1. 引言
埃博拉病毒病(Ebola virus disease, EVD)也称为埃博拉出血热(Ebola haemorrhagic fever, EHF)，是由丝状病毒科埃博拉病毒属的埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)引起人和非人灵长类动物(如猩猩和猴子)发生急性感染的一种人兽共患传染病。EVD的临床症状主要有发热、出血、腹泻以及多脏器损害，因其具有较高的传染性和致死率(50%~90%) [1] [2] ，世界卫生组织分别将2014年西非埃博拉疫情和2019年刚果(金)埃博拉疫情列为“国际关注的突发公共卫生事件” [3] [4] 。
EVD导致的发热、头痛以及身体虚弱等早期症状，并不是感染埃博拉病毒所特有的症状，这些症状与非洲当地频发的疟疾、伤寒等疫病的症状相似，因此EVD的早期临床诊断非常困难 [5] [6] 。对于疑似EVD的急性患者，首选的诊断方法是对血液样本中埃博拉病毒单个或多个基因进行基因扩增检测，实时荧光定量PCR方法因其具有操作简便、反应快速、灵敏度和特异性高等特点而被广泛应用于各类病原的实验室检测中，在进行实时荧光PCR实验时均会设置阳性对照和阴性对照来保证结果的可靠性，其中阳性对照是核酸检测过程中监控核酸提取过程和判断扩增反应有效性的重要参考物质，而目前大多数PCR方法检测中常用含有目的基因的质粒作为阳性对照，重组质粒的使用极容易在操作过程中引起气溶胶污染，造成假阳性结果的出现 [7] 。另外，针对RNA病毒的检测，需在PCR基础上增加逆转录过程，即需先将病毒RNA逆转录为cDNA后再进行扩增，因此样本病毒RNA的提取率和逆转录过程会对最终的扩增结果准确性产生直接影响。因此，针对RNA病毒开展RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测时，为了准确评价检测结果的准确性，设置既能监控核酸制备过程，又能参与核酸扩增过程的阳性对照是较为科学的。
本研究利用分子生物学技术针对埃博拉病毒构建了包含其GP基因的假病毒粒子，并建立了实时荧光RT-PCR检测方法。EBOV GP基因假病毒粒子是一种嵌合型病毒颗粒，既保证了生物安全性、稳定性，又能够最大限度的模拟真实病毒的物理结构，可以实现RT-PCR检测的全流程质量控制。建立的GP基因实时荧光RT-PCR方法具有良好的敏感性和特异性，对临床样本的初步检测应用结果证明该方法可为埃博拉病毒病的防控提供技术支撑。
2. 材料与方法
2.1. 主要试剂
pGWLV-pseudovirus载体购自金唯智生物科技有限公司提供；DH5α感受态细胞为本实验保存；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、AMV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs购自宝日医生物技术(北京)有限公司；AccurSTART U+ One Step RT-qPCR Probe Kit (FOR FAST)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；质粒大量制备试剂盒(去内毒素)购自Merck公司；293T细胞购自中科院细胞库；DMEM、MEM、FBS、D-PBS购自Gibco公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGEN公司。
2.2. 引物设计
根据GenBank中埃博拉病毒序列(登录号：KJ660346.2)，委托苏州金唯智生物科技有限公司合GP基因全长序列并克隆至pUC57载体中，针对该基因保守区域设计并合成PCR鉴定引物GPF/GPR，扩增片段长度为396 bp，用于载体构建时的阳性克隆筛选和鉴定，同时设计并合成一套实时荧光RT-PCR的引物和探针，用于检测方法的建立，详细序列信息见表1。
2.3. pGWLV-pseudovirus-GP重组载体构建
将人工合成的GP基因克隆至pGWLV-pseudovirus，转化DH5α感受态细胞，抗性筛选后挑取单菌落摇菌培养后，采用PCR、酶切进行鉴定后，再进行测序确认。
2.4. 无内毒素质粒大量制备
将pGWLV-pseudovirus-GP重组质粒阳性克隆菌扩大培养后，提取质粒，测定质粒浓度，及时转染或保存于−20℃备用。
2.5. 假病毒的制备与鉴定
取对数生长期的293T细胞，提前1 d接种至6孔板，观察细胞密度(%汇合度)达到60%~80%时按照假病毒包装系统进行细胞转染；转然后每天观察细胞状态，于48 h后收集培养液，反复冻融3次裂解细胞，离心去除细胞碎片，进行除菌、浓缩后取50 μL培养液提取病毒RNA，通过PCR检测反转录产物来验证假病毒构建结果。
2.6. 假病毒颗粒拷贝数测定
使用假病毒载体标准品(103拷贝数/μL-1010拷贝数/μL)，构建标准曲线。取一定体积的假病毒培养液提取核酸后逆转录为cDNA后，使用定量荧光PCR方法对假病毒颗粒拷贝数进行定值。
2.7. 实时荧光RT-PCR检测方法的建立及应用
2.7.1. 实时荧光RT-PCR反应体系及条件的优化
根据一步法实时荧光RT-PCR反应试剂，采用20 μL体系，依次加入5 × One Step U+ Mix 4 μL、One Step U+ Enzyme Mix、探针(10 μmol/L) 0.2 μL，上、下游引物(10 μmol)各0.4 μL，RNA模板1 pg~1 μg，用RNase-free H2O补足至20 μL。反应程序：逆转录55℃ 15 min；95℃预变性30 s，扩增阶段(95℃变性10 s，60℃退火30 s)，扩增设置40个循环，每个循环结束后进行荧光信号的采集。
2.7.2. 实时荧光RT-PCR敏感性评价
将1.7中定值的假病毒进行十倍倍比稀释后进行实时荧光RT-PCR检测，评价方法的敏感性。
2.7.3. 实时荧光RT-PCR特异性评价
方法特异性通过检测实验室保存的猴D型逆转录病毒(SRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和伪狂犬病病毒(PRV)四种病原核酸来进行评价。
2.7.4. 临床应用
采用建立的实时荧光RT-PCR方法对实验室收集保存的30份猴血清和20份小鼠血清进行埃博拉病毒核酸检测，通过在临床样品中添加适量GP基因假病毒颗粒制备5份阳性模拟样品进行检测。
Table 1. Primer sequence used in this study
表1. 本研究中所用引物序列
3. 结果
3.1. pGWLV-GP质粒的构建和鉴定
将人工合成的GP基因克隆至pGWLV载体，转化DH5α感受态细胞，抗性筛选后挑取单菌落摇菌培养后，提取质粒采用PCR、酶切进行鉴定后，鉴定结果见图1和图2，双酶切得到的DNA片段大小与预期相符，PCR扩增片段长度与靶基因大小一致，说明成果构建了pGWLV-GP重组质粒。
Figure 1. Digestion identification of pGWLV-NP recombinant
图1. pGWLV-GP重组质粒的酶切鉴定
Figure 2. PCR identification of pGWLV-GP recombinant plasmid GP gene
图2. pGWLV-GP重组质粒GP基因PCR鉴定
3.2. GP基因假病毒的鉴定
取转染后的细胞培养液，提取病毒RNA后逆转录为cDNA，测定cDNA拷贝数，进行10倍系列稀释后采用PCR方法进行检测，结果显示，在假病毒cDNA稀释至109~102 copies/μL，采用GP基因PCR鉴定引物均能扩增出单一、片段大小正确的条带，结果见图3，说明成功制备内含GP基因的假病毒粒子。
Figure 3. Identification of GP gene by pseudovirus RT-PCR
图3. 假病毒RT-PCR鉴定GP基因
3.3. 假病毒颗粒拷贝数的检测
取50 μL病毒原液提取病毒RNA，使用21 μL无菌水洗脱，取7 μL进行逆转录，逆转录反应体积为20 μL，后稀释5倍至100 μL，通过定量PCR检测逆转录产物CT值为20.83，拷贝指数为5.98，根据标曲(见图4)计算病毒颗粒数。每mL病毒颗粒拷贝数 = 10指数 × 100 (逆转录产物总体积100 μL) × 3 (基因组产物洗脱体积为21，取7 μL进行逆转录) × 20 (病毒液提取基因组体积为50 μL)/2(病毒基因组为双拷贝)，计算获得假病毒颗粒拷贝数为：2.88E+09个/mL。
Figure 4. Standard and amplification curve
图4. 标准品及样本扩增曲线
3.4. 实时荧光RT-PCR敏感性结果
将已知拷贝数的假病毒病毒液进行倍比稀释(10倍梯度稀释成9个浓度)，对2.88 × 107~2.88 × 10−1拷贝/μL的稀释样品进行荧光RT-PCR检测，结果见图5，本试验建立的埃博拉病毒实时荧光RT-PCR方法最低能检测到2.88 × 101拷贝/μL。
Figure 5. Sensitivity result of Real-time RT-PCR
图5. 实时荧光RT-PCR敏感性结果
3.5. 实时荧光RT-PCR特异性结果
采用建立的实时荧光RT-PCR方法对SRV、PRRSV、CSFV、PRV进行检测，均没有出现特异性扩增，证明该方法具有良好的特异性。
3.6. 临床应用结果
采用建立的实时荧光RT-PCR方法对50份临床血清进行埃博拉病毒核酸检测，检测结果见图6，5份模拟阳性样品均检出，其余样本检测结果均为阴性，说明建立的埃博拉实时荧光RT-PCR方法具有良好的应用前景。
4. 讨论
埃博拉病毒病(Ebola virus disease, EVD)是一种具有高病死率和显著流行潜力的烈性人畜共患传染病 [8] [9] ，埃博拉病毒病的暴发和流行，不仅会给人类健康带来严重威胁，也对社会的经济发展造成了巨大的损失。我国虽然目前还未发现埃博拉病毒的感染病例，但我国有适宜宿主生存的环境，随着我国“一带一路”战略的实施，国家间经贸往来日益频繁，因此埃博拉病毒随时都有可能传入我国，对我国人民健康和畜牧业发展的威胁日益加剧，及时准确的实验室诊断是控制传染源、避免疫情发生和扩散的重要手段，因此针对埃博拉病毒开展检测技术相关研究是非常必要的。
假病毒是一种具有复制缺陷的嵌合型病毒，是在一种复制缺陷的病毒载体内部包被外源性核酸片段，并在病毒表面表达另外一种病毒的重组糖蛋白的嵌合型病毒粒子，同时具备生物安全性和稳定性，又能
最大限度地模拟真实病毒的物理结构 [10] [11] 。假病毒核酸质控样品，是以假病毒为载体，包含待检病原的靶标基因序列，具有真实病毒相似的物理结构，但却没有感染性，确保使用生物安全。相较其他形式的核酸质控样品，假病毒形式的质控样品可作为平行样品参与核酸检测全过程，包括核酸分离纯化、逆转录，核酸扩增及核酸定量等环节，从而实现病毒核酸检测全流程监控，确保检测结果的准确性和可靠性，因此是本研究中利用EBOV的糖蛋白GP的编码基因，该蛋白在病毒表面以三聚体形式存在，参与病毒与宿主细胞受体的结合以及病毒的进入 [12] 。由GP1和GP2片段构成，除了跨膜蛋白GP以外，病毒液中还存在可溶性的sGP和ssGP蛋白，病毒进入细胞GP蛋白介导 [13] [14] 。本研究针对埃博拉病毒成功构建了一种包含其GP基因假病毒核酸质控样品，并且针对该基因建立了实时荧光RT-PCR检测方法，具有较好的灵敏度和特异性，初步应用于临床样本的检测结果显示方法能够检测出模拟阳性样品。研究成果对于目前我国面对的埃博拉病毒防控形势而言具有较好的应用前景，有望在相关口岸实验室推广应用。
基金项目
海关总署“揭榜挂帅”科研项目(项目编号：2023HK005)。
NOTES
*通讯作者。