1. 引言
土壤盐度被认为是限制粮食产量的主要因素之一，全球约20%的可耕地面积受到盐胁迫的影响，且这一比例还在快速上升 [1] 。盐胁迫会对水稻生长发育产生影响，如种子萌发、光合作用、呼吸作用及能量代谢、蛋白质的合成等 [2] 。水稻是我国第一大粮食作物，约占粮食总产量的40%，全国有60%以上的人口以大米为主食，水稻产量与国家粮食安全问题密切相关。
硒是环境中一种重要的生命元素，为动植物必需的营养元素，是动植物和人体谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的组成成分。在逆境胁迫下，硒可以稳定膜结构，调节生物大分子合成，提高抗氧化酶活性，清除活性氧，对提高植物逆境下的抗性起重要作用 [3] 。当外源施用亚硒酸盐浓度超过植物耐受性的阈值时，不仅无法起到缓解作用，还会对植物造成进一步的胁迫损伤 [4] [5] 。研究发现，草莓在60 mg/L浓度亚硒酸盐处理下，虽然各类酶的含量均有所提高，但总体低于30 mg/L浓度下的处理结果，这可能是由于过量的硒会导致植物中毒，进而影响植物生理机能，并在一定程度上对酶的活性产生抑制作用造成的 [6] 。因此，就植物而言，只有施加合适浓度的亚硒酸盐才是有益的，从而提高植物的抗盐胁迫能力。
本研究通过水培试验，采用氯化钠胁迫处理模拟盐胁迫，施加不同浓度亚硒酸盐对水稻进行培养七天，进行测定水稻的苗长、谷胱甘肽含量、过氧化氢含量和抗氧化酶基因表达水平，进而加以分析，揭示不同浓度亚硒酸盐对水稻幼苗的影响，为采用氯化钠模拟盐胁迫研究水稻的抗盐分子机制提供理论参考。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
供试材料为日本晴水稻和转基因水稻(过表达SAC蛋白)，用氯化钠模拟盐胁迫。
2.2. 试剂与仪器
试剂：氯化钠，次氯酸钠，还原型谷胱甘肽含量检测试剂盒，过氧化氢含量检测试剂盒，柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒，生工生物工程股份有限公司；EasyQuick RT MasterMix，康为试剂公司；亚硒酸钠，Sigma-Aldrich公司。
仪器：Nano Drop 2000精密紫外分光光度计，实时荧光定量PCR仪，恒温培养箱，Thermo Fisher Scientific；pH计，上海精密科学仪器公司；Milli-Q超纯水仪，Millipore；制冰机，日本三洋；电子分析天平，METTLER TOLEDO；光照培养箱，宁波江南仪器厂。
2.3. 实验方法
2.3.1. 材料处理
取出饱满的日本晴水稻和SHC-10水稻分别放入烧杯中，加入5% (v/v)浓度次氯酸钠50 mL，进行处理30 min，随后用ddH2O对种子进行冲洗三次，并放入37℃的培养箱中培养催芽。取出已经露白的种子放入96孔板中，分装在不同的亚硒酸盐的培养液中，培养液亚硒酸盐浓度设置为0 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L。将培养容器放置在光照培养箱中进行培养，温度设为白天28℃，时间12 h，夜晚26℃，处理时间为12 h。处理七天后收集水稻，进行后续测定。
2.3.2. 水稻苗长测量
处理7 d后，采集两个品种的幼苗，随机取30株幼苗，用直尺测量苗长，计算平均长度。
2.3.3. 谷胱甘肽含量测定
(1) 组织处理：新鲜组织首先用PBS冲洗2次，然后称取水稻组织0.1 g，加入用试剂一润洗过的匀浆器中(匀浆器提前放冰上预冷)；然后加入1 mL试剂一(组织/试剂一比例保持不变即可)，迅速冰上充分研磨(使用液氮研磨效果更好)；8000 g 4℃离心10 min；取上清液放置于4℃待测。
(2) 酶标仪预热30 min以上，调节波长至412 nm，蒸馏水调零。
(3) 试剂二放置在25℃水浴中保温30 min。
(4) 标准液稀释：用蒸馏水稀释10 mg/mL的标准溶液至浓度为300 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL。
(5) 按操作表依次加入各试剂，详细信息如表1。
Table 1. Glutathione content measurement table
表1. 谷胱甘肽含量测定操作表
注：混匀后静置2 min检测412 nm处吸光值，记为A测定管、A标准管、A空白管，计算ΔA测定= A测定管 − A空白管，ΔA标准 = A标准管 − A空白管。
(6) 标准曲线的建立：以ΔA标准为x轴，标准液浓度为y轴，根据吸光度(x)和浓度(y, µg/mL)做出标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定带入公式中(x)，计算出样品浓度y (µg/mL)。
(7) 计算公式：GSH (µg/g质量) = y × V样 ÷ (V样 ÷ V样总 × W) = y ÷ W
2.3.4. 过氧化氢含量测定
(1) 组织样品的制备：称取约0.1 g水稻组织，加入1 mL试剂一进行冰浴匀浆；8000 g 4℃离心10 min，取上清，置冰上待测。
(2) 酶标仪预热30 min以上，调节波长至415 nm，蒸馏水调零。
(3) 将试剂二、三和四25℃水浴10 min以上。
(4) 用丙酮将1 mmol/mL标准液稀释2 μmol/mL的标准溶液。
(5) 按操作表依次加入各试剂，详细信息如表2。
Table 2. Hydrogen peroxide content measurement table
表2. 过氧化氢含量测定操作表
注：加入试剂三后，4000 g，常温离心10 min，弃上清，留沉淀。加入试剂四溶解沉淀，室温静置5 min，取200 μL转移至96孔板中测定415 nm处吸光值(空白管只要做1~2次即可)。计算ΔA测定 = A测定管 − A空白管，ΔA标准 = A标准管 − A空白管。
(6) 计算公式：
H2O2含量(μmol/g质量) = ∆A测定 ÷ (∆A标准 ÷ C标液) × V样本 ÷ (V样本 ÷ V提取 × W) = 2 × ∆A测定 ÷ ∆A标准 ÷ W。
2.3.5. 抗氧化酶相关基因表达水平的测定
(1) 水稻植株总RNA提取和反转录
采用柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒提取水稻植株总RNA，得到RNA溶液，测定OD值以检测所提RNA质量。
按照EasyQuick RT MasterMix的操作说明书，完成反转录，并稀释合适倍数，于−20℃保存，用于后续荧光定量PCR。
(2) 引物设计
Table 3. Antioxidant enzyme gene primer sequences
表3. 抗氧化酶基因引物序列
从NCBI数据库中下载相关基因序列，GanBank编号具体如下：过氧化氢酶A基因CATA，过氧化物酶1基因POX1，质体铜/锌超氧化物歧化酶基因plastidic Cu/Zn-SOD，抗坏血酸过氧化物酶基因APX，谷胱甘肽还原酶基因GR，内参基因，肌动蛋白基因。采用NCBI网站设计相关引物，详细信息如表3。
(3) 逆转录聚合酶链反应
选择水稻肌动蛋白基因Actin150为内参基因，进行荧光定量PCR，体系如表4所示每个反应做三个复孔，重复三次实验。使用Applied Biosystems QuantStudio 1PCR仪进行实验，反应结束后进行熔解曲线分析，导出相关数据，并采用Graphpad Prism进行作图分析。
Table 4. Real-time fluorescence quantitative PCR reaction system
表4. 实时荧光定量PCR反应体系
在实时荧光定量PCR仪上按照如下反应程序进行反应：
50℃ 2 min
95℃ 10 min
95℃ 15 s 40个循环
60℃ 1 min
结束扩增后，分析熔解曲线，观察溶解曲线是否为为单一峰，采用2-ΔΔCT法分析实验结果。
2.4. 数据分析
Tip与SHC分别表示日本晴水稻和转基因水稻。图表中数据用平均值±标准差表示，用Dunnett法进行差异显著性检验(n.s.: not significant; *p < 0.05; **p < 0.01, ***p < 0.001; ****p < 0.0001)，用绘图软件GraphPad 8进行作图。
3. 结果与分析
3.1. 不同浓度亚硒酸盐处理对水稻苗长的影响
由图1(a)可知，Nip水稻胚芽长度随着亚硒酸盐浓度的升高呈现先上升后下降的趋势，且在亚硒酸盐浓度为1 mg/L时，长度最长。由图1(b)可知，SHC水稻也呈现先上升后下降的趋势，在亚硒酸盐浓度为1 mg/L时，长度最长，1、1.5、2 mg/L处理没有显著性差异。
(a) (b)
Figure 1. Effects of different concentrations of selenite on seedling length in rice. (a) Nipponbare Nip; (b) Transgenic rice SHC
图1. 不同浓度亚硒酸盐对水稻苗长的影响。(a) 日本晴水稻Nip；(b) 转基因水稻SHC
3.2. 不同浓度亚硒酸盐对水稻谷胱甘肽含量的影响
由图2(a)可知，Nip水稻不同处理组谷胱甘肽(GSH)含量均小于对照组，由图2(b)可知，SHC水稻不同处理组之间有先上升后下降的趋势，在1 mg/L处理时含量最高，且有显著性差异(p < 0.05)。
(a) (b)
Figure 2. Effect of different concentrations of selenite on glutathione content in rice. (a) Nipponbare Nip; (b) Transgenic rice SHC
图2. 不同浓度亚硒酸盐对水稻谷胱甘肽含量的影响。(a) 日本晴水稻Nip；(b) 转基因水稻SHC
3.3. 不同浓度亚硒酸盐对水稻过氧化氢含量的影响
活性氧导致氧化应激并破坏植物的各种细胞结构，活性氧的产生也是硒毒性的原因，我们注意到水稻中ROS的生成与Se (IV)浓度有关。它们引起活性氧含量的增加，从而导致细胞膜的氧化损伤。如图3(a)所示，Nip水稻受高浓度硒的胁迫比较敏感，相比于对照组，0.5、1、1.5、2 mg/L处理组过氧化氢含量分别增加5%、33.7%、42.5%、18.1%。而SHC水稻不同处理组过氧化氢含量增加9.6%、0.4%、6%，如图3(b)所示。
(a) (b)
Figure 3. Effect of different concentrations of selenite on hydrogen peroxide content in rice. (a) Nipponbare Nip; (b) Transgenic rice SHC
图3. 不同浓度亚硒酸盐对水稻过氧化氢含量的影响。(a) 日本晴水稻Nip；(b) 转基因水稻SHC
3.4. 不同浓度亚硒酸盐对水稻抗氧化酶基因表达水平的影响
3.4.1. 超氧化物歧化酶基因的表达水平分析
如图4(a)所示，Nip水稻经过不同浓度亚硒酸盐处理后，呈现先上升后下降的趋势，在0.5 mg/L处理下与对照组相比具有显著性差异(p < 0.0001)。1，1.5，2 mg/L亚硒酸盐处理的超氧化物歧化酶(SOD)基因相对表达量均比对照组提高。如图4(b)所示，SHC水稻经过不同浓度亚硒酸盐处理后，也呈现先上升后下降的趋势，在1.5 mg/L处理后相对表达量最高，且与对照组相比具有显著性差异(p < 0.001)，0.5，1，2 mg/L亚硒酸盐处理的SOD酶基因相对表达量分别比对照组提高。
(a) (b)
Figure 4. Expression level analysis of superoxide dismutase gene. (a) Nipponbare Nip; (b) Transgenic rice SHC
图4. 超氧化物歧化酶基因的表达水平分析。(a) 日本晴水稻Nip；(b) 转基因水稻SHC
3.4.2. 过氧化物酶基因的表达水平分析
如图5(a)所示，Nip水稻随着亚硒酸盐浓度的增加，过氧化物酶(POD)基因相对表达量先升后降，在2 mg/L时升高，浓度为1 mg/L时基因相对表达量最高，0.5、1 mg/L亚硒酸盐处理均极显著地提高了POD酶基因相对表达量(p < 0.0001)。可见，1 mg/L亚硒酸盐能最有效地提高非转基因水稻POD酶基因相对表达量。
如图5(b)所示，SHC水稻随着亚硒酸盐浓度的增加，POD酶基因相对表达量先升后降，浓度为1.5 mg/L时基因相对表达量最高，极显著地提高了POD酶基因相对表达量(p < 0.0001)，其他处理组相比于对照组表达量均提高。可见，1.5 mg/L亚硒酸盐能最有效地提高POD酶基因相对表达量。
(a) (b)
Figure 5. Expression level analysis of peroxidase. (a) Nipponbare Nip; (b) Transgenic rice SHC
图5. 过氧化物酶基因的表达水平分析。(a) 日本晴水稻Nip；(b) 转基因水稻SHC
3.4.3. 过氧化氢酶基因的表达水平分析
如图6(a)所示，Nip水稻过氧化氢基因(CAT)的表达水平呈现先升高后降低趋势，在2 mg/L时升高。在处理浓度为1 mg/L时，体内的CAT表达水平最高。如图6(b)所示，SHC水稻CAT逐渐升高呈现先升高后降低的趋势，在1.5 mg/L时，体内的过氧化氢基因的表达水平最高。说明用1、1.5、2 mg/L的Se处理对SHC水稻的CAT活性有明显的促进作用，可降低活性氧的危害，缓解盐胁迫对水稻生长的抑制作用。
(a) (b)
Figure 6. Expression level analysis of catalase. (a) Nipponbare Nip; (b) Transgenic rice SHC
图6. 过氧化氢酶基因的表达水平分析。(a) 日本晴水稻Nip；(b) 转基因水稻SHC
3.4.4. 抗坏血酸过氧化物酶基因的表达水平分析
在盐胁迫条件下，Nip水稻以1 mg/L和2 mg/L 2个处理浓度的抗坏血酸过氧化物酶(CAT)基因表达水平显著高于对照组，分别提高了13.1%、54.3%，见图7(a)。SHC水稻CAT表达量逐渐升高呈现先升高后降低的趋势，以1.5 mg/L亚硒酸盐浓度处理的CAT表达量最大，提高了47%，见图7(b)。
(a) (b)
Figure 7. Analysis of the expression level of ascorbate peroxidase gene. (a) Nipponbare Nip; (b) Transgenic rice SHC
图7. 抗坏血酸过氧化物酶基因的表达水平分析。(a) 日本晴水稻Nip；(b) 转基因水稻SHC
3.4.5. 谷胱甘肽还原酶基因的表达水平分析
Nip水稻的谷胱甘肽还原酶(GR)基因随着亚硒酸盐浓度的增加表达量逐渐上升，在2 mg/L时最高，相比于对照增加109.7%，见图8(a)。SHC水稻GR表达量逐渐升高呈现先升高后降低的趋势，在1.5 mg/L最高，相比于对照增加110.4%，见图8(b)。
(a) (b)
Figure 8. Analysis of the expression level of glutathione reductase gene. (a) Nipponbare Nip; (b) Transgenic rice SHC
图8. 谷胱甘肽还原酶基因的表达水平分析。(a) 日本晴水稻；(b) 转基因水稻SHC
4. 讨论与结论
本研究结果表明，当水稻经过不同水平亚硒酸盐处理后，水稻对盐胁迫的承受能力受到了影响。适宜浓度的亚硒酸盐使盐胁迫下水稻的苗高有一定的提高，减少体内过氧化氢含量，增加谷胱甘肽含量，对SOD、POD、CAT、APX、GR的基因表达具有明显的促进作用，提高水稻抗氧化能力。特别是SHC水稻，当硒浓度达到1.5 mg/L时促进作用最大，但浓度过大则抑制水稻的生长。这表明用Se处理可通过提高逆境胁迫下水稻体内抗氧化酶的表达来增强对活性氧的清除能力，提高抗逆性，从而缓解受到的氧化损伤，维持细胞膜结构和功能的稳定。