1. 引言
蝉花(Cordyceps chanhua)，又名“金蝉花”，是一种在我国具有广泛食药用历史的虫草类食用真菌 [1] [2] 。2020年12月，国家卫生健康委发布第9号公告正式批准蝉花子实体(人工培植)为新食品原料，是蛹虫草、广东虫草后的第三种虫草类新食品原料。目前的研究发现其具有免疫调节 [3] 、镇痛 [4] 、抗疲劳 [5] ，改善睡眠 [6] ，抗氧化 [7] ，抗肿瘤 [8] ，降血糖 [9] [10] ，改善肾功能 [11] 等作用。蝉花含有多种生理活性物质，如虫草多糖、虫草酸、麦角甾醇及腺苷等多种核苷类成分 [12] 。多糖是一种高分子碳水化合物，是蝉花中最主要的活性成分和质控指标之一，具有广泛的药理作用，如抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等 [13] [14] 。虫草酸成分为D-甘露醇，是虫草类真菌的主要有效成分之一，具有平喘祛痰、利尿、提高血浆渗透压、抗氧化等作用 [14] 。麦角甾醇是真菌细胞膜上一种重要甾醇，在虫草中含量相对稳定的同时具有多种药理作用，是维生素D2的前体物质 [15] ，具有抗肿瘤生物活性 [16] 。蝉花核苷类成分主要包括腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷(HEA)等，虫草素是虫草中分离出来的第一个核苷类物质，具有抗炎抗肿瘤等显著生物活性 [17] ；腺苷是一种嘌呤核苷，能抑制中枢神经的兴奋 [18] ，常作为蝉花质量控制指标之一；HEA是蝉花中主要活性成分之一，具有降糖降压 [19] [20] 、抗炎镇痛 [21] 、改善肾功能作用 [22] 。
有研究发现，蝉花具有良好的延寿抗氧化作用 [9] ，但其在酒体中能否发挥原有作用还未可知。因此，以添加不同剂量蝉花虫草酒的培养基喂养果蝇，观察其对果蝇平均寿命、半数死亡时间、最高寿命的影响，并对果蝇体内超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量进行测定，确定其抗氧化作用 [23] ，以了解蝉花虫草酒的功效情况。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 供试材料
基酒(52˚浓香型白酒)购自江苏宿迁金森酒业有限公司；蝉花虫草酒：在酒瓶中人工培养蝉花并灌入基酒浸泡获得，蝉花菌种由浙江泛亚生物医药股份有限公司提供；w1118黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)由中科院上海植物生理生态研究所惠赠。
2.1.2. 仪器与试剂
仪器：美的WKI102T电磁炉；跃进SPX-300-ZB光照培养箱；上海智城ZHJH-C1214B超净工作台；上海花潮DTP-313电子天平；上海佑科721型分光光度计；湖南湘仪H2100R高速离心机。
试剂：玉米粉、蔗糖、琼脂、酵母粉、冰醋酸、无水乙醚；南京建成TP试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒。
2.2. 方法
2.2.1. 果蝇培养基的配置
果蝇基础培养基配置方法：依次称取玉米粉100 g，琼脂8 g，蔗糖80 g，酵母粉9 g，放入锅中，加入1000 ml凉水，搅拌至无结块，开始加热，边加热边搅拌，直至成糊状，关火；再加冰醋酸6 ml，搅拌均匀，使用一次性注射器吸取培养基加入培养管中，每管加入4 ml左右(培养基高约1.5 cm)，置于超净台紫外照射60 min，塞上棉花塞(121℃高压蒸汽灭菌)，放置24~48 h使培养管管壁水汽蒸发(管壁残存水汽使用无菌棉球吸干)，即得可用于果蝇饲养的基础培养基。
加热成糊状后在培养基中加入实验设计剂量的样品，搅拌均匀装入培养管，后续步骤同基础培养基配置，最后所得为实验培养基。
2.2.2. 不同剂量蝉花虫草酒对果蝇寿命的影响
在果蝇培养基中分别添加0.2%、1.0%、5.0%的蝉花虫草酒作为实验组，以等量的基酒添加作为对照组，以基础培养基作为空白对照组，共设置7组。取8小时内羽化成虫的黑腹果蝇，用适量乙醚麻醉，倒于白瓷盘上，鉴别雌雄果蝇，分别转入培养管中，每管10只果蝇，每组雌雄各3管，25℃，60%相对湿度恒温恒湿培养箱饲养，每3天更换一次培养管，每天记录各管果蝇死亡情况，最后统计果蝇寿命，计算果蝇平均寿命、最高寿命和半数死亡时间。
2.2.3. 不同剂量蝉花虫草酒对果蝇SOD活性及MDA含量的影响
果蝇2%组织匀浆的制备：以2.2.2分组再次取8小时内羽化成虫的果蝇饲养28天，随后将果蝇转移至空管内禁食24小时，−15℃低温麻醉，精确称量各组果蝇的质量(精确到0.001 g)，按比例用0.9%浓度的生理盐水于冰水浴将果蝇制成2% (w/V)的果蝇组织匀浆，转移入离心管中以4000转/分钟速度离心10 min，取上清液4℃保存备用。
按试剂盒说明书分别测定匀浆中可溶性蛋白含量、SOD酶活性和MDA含量。
2.2.4. 数据统计分析
实验数据使用Excel软件进行统计和处理，实验结果用“平均值 ± 标准差”表示。实验结果使用SPSS Statistics17.0软件进行显著性分析。
3. 结果与分析
3.1. 蝉花虫草酒对果蝇寿命的影响
按2.2.2分组，将不同剂量蝉花虫草酒和基酒添加到果蝇培养基中，考察其对雌雄果蝇寿命的影响。实验结果如表1和表2所示。
Table 1. The effect of Cordyceps chanhua wine on the lifespan of male Drosophila melanogaster
表1. 蝉花虫草酒对雄果蝇寿命的影响
注：表中a、b、c后标字母不同表示组间具有显著性差异(P < 0.05)。
从表1结果可以发现，基酒组对雄果蝇寿命具有负面作用，1.0%基酒组对雄果蝇平均寿命和半数死亡时间的影响最大，0.2%基酒组对最高寿命影响最大。而中、高剂量蝉花酒对雄果蝇寿命有正面作用，其中1.0%蝉花酒组对比等量基酒组，显著提高了雄果蝇的平均寿命和半数死亡时间(P < 0.05)。在最高寿命方面，各组对果蝇的影响有限，组间差异不显著。与空白对照组比较，各组均无显著差异。
Table 2. The effect of Cordyceps chanhua wine on the lifespan of female Drosophila melanogaster
表2. 蝉花虫草酒对雌果蝇寿命的影响
注：表中a、b后标字母不同表示组间具有显著性差异(P < 0.05)。
从表2来看，与雄果蝇结果类似，培养基加入基酒对雌果蝇也有负面作用，对平均寿命的影响最大，对半数死亡时间和最高寿命影响小。而各剂量蝉花酒组对比等量基酒组，均能提高雌果蝇平均寿命、半数死亡时间。其中，1.0%蝉花酒组对比1.0%基酒组，显著提高了雌果蝇平均寿命和最高寿命(P < 0.0.5)，对半数死亡时间的提升也很大。与空白对照组相比，仅1.0%剂量蝉花酒组对雌果蝇最高寿命有显著影响。
综合上述两表的实验结果可以得出，对比基酒，蝉花虫草酒对果蝇寿命有提升作用，且无论雌雄，1.0%剂量的作用均为最好。当蝉花酒添加量为5.0%时，雄果蝇寿命也有较大提升，但对雌果蝇寿命影响很小，不及雄果蝇。
3.2. 蝉花虫草酒对果蝇SOD活性和MDA含量的影响
按2.2.3方法饲养果蝇并制备果蝇匀浆，参考试剂盒说明书操作步骤测定果蝇组织匀浆的SOD活力和MDA含量。测定结果如表3及表4所示。
从表3结果来看，基酒组对雌雄果蝇的SOD活力均有负面作用，且1.0%剂量组负面作用最大。而与基酒组相比较，蝉花酒组均能一定程度上提高雌雄果蝇SOD活力。其中，1.0%和5.0%剂量蝉花虫草酒组对比等剂量基酒组，对雄果蝇SOD活力有显著提升(P < 0.05)，0.2%和1.0%剂量蝉花虫草酒组对比等剂量基酒组对雌果蝇SOD活力有显著提升(P < 0.05)。与空白对照组相比较，1.0%基酒组对雌果蝇SOD活力有显著降低(P < 0.05)，其余不显著。
Table 3. The effect of Cordyceps chanhua wine on SOD activity of Drosophila melanogaster
表3. 蝉花虫草酒对果蝇SOD活力的影响
注：表中a、b、c后标字母不同表示组间具有显著性差异(P < 0.05)。
Table 4. The effect of Cordyceps chanhua wine on MDA content of Drosophila melanogaster
表4. 蝉花虫草酒对果蝇MDA含量的影响
注：表中a、b、c、d后标字母不同表示组间具有显著性差异(P < 0.05)。
从表4结果来看，1.0%和5.0%基酒组显著升高了雄果蝇MDA含量(P < 0.05)，1.0%和5.0%蝉花酒组比相应基酒组对雌雄果蝇MDA含量有显著降低(P < 0.05)。与空白对照组相比，5.0%蝉花酒组显著降低了雌雄果蝇MDA含量，1.0%蝉花酒组对雄果蝇MDA含量降低显著(P < 0.05)，对雌果蝇效果不显著。
对于雄果蝇，1.0%，5.0%基酒组比空白对照组MDA含量有显著提升，但在雌果蝇上无显著性。说明相比于雌果蝇，基酒对雄果蝇的副作用较大，且基酒加入越多，MDA含量越高。
综合表3和表4的结果来看，各基酒组对雌雄果蝇SOD活力和MDA含量均有负面作用，而蝉花酒组对该两项指标均有正面作用，其中1.0%蝉花虫草酒组综合效果最优，其次是5.0%剂量组。
4. 结论与讨论
蝉花的活性成分与冬虫夏草相似，具备丰富的生理功效和药用价值 [24] 。研究发现蝉花子实体，蝉花孢子粉及蝉花多糖均能显著提高果蝇平均寿命，提高果蝇体内SOD活力并降低MDA含量 [8] [25] [26] 。
氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化作用，会形成丙二醛(MDA)等脂质过氧化物 [27] 。而超氧化物歧化酶(SOD)能清除超氧阴离子自由基(
)，保护细胞免受损伤 [28] 。果蝇体内SOD活力在进入老龄期后下降，MDA含量则随日龄增加而增加，当SOD活力和MDA含量开始反向变化，果蝇存活率显著降低 [29] 。因此提高SOD活力，降低MDA含量能延缓果蝇衰老。测定果蝇SOD活力与MDA含量，前者能反应机体清除氧自由基的能力，后者能反应细胞受氧自由基攻击的损伤情况 [30] ，以此来表明样品对果蝇的抗氧化作用，许多研究结果证实，当果蝇SOD活力越高，MDA含量越低，则果蝇平均寿命越高，说明样品抗氧化作用越好 [23] [26] 。果蝇是一种世代周期短、繁殖速度快、数量多的优秀的模式动物，本研究采用w1118野生型黑腹果蝇作为实验动物，研究了蝉花虫草酒不同添加量对果蝇寿命的影响，并以超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量为指标探究了其抗氧化活性。
果蝇寿命实验结果显示，与基酒组相比，1.0%添加量的蝉花虫草酒显著提高了雌雄果蝇的平均寿命(P < 0.05)，显著提高了雄果蝇的半数死亡时间以及雌果蝇的最高寿命。表明蝉花虫草酒具有延长果蝇寿命的作用，且蝉花虫草酒的添加量为1.0%时延寿效果显著。
同时，SOD酶活力和MDA含量测定结果显示，与相应基酒组比较，1.0%添加量的蝉花虫草酒显著提高了雌雄果蝇体内SOD活力(P < 0.05)，1.0%和5.0%添加量的蝉花虫草酒显著降低了雌雄果蝇MDA含量(P < 0.05)。这表明蝉花虫草酒对雌雄果蝇均表现出抗氧化作用，添加量为1.0%时效果更好。
综合果蝇寿命和抗氧化结果，发现培养基添加基酒对果蝇寿命及抗氧化有负面影响，而蝉花虫草酒则有正面作用，其中1.0%的蝉花酒对雌雄果蝇的延寿和抗氧化作用最好，这说明蝉花中的有效成分溶解在了酒中，抵消了酒体本身对果蝇的负面影响，其抗衰老抗氧化的有效成分可能为虫草多糖和核苷类化合物 [25] [26] [31] 。
NOTES
*通讯作者。