现繁琐工序重复提取到快速提取的转变，缩短前处理时间，最大限度地保证了学生在规定的实验学时内顺利完成实验，达到实验课安排目的。
(2) 实验教学策略需要进一步完善。本研究是实验内容的改进，只在实验室中成功完成，并未在高校推广，还需要长期的实验教学探索，并根据实际的教学效果不断改善。此外，研究并没有涉及教学策略的研究，没有设计出完整的教学流程。在今后的工作中，将补充这方面的内容，设计完善的教学流程，并且在优化实验的同时，优化教学过程，为实验教学的改革做出贡献。
基金项目
四川省自然科学基金项目(2022NSFSC1475)；成都中医药大学2021年度校级教学质量工程建设重点项目ZLGC202136；成都中医药大学“杏林学者”学科人才科研提升计划(MPRC2022027)；四川省大学生创新创业训练计划(S202210633024)。
参考文献
NOTES
*通讯作者。