摘要: 目的：探讨在高糖条件下敲低多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶2 (GALNT2)与抑制磷酸化表皮生长因子受体(Phosphorylated epidermal growth factor receptor, p-EGFR)对视网膜血管内皮细胞(HRCECs)增生及凋亡的影响。方法：本研究以高糖(25 mmol·L
−1)状态下体外培养的HRCECs为研究对象，将HRCECs分为mock组(25 mmol·L
−1葡萄糖)、mock + shGALNT2组(25 mmol·L
−1葡萄糖 + GALNT2敲低病毒)、mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组(25 mmol·L
−1葡萄糖 + 对照病毒 + Chrysophanol)、mock + shGALNT2 + Chrysophanol组(25 mmol·L
−1葡萄糖 + GALNT2敲低病毒 + Chrysophanol)，连同培养液在37℃恒温培养箱中培养24 h，比较各组GALNT2 mRNA相对表达量、细胞增生值、细胞凋亡率，以及GALNT2、EGFR、EGF、p-EGFR蛋白相对表达量。结果：mock组、mock + shGALNT2、mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组和mock + shGALNT2 + Chrysophanol组细胞中GALNT2 mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义(
P < 0.001)。mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组和mock + shGALNT2 + Chrysophanol组中细胞增生值低于mock + shGALNT2组，差异具有统计学意义(
P < 0.001)；mock + shGALNT2 + Chrysophanol组中细胞增生值高于mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组，差异具有统计学意义(
P < 0.001)。mock组、mock + shGALNT2组、mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组和mock + shGALNT2 + Chrysophanol组细胞凋亡率分别为(8.66 ± 0.22)%、(5.47 ± 0.16)%、(11.94 ± 0.85)%和(6.70 ± 0.26)%，总体比较差异有统计学意义(
F = 96.56,
P < 0.001)。mock + shGALNT2 + chrysophanol组细胞凋亡率高于mock + shGALNT2组，差异有统计学意义(
P < 0.001)；mock + shGALNT2 + chrysophanol组细胞凋亡率低于mock + NC-shGALNT2 + chrysophanol组，差异有统计学意义(
P < 0.001)。mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol 组和mock + shGALNT2 + Chrysophanol组GALNT2蛋白相对表达量高于mock + shGALNT2组，差异有统计学意义(
P < 0.001)。mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组EGF、EGFR、p-EGFR蛋白相对表达量高于mock + shGALNT2组，但差异无统计学意义(
P > 0.05)。结论：在高糖条件下，敲低的GALNT2可以通过介导p-EGFR可以提高HRCECs细胞的增殖能力，减少HRCECs细胞的凋亡。
Abstract:
Objective: To investigate the effects of knocking down peptide N-acetylgalactosamine transferase 2 (GALNT2) and inhibiting phosphorylation of epidermal growth factor receptor under high glucose conditions on the proliferation and apoptosis of retinal vascular endothelial cells (HRCECs). Method: This study focuses on cultured HRCECs in vitro under high glucose (25 mmol·L−1) conditions, and divides them into a mock group (25 mmol·L−1 glucose), mock + shGALNT2 group (25 mmol·L−1 glucose + GALNT2 knockdown virus), mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol group (25 mmol·L−1 glucose + control virus + Chrysophanol), mock + shGALNT2 + Chrysophanol group (25 mmol·L−1 glucose + GALNT2 knockdown virus + Chrysophanol) and culture medium were cultured in a constant temperature incubator at 37˚C for 24 hours. The relative expression level of GALNT2 mRNA, cell proliferation value, apoptosis rate, GALNT2, EGFR, EGF, and p-EGFR proteins were compared between the groups. Results: The relative expression levels of GALNT2 mRNA in the cells of the mock group, mock + shGALNT2 group, mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol group, were compared with mock + shGALNT2 + Chrysophanol group, and the differences were statistically significant (P < 0.001). Compared with mock + shGALNT2 group, the cell proliferation values in mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol and mock + shGALNT2 + Chrysophanol group were significantly reduced, and the differences were statistically significant (P < 0.001); Compared with mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol group, the cell proliferation value in mock + shGALNT2 + Chrysophanol group significantly increased, and the difference was statistically significant (P < 0.001). The apoptosis rates of mock group, mock + shGALNT2 group, mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol group and mock + shGALNT2 + Chrysophanol group were (8.66 ± 0.22)%, (5.47 ± 0.16)%, (11.94 ± 0.85)% and (6.70 ± 0.26)% respectively. The overall differences were statistically significant (F = 96.56), (P < 0.001). Compared with mock + shGALNT2 group, the apoptosis rate of the mock + shGALNT2 + Chrysophanol group was significantly increased, and the difference was statistically significant (P < 0.001); Compared with the mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol group, the apoptosis rate of the mock + shGALNT2 + Chrysophanol group was significantly reduced, and the difference was statistically significant (P < 0.001). Compared with mock + shGALNT2 group, the relative expression level of GALNT2 protein in the mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol and mock + shGALNT2 + Chrysophanol group significantly was increased, and the difference was statistically significant (P < 0.001). Comparison of relative protein expression levels of EGF, EGFR, and p-EGFR proteins in mock + shGALNT2, the mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol group showed an increasing trend, and the differences were not statistically significant (P > 0.05). Conclusion: Under high glucose conditions, knocking down GALNT2 can enhance the proliferation ability of HRCEC cells and reduce apoptosis by mediating p-EGFR.
1. 前言
糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一组由遗传、环境和自身免疫性疾病引起的慢性代谢性疾病。长期的代谢紊乱可导致微血管和大血管疾病、神经并发症等。糖尿病视网膜病变(diabetes retinopathy, DR)是DM最常见和最严重的微血管并发症之一[1] [2]。全球有1亿多人口患有DR [3]。DR是一种进行性发展的疾病，是危害视力的主要视网膜类疾病[4]。而表皮生长因子受体(Epidermal growth factor Receptor, EGFR)的磷酸化对DR具有保护作用[5]，其原因是EGFR通过与配体结合到胞外结构域，并触发磷酸化，启动多个下游信号传导通路[6]，包括MAPK、PI3K-AKT和STAT3和STAT5，通过这些通路来调节细胞的增殖、凋亡和血管生成[7]。多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶2 (polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 2, GALNT2)是调节黏蛋白O-糖基化起始步骤的酶，通过调节EGFR的活性(磷酸化)而起作用[8]。氧连-N-乙酰葡萄糖胺修饰(O-linked N-acetylglucosamine, O-GlcNAc)、信号转导和转录激活因子3 (Signal Transduction and Transcription Activator 3, STAT3)磷酸化可减轻原代视网膜血管内皮细胞(retinal vascular endothelial cells, RVECs)的细胞凋亡[9] [10]。大黄酚(Chrysophanic Acid)是一种天然蒽醌，其通过抑制兔抗表面生长因子(epidermal growth factor, EGF)诱导的EGFR磷酸化并抑制AKT和mTOR/p70S6K的活化明显阻断细胞增殖。既往研究表明，在DM模型小鼠体内和细胞体外实验中我们都得出，GALNT2与P-EGFR表达呈负相关性[11]，因此，我们推测，高糖环境下敲低的GALNT2通过介导EGFR磷酸化对DR起到保护作用。本实验的研究目的是将人视网膜毛细血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cells, HRCECs)置于高糖条件下，探究敲低GALNT2与EGFR磷酸化抑制剂(Chrysophanol)对HRCECs的影响，并与对照组比较，进一步证实敲低的GALNT2通过介导EGFR磷酸化可以提高HRCECs细胞的增殖能力，减少HRCECs细胞的凋亡，以期为DR的临床治疗提供新的思路与靶点。
2. 材料与方法
2.1. 材料
HRCECs购自美国ATCC公司；DMEM培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；凋亡试剂盒、磷酸盐缓冲剂(phosphate buffer solution, PBS)购自美国eBioscience公司；Trizol购自美国Sigma公司(T9424-100 m)；Hiscript QRT supermix for qPCR (+gDNA WIPER)购自南京Vazyme生物科技股份有限公司(R123-01)；AceQ qPCR SYBR Green master mix试剂盒购自南京Vazyme生物科技股份有限公司(Q111-02)；Real time PCR仪器购自美国ABI公司(VII7)；稳压电泳仪、蛋白转模仪、SDS-Acry/Bis蛋白电泳仪均购自上海天能科技有限公司；Nanodrop 2000c紫外分光光度计购自美国Thermo Fisher科技公司；流式细胞仪购自美国Millipore公司；5417R台式冷冻高速离心机购自德国Eppendorf公司；胎牛血清购自美国Invitrogen公司(10099-141)；兔抗GALNT2多克隆抗体(Ab262868)、兔抗表面生长因子(epidermal growth factor, EGF)多克隆抗体(Ab184265)、兔抗EGFR多克隆抗体(Ab52894)、兔抗磷酸化EGFR (p-EGFR)多克隆抗体(Ab40815)均购自英国Abcam公司；兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)多克隆抗体购自美国Bioworld公司(AP0063)；EGFR磷酸化抑制剂(Chrysophanol)购自上海抚生实业有限公司(110796-201922)。
2.2. 方法
2.2.1. 细胞培养
将HRCECs细胞置于含有1 × 105 U∙L−1青/链霉素和体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，在37℃、体积分数5% CO2的恒温培养箱中进行培养。
2.2.2. 制作高糖细胞模型
用适量PBS溶液将葡萄糖配置成25 mmol∙L−1浓度。取生长良好的HRCECs细胞，在4孔板中铺板，每孔细胞数为5 × 106个。向每孔细胞上加入25 mmol∙L−1浓度的葡萄糖培养48 h，建立高糖模型。
2.2.3. 细胞分组和慢病毒转染
取HRCECs分为mock组(25 mmol∙L−1葡萄糖) [12]-[15]和GALNT2敲低病毒组(25 mmol∙L−1葡萄糖)。将mock组细胞进一步分组：mock组(HRCECs不做任何处理)、mock + NC-GALNT2 + Chrysophanol组(25 mmol∙L−1葡萄糖 + 对照病毒 + p-EGFR磷酸化抑制剂)；将GALNT2敲低病毒组进一步分组：mock + shGALNT2组(慢病毒转染后不做任何处理)、mock + GALNT2 + Chrysophanol组(25 mmol∙L−1葡萄糖 + 慢病毒转染后的细胞 + p-EGFR磷酸化抑制剂)，分组后继续培养，24 h后观察转染效率，在37℃恒温培养箱中继续培养24 h，收集各组细胞备用。
2.2.4. 实验指标
1) RT-PCR法检测各组GALNT2 mRNA表达情况 提取“1.2.3”中培养的各组细胞，胰蛋白酶消化、离心，收集细胞，采用Trizol提取各组细胞总RNA，根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA作为模板在PCR仪上进行扩增反应，PCR扩增反应条件：95℃ 20 min，随后95℃预变性30 s，95℃变性5 s，65℃退火30 s，共40个循环。各组设计3个复孔，实验重复3次。以GAPDH为内参，采用2−△△Ct法计算各组中GALNT2的相对表达水平。
2) CCK-8法检测HRCECs细胞增生值 提取“1.2.3”中培养的各组细胞，PBS清洗后，加入2 mL 0.025 g∙L−1胰蛋白酶消化、离心，弃去上清，再补充20 mL细胞培养基，均匀吹打，将细胞均匀的接种到96孔板中，每组设置3个复孔，每孔细胞数为5 × 106∙L−1，37℃，体积分数5% CO2细胞培养箱培养24 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液，培养箱孵育4 h，连续5 d测定在酶标仪450 nm波长处的细胞吸光度值(A值)。实验重复3次。
3) 流式细胞术检测HRCECs细胞凋亡率 提取“1.2.3”中培养的各组细胞，0.025 g∙L−1胰酶消化细胞，5 min离心去上清，PBS洗涤细胞2次，取出PBS重悬细胞，再次离心，弃去上清，加入1 × Binding Buffer稀释为1 × 109∙L−1，取100 μl细胞悬液，加入5 μl FITC Annexin V和5 μl PI，混匀后25℃避光孵育15 min，后每管加入400 μl 1 × Binding Buffer，流式细胞仪上进行流式分析。每组设置3个复孔，实验重复3次，凋亡率计算法：细胞总凋亡率 = 早期凋亡率 + 晚期凋亡率。
4) Western blot法检测GALNT2、EGFR、P-EGFR和EGF蛋白相对表达量 提取“1.2.3”中培养的各组细胞，胰蛋白酶消化，用预冷PBS洗涤3次。加入500 μl RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA试剂盒测定各样品浓度，100℃ 10 min，至蛋白完全变性，配制SDS-PAGE凝胶，以GAPDH为内参，取40 ug总蛋白依次进行电泳、转膜和封闭过程。一抗孵育：取出封闭完好的PVDF膜，加入相应的一抗(GALNT2抗体1:2000稀释、EGF抗体1:2000稀释、EGFR 1:2000稀释、p-EGFR 1:2000稀释、GAPDH抗体1:3000稀释)，4℃摇床孵育过夜；二抗：加入对应二抗(羊抗兔抗体按1:3000稀释)，室温孵育2 h，洗膜后显影，采用凝胶成像系统曝光拍照，ImageJ软件分析各组蛋白条带灰度值，每组设置3个复孔，实验重复3次。
2.3. 统计学分析
采用SPSS26.0软件进行统计学分析，GraphPad Prism8.0软件进行绘制图片，符合正态分布的数据使用(均数 ± 标准差)表示，多组间比较采用单因素方差(F)分析各组数据之间的差异，组间两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05即认为有显著统计学意义。
3. 结果
3.1. 四组细胞中GALNT2 mRNA相对表达量比较
通过实时定量PCR检测mock组、mock + shGALNT2组、mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组和mock + shGALNT2 + Chrysophanol组细胞中GALNT2 mRNA相对表达量分别为2.946 ± 0.532、0.613 ± 0.081、1.011 ± 0.186和0.356 ± 0.041，总体比较差异有统计学意义(F = 50.83, P < 0.001)。mock + shGALNT2组、mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组、mock + shGALNT2 + Chrysophanol 组GALMT2 mRNA相对表达量低于mock组，差异均有统计学意义(P < 0.001)。mock + shGALNT2组、mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组和mock + shGALNT2 + Chrysophanol组两两比较，差异均无统计学意义(P > 0.05)，见图1。
F = 50.83，P < 0.001，与mock组比较，aP < 0.001 (单因素方差分析，LSD-t检验，n = 3)。A：mock组；B：mock + shGALNT2组；C：mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组；D：mock + shGALNT2 + Chrysophanol组。
Figure 1. Comparison of relative expression levels of GALNT2 mRNA in four groups of cells
图1. 四组细胞中GALNT2 mRNA相对表达量比较
3.2. 四组HRCECs增生值水平比较
培养5 d后，各组进行HRCECs细胞增生值统计，mock + shGALNT2组中细胞增生值高于mock组，mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组和mock + shGALNT2 + Chrysophanol组中细胞增生值低于mock组，差异有统计学意义(P < 0.01)。mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组和mock + shGALNT2 + Chrysophano组中细胞增生值低于mock + shGALNT2组，差异有统计学意义(P < 0.01)。mock + shGALNT2 + Chrysophanol组中细胞增生值高于mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组，差异有统计学意义(P < 0.01)，见图2，表1。
随着连续5 d的培养，各组细胞增生A值均有升高趋势，mock + shGALNT2组增高A值逐渐高于其他三组，mock + shGALNT2 + chrysophanol组增生A组逐渐高于mock + NC-shGALNT2 + chrysophanol组A：吸光度；chrysophanol：p-EGFR磷酸化抑制剂。
Figure 2. Changes in proliferation A values of four groups of HRCECs at different time points
图2. 四组HRCECs不同时间点增生A值变化
Table 1. Comparison of cell proliferation A values (
± S) and total apoptosis rate (%) of cells treated with FITC/PI dual staining method on the 5th day of four groups of culture
表1. 四组培养第5 d时细胞增生A值比较(
± S)以及采用FITC/PI双染法处理的细胞总凋亡率(%)
组别 |
样本量 |
A值 |
细胞凋亡率(%) |
mock组 |
3 |
2.164 ± 0.004 |
8.66 ± 0.22 |
mock + shGALNT2组 |
3 |
2.822 ± 0.008a |
5.47 ± 0.16a |
mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组 |
3 |
1.585 ± 0.008ab |
11.94 ± 0.85ab |
mock + shGALNT2 + Chrysophanol组 |
3 |
2.023 ± 0.018abc |
6.70 ± 0.26ac |
F |
|
5731 |
96.56 |
P |
|
<0.001 |
<0.001 |
注：与mock组比较，aP < 0.01；与mock + shGALNT2组比较，bP < 0.01；与mock + NC-shGALNT2 + chrysophanol组比较，cP < 0.011 (单因素方差分析，LSD-t检验) A：吸光度；chrysophanol：p-EGFR磷酸化抑制剂。
3.3. 四组HRCECs细胞凋亡水平比较
实验结果显示，mock + shGALNT2组和mock + shGALNT2 + chrysophanol组细胞凋亡率低于mock组，mock + NC-shGALNT2 + chrysophanol组细胞凋亡率高于mock组，差异有统计学意义(P < 0.01)。mock + shGALNT2 + chrysophanol组细胞凋亡率高于mock + shGALNT2组，差异有统计学意义(P < 0.01)。mock + shGALNT2 + chrysophanol组细胞凋亡率低于mock + NC-shGALNT2 + chrysophanol组，差异有统计学意义(P < 0.01)，见图3及表1。
(a) (b)
(c) (d)
注：(a)：mock组、(b)：mock + shGALNT2组、(c)：mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组、(d)：mock + shGALNT2 + Chrysophanol组。
Figure 3. Flow cytometry detection of cell apoptosis in each group
图3. 各组细胞凋亡流式细胞检测图
3.4. 四组细胞中GALNT2、EGFR、EGF、p-EGFR蛋白相对表达量比较
实验结果显示，mock组、mock + shGALNT2组、mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组和mock + shGALNT2 + Chrysophanol组的GALNT2、EGF、EGFR、p-EGFR相对表达量比较，差异均有统计学意义(F = 775.7, 107.9, 78.58, 255.8, P < 0.05)。mock + shGALNT2组、mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol 组和mock + shGALNT2 + Chrysophanol组EGF和p-EGFR蛋白相对表达量高于mock组，GALNT2和EGFR蛋白表达量低于mock组，差异有统计学意义(P < 0.01)。mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组和mock + shGALNT2 + Chrysophanol组GALNT2蛋白相对表达高于mock + shGALNT2组，差异有统计学意义(P < 0.001)。mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组EGF、EGFR、p-EGFR蛋白相对表达量高于mock + shGALNT2组，但差异无统计学意义(P > 0.05)。mock + shGALNT2 + Chrysophanol组EGFR蛋白相对表达量高于mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组，EGF、p-EGFR蛋白相对表达量低于mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组，差异具有统计学意义(P < 0.01)。见图4及图5。
4. 讨论
DR是DM的主要眼部并发症，是世界范围内视力损害和失明的主要原因[16]。高血糖会导致眼底血管内皮细胞受到损伤破坏血–视网膜屏障，使得血液中的葡萄糖、蛋白质等物质漏出，造成视网膜水肿和渗出，对视力造成影响[17] [18] [19]。高糖状态下DR患者的屏障受损，血管内皮细胞凋亡，研究发现，内皮细胞功能障碍是导致DR发生的主要发病机制之一[20]。因此本文研究高糖条件下HRCECs中GALNT2与p-EGFR的相关性研究，对DR防治具有重要意义。
注：A：mock组、B：mock + shGALNT2组、C：mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组、D：mock + shGALNT2 + Chrysophanol组GALNT2：多肽N-乙酰半乳糖转移酶2；EGF：表皮生长因子；EGFR：表皮生长因子受体；p-EGFR：磷酸化表皮生长因子；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶。
Figure 4. Western blot detection of relative expression levels of GALNT2, EGF, EGFR, and p-EGFR proteins in four groups of HRCECs
图4. Western blot 法检测四组HRCECs中GALNT2、EGF、EGFR、p-EGFR蛋白相对表达量
(a) (b) (c) (d)
注：****P <0.001，**P < 0.01，*P < 0.05 (单因素方差分析，LSD-t检验) GALNT2：多肽N-乙酰半乳糖转移酶2；EGF：表皮生长因子；EGFR：表皮生长因子受体；p-EGFR：磷酸化表皮生长因子；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶。
Figure 5. A-D shows the statistical graph of relative protein expression levels
图5. A-D为蛋白相对表达量统计图
GALNT2是White等在1995年首次从人胎盘中纯化出的糖基转移酶[21]，GALNT2的异常表达会影响多种癌症的恶性程度。GALNT2可以修饰EGFR糖基化和活性，从而调节HCC细胞的恶性行为[11]。GALNT2与粘蛋白受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs)的活化有关，EGFR是最早报道和研究最多的RTKs [22]。EGFR是一种酪氨酸激酶受体，具有跨膜区和细胞内酪氨酸激酶结构域[23]。表皮生长因子与表皮生长因子受体胞外区的结合，会导致受体二聚化，进而催化酪氨酸激酶的活性，诱导下游信号发生级联反应。既往研究表明，EGFR具有O-糖原，GALNT2是调节黏蛋白O-糖基化起始步骤的酶，通过调节EGFR的活性而起作用[8]。EGFR是PI3K/Akt途径中的上游分子，当它被激活时会被磷酸化。EGFR下游信号通路参与DR的进展，因而可以通过抑制通路信号分子影响DR的进展[24]。
研究表明，GALNT2可通过调节EGFR的活性，进而调控疾病的进展。Wu YM等[25]研究表明，在肝癌中，GALNT2可调节EGFR上的短O-糖聚的结构，GALNT2还可调节EGFR及其下游信号分子的恶性表型和磷酸化水平，进而抑制肝癌细胞的迁徙和侵袭。Wang X等[26]研究表明，在胃癌中，GALNT2基因的敲除可以增加胃癌细胞中EGFR磷酸化的增高，从而改变EGF、EGFR的表达，增加胃癌细胞增殖、粘附和侵袭。本文研究中，mock组GALNT2 mRNA蛋白表达量、HRCECs细胞凋亡率低于mock + shGALNT2组比较，mock组HRCECs细胞增生值水平高于mock + shGALNT2组。研究结果表明，敲低GALNT2对DR有保护作用。既往研究表明，GALNT2可通过介导EGFR磷酸化对DR起到保护作用[11]。敲低GALNT2可以通过EGFR下游信号通路的激活(磷酸化)，减少HRCECs细胞凋亡，可以对DR起保护作用[21]。曹航等[27]研究表明，在卵巢癌中，抑制EGFR下游信号分子PI3K/AKT/mTOR通路，可对卵巢癌的激活、增殖、侵袭和耐药起到重要作用。本文研究中，mock+shGALNT2组GALNT2 mRNA蛋白表达量低于mock + shGALNT2 + Chrysophanol组，但无统计学意义。研究结果表明，敲低GALNT2与EGFR磷酸化抑制剂都是通过阻断EGFR磷酸化下游信号通路，进而延缓DR的进展。本文研究将EGFR磷酸化抑制剂(Chrysophanol)引入眼科领域，对前期实验“敲低GALNT2可能通过调控EGFR，p-EGFR参与DR的发生发展[20]”进行回复性实验。Western blot法检细胞中GALNT2、EGFR、EGF、p-EGFR蛋白相对表达量：mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组与mock + shGALNT2 + Chrysophanol组比较，HRCECs中EGFR相对表达量明显增多，p-EGFR相对表达量显著减少。mock + shGALNT2组与mock + NC-shGALNT2 + Chrysophanol组比较，HRCECs中EGFR相对表达量明显增多，p-EGFR相对表达量显著减少。本实验研究结果表明，敲低GALNT2和加入p-EGFR磷酸化抑制剂均可以逆转EGFR和p-EGFR的表达。
综上所述，本研究结果表明，在高糖环境下，HRCECs内敲低GALNT2的作用与EGFR磷酸化抑制剂的作用效果一致，敲低GALNT2基因后EGFR磷酸化同样被阻止或抑制。因此我们推测，在高糖条件下，敲低的GALNT2可以通过介导p-EGFR可以提高HRCECs细胞的增殖能力，减少HRCECs细胞的凋亡，以期为DR的临床治疗提供新的思路与靶点。
基金项目
内蒙古自治区自然科学基金(编号：2021LHMS08064)。
NOTES
*通讯作者。