槟榔–草果–厚朴治疗上呼吸道感染作用机制的网络药理学研究

Study on the Mechanism of Betel Nut-Tsaoko-Magnolia Officinalis in the Treatment of Upper Respiratory Tract Infection by Network Pharmacology

摘要: 目的：通过网络药理学探究槟榔–草果–厚朴治疗上呼吸道感染的潜在作用机制。方法：从TCMSP、BATMAN-TCM和Swiss Target Prediction数据库中搜集活性成分和作用靶点，从Gene Cards数据库中搜集上呼吸道感染相关靶点。通过Venny2.1.0平台得到两者的共同靶点，并通过STRING11.0数据库和Cytoscape3.7.1构建PPI。用Cytoscape3.7.1筛选主要活性成分和核心靶点，再用Metascape数据库和CB-Dock数据库完成富集分析和分子对接，最后用微生信进行可视化处理。结果：共得到16个活性成分和190个共同靶点，根据Degree值，Quercetin、Procyanidin B1、Daucosterol_qt、Eucalyptol、Neohesperidin等10个为主要活性成分和TNF、MMP-9、STAT3、AKT1、TGFB1、PTGS2等10个为核心靶点；富集分析提示药物可能通过影响多生物过程、细胞组分及分子功能，及PI3K-AKT信号通路、松弛素信号通路、NF-κB信号通路、cAMP信号通路、FoxO信号通路等发挥作用；分子对接显示主要活性成分与核心靶点具有结合性，且大部分结合性强烈。结论：槟榔–草果–厚朴治疗上呼吸道感染的潜在作用机制涉及抗病毒、抗炎和增强免疫力三方面。

Abstract: Objective: To explore the potential mechanism of Areca catechu-Amomumtsaoko-Magnolia officinalis in the treatment of upper respiratory tract infection through network pharmacology. Methods: The active components and targets of drugs were collected from TCMSP, BATMAN-TCM and SwissTargetPrediction databases, and the targets related to upper respiratory tract infection were collected from GeneCards database. Through Venny2.1.0 platform, the common targets of the two are obtained, and PPI is constructed through STRING11.0 database and Cytoscape 3.7.1. The main active components and core targets were screened by Cytoscape 3.7.1, and then the enrichment analysis and molecular docking were completed by Metascape database and CB-Dock database, and finally the visualization was carried out by micro-signal. Results: A total of 16 active components and 190 common targets were obtained. According to the Degree value, 10 active components such as Quercetin, Procyanidin B1, Daucosterol_qt, Eucalyptol and Neohesperidin were the main active components and 10 core targets such as TNF, MMP-9, STAT3, AKT1, TGFB1 and PTGS2. Enrichment analysis suggests that drugs may play a role by affecting multi-biological processes, cell components and molecular functions, PI3K-AKT signaling pathway, relaxin signaling pathway, NF-κB signaling pathway, cAMP signaling pathway and FoxO signaling pathway. Molecular docking shows that the main active components are bound to the core targets, and most of them are strongly bound. Conclusion: The potential mechanism of Areca catechu-Amomumtsaoko-Magnolia officinalis in treating upper respiratory tract infection involves antivirus, anti-inflammation and enhancing immunity.

1. 引言

上呼吸道感染是发病率较高的呼吸系统疾病，鼻和咽喉部的症状较为常见，70%~80%的患者是由病毒感染引发，治疗上以抗病毒为主。中药在上呼吸道感染的治疗上具有较大优势 ‎[1] ，研究表明，350种传统药用植物中有63种具有抗病毒作用，涉及病毒23种，其中包括引起上呼吸道感染的呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒等 ‎[2] 。槟榔–草果–厚朴，《温疫论》中载其有“除伏邪，破戾气”的作用，其组方达原饮在现代急性突发传染病的治疗中应用广泛 ‎[3] ，据报道，其在上呼吸道感染的治疗中亦有应用，刘小燕 ‎[4] 、林霜霜等 ‎[5] 用达原饮治疗小儿上呼吸道感染疗效确切，但未见深入研究。基于此，首先通过网络药理学对槟榔–草果–厚朴治疗上呼吸道感染的作用机制做初步研究。

2. 材料与方法

2.1. 槟榔–草果–厚朴活性及作用靶点的获取

1) 进入TCMSP ‎[6] 数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)，分别以3味中药的中文名称为检索词，并设置口服利用度(Oral Bioavailability, OB) ≥ 30和药物类药性(Drug-Like Properties, DL) ≥ 0.18 ‎[7] ，筛选槟榔–草果–厚朴中较高活性的成分及作用靶点。

2) 对于未检索到作用靶点的药物活性成分，进入BATMAN-TCM ‎[8] 数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn/)，以药物名称为检索词，检索对应的作用靶点。

3) 对于未在数据库中检测到靶点的药物活性成分，以其2D结构式或Canonical SMILES式，上传Swiss Target Prediction ‎[9] 数据库中进行预测。

4) 整合检索到的活性成分及作用靶点。

2.2. 上呼吸道感染相关靶点的获取

进入Gene Cards ‎[10] 数据库(http://www.genecards.org/)，以“Upper respiratory tract infection”为关键词进行检索，若靶点过多则设定Score大于中位数的目标靶点为上呼吸道感染相关靶点。

2.3. 共同靶点的获取及PPI网络的构建

1) 将药物靶点与疾病靶点上传Venny2.1.0平台，获得共同靶点及韦恩图。

2) 将交集靶点上传至STRING11.0 ‎[11] 数据库(https://string-db.org)构建蛋白相互作用网络(Protein-Protein Interaction, PPI) ‎[12] ，将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”(>0.9)，其余设置均为默认。

3) 将所得PPI网络数据导入Cytoscape3.7.1，利用内置工具进行分析，并对其进行可视化处理。

2.4. PPI网络的拓扑分析与核心靶点获取

利用Cytoscape3.7.1中内置插件CytoHubba，对PPI网络进行核心靶点拓扑分析，得到槟榔–草果–厚朴映射到上呼吸道感染上的核心靶点。

2.5. GO及KEGG通路富集分析

将共同靶点上传Metascape ‎[13] 数据库(http://www.metascape.org/)，对其进行生物过程(Biological Process, BP)、细胞成分(Cellular Component, CC)和分子功能(Molecular Function, MF)的基因本体论GO (Gene Ontology, GO)功能和KEGG_PATHWAY的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析。

2.6. 槟榔–草果–厚朴–活性成分–上呼吸道感染靶点网络的构建

用CytoScape3.7.1构建槟榔–草果–厚朴–活性成分–上呼吸道感染靶点网络，利用内置工具分析活性成分及作用靶点的Degree值，并根据Degree值筛选核心作用靶点及发挥药效的主要活性成分。

2.7. 分子对接验证

进入RCSB PDB ‎[14] 数据库(http://www.rcsb.org/)，以Scientific Name of Source Organism为“Homo Sapiens”、Polymer Entity Type为“Protein”和Refinement Resolution (Å) ≤ 2.5为筛选条件，下载核心作用靶点蛋白的PDB格式文件。又进入Pub Chem ‎[15] 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取药物的核心活性成分的SDF格式文件。最后进入CB-Dock ‎[16] 数据库(http://clab.labshare.cn)，将受体与配体文件进行分子对接，并根据Vina Score值评价靶点与性成分的结合强度，最后将得到的数据导入微生信 ‎[17] 平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化处理。

3. 结果

3.1. 槟榔–草果–厚朴–活性成分及靶点

从TCMSP数据库、BATMAN-TCM数据库和Swiss Target Prediction数据库中，得到活性成分槟榔8个、草果7个、厚朴2个(见表1)，整合后共获得活性成分16个。得到作用靶点槟榔81个、草果238个、厚朴33个，整合后共获得靶点216个。

Table 1. Active components of areca catechu-tsaoko-magnolia officinalis

表1. 槟榔–草果–厚朴活性成分

3.2. 上呼吸道感染相关靶点

从Genecards数据库得到7515个上呼吸道感染相关靶点。

3.3. 槟榔–草果–厚朴–上呼吸道感染靶点PPI网络

通过Venny2.1.0平台和Cytoscape3.7.1，得到韦恩图(见图1)、槟榔–草果–厚朴成分–上呼吸道感染共同靶点190个和槟榔–草果–厚朴成分–上呼吸道感染靶点PPI网络(见图2)，图中节点颜色根据Degree值，由小到大，按照蓝黄红的顺序进行设定，Degree值越大颜色越红。

Figure 1. Wayne diagram of areca catechu-tsaoko-magnolia officinalis-upper respiratory tract infection target

图1. 槟榔–草果–厚朴–上呼吸道感染靶点韦恩图

Figure 2. Areca catechu-Tsaoko-Magnolia Officinalis-PPI network of upper respiratory tract infection target

图2. 槟榔–草果–厚朴–上呼吸道感染靶点PPI网络

3.4. 槟榔–草果–厚朴治疗上呼吸道感染的核心靶点

Table 2. Core Target Information

表2. 核心靶点信息

通过Cytoscape3.7.1内置插件CytoHubba插件，以最大集团中心度(Maximal Clique Centrality, MCC)为标准，筛选出排序居前10位的槟榔–草果–厚朴治疗上呼吸道感染的核心靶点，即TNF、IL-6、MMP-9、CASP3、STAT3、AKT1、TGFB1、HIF-1α、IL-1β和PTGS2，核心靶点信息见表2，核心靶点网络见图3。

Figure 3. Core Target Network

图3. 核心靶点网络

3.5. GO和KEGG富集分析结果

通过Metascape数据库的GO富集分析，得到槟榔–草果–厚朴190个作用靶点的GO富集分析结果120条，各选择其前20条进行展示(见图4、图5和图6)，涉及对细菌来源分子的反应、对细胞外刺激的反应和炎症反应的调节作用等生物过程；涉及膜筏、突触前膜和细胞器外膜等细胞成分；涉及DNA结合转录因子结合、蛋白激酶结合和蛋白质结构域特异性结合等分子功能。

得到KEGG富集分析结果40条，选其前20条进行展示(见图7)，其中涉及PI3K-AKT、松弛素、NF-κB、cAMP、FoxO等信号通路。

Figure 4. GO analysis of common targets-BP

图4. 共同靶点的GO分析-BP

Figure 5. GO analysis of common targets-CC

图5. 共同靶点的GO分析-CC

Figure 6. GO analysis of common targets-MF

图6. 共同靶点的GO分析-MF

Figure 7. KEGG analysis of common targets

图7. 共同靶点的KEGG分析

3.6. 槟榔–草果–厚朴–活性成分–上呼吸道感染靶点网络

通过CytoScape3.7.1构建出槟榔–草果–厚朴–活性成分–上呼吸道感染靶点网络(见图8)，该网络图中共有187个节点和34,782条连线，图中节点颜色根据Degree值，由小到大，按照黄红深红的顺序进行设定，Degree值越大颜色越深红。由于活性成分数量较多，故按Degree值进行降序排列，取排名前10的活性成分作为主要活性成分(见表3)。

Figure 8. Areca catechu-Amomumtsaoko-Magnolia officinalis-active ingredient-upper respiratory tract infection target network

图8. 槟榔–草果–厚朴–活性成分–上呼吸道感染靶点网络

Table 3. Main Active Components of Areca catechu-Tsaoko-Magnolia Officinalis

表3. 槟榔–草果–厚朴主要活性成分

3.7. 分子对接验证结果

通过CB-Dock数据库得到分子对接结果(见图9)，通常认为结合能低于−4.25 kcal/mol，主要活性成分与核心靶点具有结合性，低于−5.0 kcal/mol，具有良好的结合性，小于−7.0kcal/mol，具有强烈的结合性 ‎[18] ，结果表明槟榔–草果–厚朴的主要活性成分与治疗上呼吸道感染的核心靶点具有结合性，且大部分结合性强烈。

Figure 9. Thermogram of docking between main active components and core target molecules

图9. 主要活性成分与核心靶点分子对接热图

4. 讨论

上呼吸道感染多由病毒如鼻病毒、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒等引起，细菌感染常继发于病毒感染之后，以甲型溶血性链球菌为最常见，其次为流感嗜血杆菌等 ‎[19] 。上呼吸道感染时，外周血中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8等炎性因子高表达，CD4+、CD8+等T细胞亚群降低 ‎[20] ，部分病毒可通过PI3K-AKT信号通路增强对人体的侵袭 ‎[21] ，而槟榔–草果–厚朴对上述病原有抑制作用，对相关因子和通路也有调节作用，下面进行具体阐述。

4.1. 槟榔–草果–厚朴中主要活性成分的作用机制

槟榔–草果–厚朴–活性成分–上呼吸道感染靶点网络表明，槟榔–草果–厚朴的主要活性成分Quercetin、Procyanidin B1、Daucosterol_qt、Eucalyptol、Neohesperidin等发挥治疗作用。

Quercetin是黄酮类化合物中的主要成分，对呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、鼻病毒、腺病毒等有抑制作用 ‎[22] ‎[23] ‎[24] ‎[25] ，可通过下调AKT1的表达抑制PI3K-AKT信号通路 ‎[26] ，有研究表明，PI3K-AKT信号通路能够增强多种病毒的复制，并可能与RNA和DNA病毒(包括甲型流感病毒)的溶解性感染有关 ‎[21] ，Quercetin还能明显抑制TNF-α诱导下内皮细胞NF-κBRel A的活化，并减少IL-6的表达，抑制程度与槲皮素浓度呈正相关 ‎[27] ‎[28] ；Procyanidin B1是多酚类化合物，能作用于人单核细胞，具有拮抗IL-6抑制IL-1β等细胞因子产生的作用 ‎[29] ，有研究表明，Procyanidin B1能够明显抑制脂多糖(革兰阴性菌外膜的主要成分)介导的炎症反应，且其抗炎活性呈浓度依赖，可能是通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用 ‎[30] ；Daucosterol_qt是β-谷甾醇糖苷的化合物，有研究表明，其可抑制IL-6和IL-1β的表达，且随着剂量增加，抑制作用随之增强 ‎[31] ；Eucalyptol是一种氧化萜类化合物，有研究表明，其对呼吸系统炎性疾病具有抗炎、抗氧化的作用 ‎[32] ‎[33] ，可抑制LTB2、PGE2、IL-1β、IL-6、TNF-α和TGFB1的产生 ‎[34] ‎[35] ‎[36] ，其对溶血性链球菌、肺炎克雷伯杆菌有抑制作用 ‎[37] 。此外，还能促进黏液纤毛清除功能，增强气道内细菌如流感嗜血杆菌的清除 ‎[38] ；Neohesperidin是一种酚类化合物，有研究表明，其对革兰阳性菌的抗菌作用高于革兰阴性菌，能有效抑制细菌生长。此外，还能提升免疫力，增强自然杀伤细胞的细胞毒性和吞噬单核细胞比例，提高CD4+和CD8+细胞数等 ‎[39] 。

4.2. 槟榔–草果–厚朴治疗上呼吸道感染通路的作用机制

KEGG富集分析结果表明，槟榔–草果–厚朴中主要活性成分通过PI3K-AKT、松弛素、NF-κB、cAMP、FoxO等信号通路发挥治疗作用。

PI3K-AKT信号通路，是防御病原入侵的重要信号通路之一 ‎[40] ，当发生上呼吸道感染时，PI3K-AKT信号通路可被激活，并通过B细胞和T细胞受体的免疫应答调节机体免疫 ‎[41] ‎[42] ‎[43] ，且还能激活NF-κB上调炎症因子的表达 ‎[44] 。有研究表明，病毒的侵袭和复制可能是通过激活并利用PI3K-AKT信号通路完成的 ‎[40] 。

松弛素信号通路，是一种以松弛素作为配体的信号通路，有研究表明，松弛素可增加MMP-2和MMP-9的表达 ‎[45] ，而MMP-9是诱导炎症因子分泌的关键因子 ‎[46] ，可将IL-8和IL-1β活化，从而影响病理进程。主要的呼吸道病原体，如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和流感嗜血杆菌等，能够诱导MMP-9的产生 ‎[47] 。

NF-κB信号通路，在调节对感染的免疫应答中起关键作用，而异常调节与炎症、癌症和自身免疫疾病等有关。激活后的NF-κB可调控许多因子的转录，如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、iNos、ICAM-1等 ‎[48] ‎[49] ‎[50] ，TNF-α为炎症反应的“开关”，可诱发局部炎症反应 ‎[46] ，IL-2与炎性反应和宿主病毒增殖有紧密联系 ‎[51] 。有研究表明，流感病毒感染小鼠后可上调NF-κB表达 ‎[48] ‎[52] 。

cAMP信号通路，又称PKA系统，有研究表明，cAMP水平的升高可调节炎症反应 ‎[53] ，抑制细胞吞噬、吞噬体酸化、溶酶体酶释放等 ‎[54] 。另有研究表明，体温和cAMP的含量变化呈正相关 ‎[55] ，cAMP还可引起感觉神经元过度兴奋和痛觉过敏 ‎[56] 。

FoxO信号通路，通过调节基因表达参与细胞的生理事件，包括凋亡、细胞周期控制、葡萄糖代谢、氧化应激抵抗等 ‎[57] 。FoxO蛋白家族包括4个亚型FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6，FoxO1为Akt下游基因，PI3K-Akt信号通路激活后，可使FoxO1磷酸化从核内移动到胞质，失去转录活性，抑制细胞凋亡，有研究表明，FoxO1可抑制炎性因子的表达 ‎[58] ‎[59] ‎[60] 。

4.3. 槟榔–草果–厚朴中主要活性成分的分子对接验证

分子对接结果表明，槟榔–草果–厚朴中主要活性成分通过TNF、MMP9、STAT3、AKT1、TGFB1、PTGS2等核心靶点发挥治疗作用。

TNF是一种多效细胞因子，在炎症、细胞凋亡和免疫功能调节中起主要作用，正常情况下，体内浓度较低，有研究表明，革兰阴性菌的内毒素和呼吸道病毒如流感病毒、鼻病毒等能诱导TNF-α、IL-1β、IL-6等的产生 ‎[61] ‎[62] ‎[63] ，使其在体内的浓度升高。其中，TNF-α是呼吸道病毒的重要靶点，在RNA病毒的复制过程中起关键作用 ‎[64] 。

MMP-9是一种锌钙依赖性内肤酶，在炎症反应中起重要作用，有研究表明，MMP-9参与了气道炎症反应 ‎[65] ，MMP-9可在呼吸道上皮细胞基底膜上打孔，促使炎性细胞因子如TNF-α、TGFB的迁移聚集，破坏内皮和上皮结构，参与呼吸道重构和炎症反应 ‎[66] 。

STAT3是JAK的下游效应分子，能协同NF-κB调节TNF-α等炎症因子的表达 ‎[67] ，STAT3在炎症反应中的优先级可能大于NF-κB，IL-6是STAT3主要的胞外刺激因子 ‎[33] ，有研究表明，抑制STAT3的磷酸化，能有效减少IL-1β的分泌 ‎[68] 。

AKT1是PI3K的下游效应分子，有研究表明，抑制PI3K和AKT可降低呼吸道合胞病毒对人体的侵染 ‎[69] 。此外，AKT1显性阴性突变可显著抑制病毒RNA的表达，降低病毒衣壳蛋白的表达和病毒的释放 ‎[70] 。

TGFB1是一种双向性多功能细胞因子，可调节机体炎症反应 ‎[71] ，低浓度TGFB1具有免疫刺激效应，高浓度TGFB1可抑制T细胞、B细胞及巨噬细胞的活性及功能，具有免疫抑制效应 ‎[72] ，有研究表明，TGFB1可通过诱导巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等趋化，并延长炎性细胞存活时间，刺激气道平滑肌细胞释放炎性因子 ‎[73] 。

PTGS2是前列腺素生物合成中的关键酶，受NF-κB调节并受多种刺激转录，在气道炎症的发病机制中起关键作用 ‎[74] ，有研究表明，抑制前列腺素产物能降低cAMP水平，增强宿主的抗菌能力 ‎[75] ，敲除PTGS2基因可增强对铜绿假单胞菌的清除能力 ‎[76] 。另有研究表明，PTGS2是呼吸道合胞病毒、鼻病毒、流感病毒、柯萨奇病毒等多个呼吸道病毒的靶点 ‎[77] 。

5. 总结

综上所述，槟榔–草果–厚朴治疗上呼吸道感染的潜在作用机制涉及抗病毒、抗炎和增强免疫力三方面，主要是以Quercetin、Procyanidin B1、Daucosterol_qt、Eucalyptol、Neohesperidin等活性成分，通过TNF、MMP9、STAT3、AKT1、TGFB1、PTGS2等核心靶点和PI3K-AKT、松弛素、NF-κB、cAMP、FoxO等信号通路，抑制呼吸道病毒如呼吸道合胞病毒、流感病毒、鼻病毒、腺病毒等和呼吸道细菌如溶血性链球菌等，下调炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的表达，增强自然杀伤细胞的细胞毒性和吞噬单核细胞比例，提高CD4+和CD8+细胞数等，从而缓解鼻和咽喉部症状，达到治疗上呼吸道感染的作用。

由于本研究仅限于网络药理学层面，部分预测内容目前缺乏相应的研究，所以具体的调控机制、关键作用靶点还需通过谱效关系研究、动物或细胞实验等进行验证。

NOTES

^*通讯作者。