转铁蛋白受体对宫颈癌细胞自噬的影响

Effect of Transferrin Receptor on Autophagy of Cervical Cancer Cells

摘要: 目的：探讨敲低转铁蛋白受体(TFRC)对宫颈癌Hela细胞增殖、迁移和自噬的影响及可能的作用机制。方法：慢病毒构建敲低TFRC宫颈癌细胞系，分为空白对照组、TFRC敲低阴性对照组、TFRC敲低组。通过蛋白质印迹验证各组目的基因TFRC、自噬相关蛋白Beclin-1、P62、LC3和细胞外信号调节激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(ERK/AKT/mTOR)信号通路相关蛋白的表达水平。利用CCK8法检测各组细胞增殖活性；流式细胞术检测各组细胞周期分布；细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力。结果：与空白对照组相比，TFRC敲低组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3蛋白表达水平降低(P < 0.05)，P62蛋白表达水平升高(P < 0.05)。p-ERK、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平明显降低(P < 0.01)。细胞增殖能力减弱(P < 0.05)，细胞迁移能力被抑制(P < 0.01)，细胞周期被阻滞在G2/M期(P < 0.01)。结论：敲低转铁蛋白受体(TFRC)可能通过抑制ERK/AKT/mTOR信号通路抑制宫颈癌细胞自噬，进而抑制其增殖、迁移。

Abstract: Objective: To investigate the effects of knockdown of transferrin receptor on proliferation, migration and autophagy of Hela cells of cervical cancer, and to study of possible molecular mechanisms. Methods: Lentiviral construction of knockdown TFRC cervical cancer cell lines, and were divided into the blank control group, TFRC knock-down negative control group, TFRC knock-down group. The expression of target gene TFRC, autophagy-related proteins Beclin-1, P62, LC3, and extracellular signal-regulated kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin (ERK/AKT/mTOR) signaling pathway-related proteins was detected by Western blotting. The activities of cells in various group were detected by CCK-8 assay. Cell cycle distributions in various group were detected by flow cytometry. Cell migration abilities in various group were detected by cell scratch assay. Observation cellular autophagic vesicles in various group by electron microscopy. Results: Compared with the blank control group, the protein expression levels of autophagy-related proteins Beclin-1 and LC3 in cervical cancer cells in TFRC knock-down group decreased (P < 0.05), the protein expression levels of P62 increased (P < 0.05). The protein expression levels of p-ERK, p-AKT, p-mTOR increased (P < 0.01). The proliferation ability of the cells decreased (P < 0.05), cell migration capacity decreased (P < 0.01), arrest the cell cycle in G2/M phase (P < 0.01). Conclusions: Knockdown of transferrin receptor (TFRC) may inhibit autophagy of cervical cancer cells by suppressing the ERK/AKT/mTOR signaling pathway, which in turn inhibits their proliferation and migration.

1. 前言

宫颈癌(Cervical Cancer, CC)是中低收入国家中女性癌症死亡的主要原因，尽管同步放化疗是治疗晚期宫颈癌常规的治疗方式，但宫颈癌相关死亡率仍然很高[1]。研究表明，体内铁水平与肿瘤联系密切，铁蓄积会导致肿瘤的发生、生长和转移。反之，肿瘤的生长可以通过操纵铁代谢相关蛋白质来调节[2]。转铁蛋白受体(Transferrin Receptor, TFRC)作为铁摄取和细胞生长的重要调节因子，已被证明为许多肿瘤中的促癌基因。我们前期研究已证实，TFRC在宫颈癌中呈高表达，在癌组织中TFRC阳性表达率为73.33%，而在正常宫颈组织中仅为25%，且其高表达与预后不良相关[3]。

自噬作为一种适应性分解代谢过程，在应对各种代谢压力时被激活。其最重要的生理功能是调动细胞内能量资源，来满足细胞和生物体对代谢底物的需求，并消除有缺陷或受损的蛋白质和细胞器，防止有毒物质积累[4]。自噬通过铁蛋白的吞噬回收铁蛋白复合物来调节铁的生物利用率[5]。自噬功能障碍可以导致多种疾病的发生，并促进肿瘤生长。在胰腺导管腺癌中，铁蛋白自噬上调以维持铁的可用性，从而促进肿瘤进展[6]。在宫颈癌中，过表达CCAT1可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制宫颈癌细胞自噬，促进肿瘤细胞增殖[7]。然而，TFRC是否能调控宫颈癌细胞自噬尚不清楚。本研究探讨敲低TFRC是否影响宫颈癌细胞自噬，进而影响其增殖和迁移，并探究其作用机制。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

宫颈癌细胞系HeLa (由青岛市市立医院细胞移植重点实验室提供)，胎牛血清(FBS)和细胞培养基(DMEM)购自大连美仑生物有限公司，BCA试剂盒购自上海爱必信生物科技有限公司，TFRC抗体、Beclin-1抗体、P62/SQSTM1抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，ERK抗体、p-ERK抗体、AKT抗体、p-AKT抗体，mTOR抗体、p-mTOR抗体、LC3B抗体、GAPDH抗体购自上海艾比玛特医药科技有限公司，细胞周期检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，小干扰siRNA购自广州市锐博生物科技有限公司，转染试剂Lipofectamine2000购自赛默飞世尔科技中国公司，慢病毒购自上海吉凯基因科技有限公司。

2.2. 细胞培养及分组

将宫颈癌细胞系HeLa放置在含有10% FBS和1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM中，37℃，5% CO₂，饱和湿度培养，待细胞密度达到对数生长期时按1:2传代及用于后续实验。由锐博生物科技有限公司设计siRNA三个敲低位点；通过上海吉凯基因科技有限公司将敲低效率最高位点构建成敲低TFRC的慢病毒，用于感染细胞。感染后，用嘌呤霉素筛选细胞，获得敲低TFRC的稳转株。将细胞分为空白对照组、TFRC敲低阴性对照组、TFRC敲低组。

2.3. CCK-8法检测细胞增殖活性

将各组宫颈癌细胞(约5 × 10³个/孔)接种于96孔板，每组设6个复孔。细胞贴壁后培养基继续培养24、48、72 h，根据CCK-8试剂操作说明，每孔加入CCK8试剂10 ul，培养箱孵育1.5 h。在波长450 nm下，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，每组去掉一个最大值、一个最小值，其余四孔取平均值，计算相对细胞活力。

2.4. 划痕实验检测细胞迁移能力

先在6孔板背面间隔0.5~1 cm划线，接种各组宫颈癌细胞(约5 × 10⁵个)，置于培养箱中培养过夜细胞贴壁后。用10 μL枪头垂直划线，分别于0、24、48 h在显微镜下观察、拍照，Image J软件分析划痕面积。划痕愈合率 = (0 h划痕面积 − 当前划痕面积) × 100%/0 h划痕面积。

2.5. 流式细胞术检测细胞周期

收集各组宫颈癌细胞约2 × 10⁵个，用预冷的PBS洗涤、离心后弃上清，将细胞加入1 ml预冷的70%乙醇中，吹打混匀，4℃固定2小时。固定好的细胞再次清洗、离心后弃去上清，加入配置好的碘化丙啶染色液中37℃避光温浴30分钟。用流式细胞仪在激发波长488 nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用modfit软件进行分析。

2.6. 采用Western Blotting法检测相关蛋白表达

将各组宫颈癌细胞密度培养至为90%以上时，加入RIPA中效裂解液和蛋白酶抑制剂后充分裂解，于4℃离心机中12,000 g离心7 min，取上清，用BCA法检测蛋白浓度，于剩余上清内加入约1/4体积的5×上样缓冲液与其混合均匀，100℃变性5 min。根据测得的蛋白浓度，进行电泳。电泳结束后，转移至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST液中室温封闭2 h，TBST洗膜10 min × 3次，分别孵育TFRC (1:1500)、ERK (1:1000)、P-ERK (1:1000)、AKT (1:1000)、p-AKT (1:1000)、m-TOR (1:1000)、p-mTOR (1:1000)、Beclin-1 (1:1000)、P62 (1:1000)、LC3(1:1000)和GAPDH (1:4000)一抗，置于4℃冰箱中过夜。室温孵育兔/鼠二抗(1:8000) 1 h，清洗后用ECL化学发光法显影。用GAPDH作为内参，Image J软件分析蛋白条带的灰度值，Graphpad Prism 8.0软件计算各蛋白的相对表达量。

2.7. 统计学分析

本研究采用Graphpad Prism 8.0软件分析数据，所有数据均采用均值 ± 标准差($\overline{x}\pm s$ )，多组间差异采用单因素方差分析，两组间差异比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 实验结果

3.1. 敲低TFRC对宫颈癌细胞自噬相关蛋白表达的影响

Western Blot结果显示，TFRC敲低组TFRC蛋白表达量(0.1153 ± 0.01471)，明显低于TFRC敲低阴性对照组(0.9364 ± 0.01508)，差异有统计学意义(t = 67.53, P < 0.01)。TFRC敲低组自噬相关蛋白Beclin-1蛋白表达量(0.5602 ± 0.02051)、LC3II/LC3I蛋白表达量(0.5482 ± 0.02462)较TFRC阴性对照组(0.9030 ± 0.09905)、(0.9286 ± 0.03370)表达降低，P62蛋白表达量(1.111 ± 0.02134))较TFRC阴性对照组(0.9204 ± 0.04766)表达升高，差异均有统计学意义(t = 5.885, P < 0.05; t = 6.305, P < 0.05; t = 15.79, P < 0.01) (见图1)。

Figure 1. Expression of TFRC and autophagy-related proteins in each group of cells

图1. 各组细胞中TFRC及自噬相关蛋白表达

3.2. TFRC促进宫颈癌细胞增殖

通过CCK8实验检测各组细胞的增殖能力，结果表明，TFRC敲低组细胞吸光值在24 h (0.2580 ± 0.01473)、48 h (0.4793 ± 0.02084)和72 h (0.7593 ± 0.05652)均小于阴性对照组(24 h: 0.3550 ± 0.03291; 48 h: 0.06957 ± 0.0076; 72 h: 1.057 ± 0.177)，差异均有统计学意义(t = 4.660, P < 0.05; t = 16.90, P < 0.01; t = 5.181, P < 0.01)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(t = 0.059, P > 0.05; t = 2.026, P > 0.05; t = 0.563, P > 0.05)。通过时间曲线(0、24、48 h和72 h)发现，敲低TFRC对抑制宫颈癌细胞的增殖能力呈现时间依赖性(见图2)。

Figure 2. TFRC promotes cervical cancer cell proliferation

图2. TFRC促进宫颈癌细胞增殖

3.3. TFRC促进宫颈癌细胞迁移

通过细胞划痕实验表明，TFRC敲低组细胞迁移率在处理24 h和48小时后分别为(20.39 ± 2.124)%、(42.59 ± 1.993)%，与阴性对照组相比(39.09 ± 1.257)%、(54.47 ± 2.33)%明显降低，差异均有统计学意义(t = 4.614, P < 0.01; t = 0.6.802, P > 0.05)。而空白对照组和TFRC敲低阴性对照组比较差异无统计学意义(t = 0.798, P > 0.05; t = 0.580, P > 0.05) (见图3)。

Figure 3. TFRC promotes cervical cancer cell migration

图3. TFRC促进宫颈癌细胞迁移

通过流式细胞术检测细胞周期表明，TFRC敲低组G0/G1期细胞比例为(36.44 ± 1.195)%，较阴性对照组(52.34 ± 0.9878)%显著降低，G2/M期细胞比例(33.54 ± 1.087)%，较阴性对照组(17.07 ± 0.5315)%显著升高，差异均有统计学意义(t = 17.75, P < 0.01; t = 23.57, P < 0.01) (见图4)。

(a)

(b)

Figure 4. Effect of TFRC on the cell cycle of cervical cancer

图4. TFRC对宫颈癌细胞周期的影响

3.4. 敲低TFRC对宫颈癌细胞ERK/AKT/mTOR通路蛋白表达的影响

Western Blot结果显示，TFRC敲低组磷酸化ERK (p-ERK)、磷酸化AKT (p-AKT)、磷酸化m-TOR (p-mTOR)蛋白表达量分别为(0.4528 ± 0.01231)、(0.7491 ± 0.02534)、(0.7645 ± 0.03308)，与阴性对照组相比(1.048 ± 0.01587)、(1.054 ± 0.02285)、(1.094 ± 0.01587)表达水平明显降低，差异均有统计学意义(t = 36.95, P < 0.01; t = 15.45, P < 0.01; t = 15.54, P < 0.01)。总蛋白ERK、AKT、mTOR的表达量基本不变(见图5)。

Figure 5. Expression of ERK/AKT/mTOR Protein in in each group

图5. 各组细胞中ERK/AKT/mTOR蛋白表达

4. 讨论

宫颈癌是全球常见的妇科恶性肿瘤，其发病率和死亡率位于女性恶性肿瘤前列[8]。近些年，随着生活方式的改变，如宫颈细胞学筛查的普遍实施和HPV疫苗的广泛接种，使得宫颈癌及癌前病变能够早期发现和治疗，然而在中低收入国家和地区宫颈癌的发病率和死亡率仍处于较高水平[9] [10]。铁参与细胞内多种功能性活动，在铁与癌症的流行病学研究中表明，体内铁水平升高与癌症发病率增加呈正相关[2]。肿瘤细胞在增殖过程中对代谢和生物合成的需求增加。在转铁蛋白受体(TFRC)是调节细胞铁稳态的关键因子，TFRC通过与转铁蛋白复合物结合以促进铁离子进入细胞[11]。在恶性肿瘤中，许多与铁代谢相关的蛋白质和信号通路被改变，例如，MEK信号转导的激活可以调节转铁蛋白受体和铁蛋白的表达水平[12]，铁通过GP130/STAT3信号促进肺癌发生[13]。铁相关蛋白的异常表达影响癌症进展和转移[14]。不同类型肿瘤细胞，TFRC影响癌症进展的机制也不相同。在弥漫型胃癌细胞中，TFRC与成纤维细胞生长因子受体2 (FGFR2)相结合，促进癌细胞的增殖和致瘤性[15]。我们前期研究表明，TFRC可能通过调控JAK-STAT促进宫颈癌细胞恶性生物学行为[3]。

自噬是维持细胞和生物体稳态的核心分子途径，几乎存在于所有真核细胞中。自噬参与生长发育调节、维持干细胞自我更新潜力和细胞分化[16]。细胞自噬功能障碍会导致疾病和肿瘤发生。在神经退行性疾病中，自噬增加导致神经细胞受损，神经突缩短，损害神经元，相反，抑制自噬可以保护神经突缩短或变性[17]。自噬在肿瘤中具有双重作用，自噬既可以抑制肿瘤增长又能促进肿瘤生成。近期研究表明，在甲状腺癌细胞系中，抑制自噬可消除甲状腺癌症干细胞活力，同时减少细胞迁移和侵袭[18]。自噬增强了胃癌细胞的恶性生物学行为，促进肿瘤生长[19]，自噬还通过增强肿瘤细胞的迁移率和抗性来增加肿瘤细胞的化疗耐药性和转移性[20]。相反，在头颈癌中，自噬相关蛋白Beclin 1表达增加可能会激活自噬并抑制肿瘤发生[21]。本研究结果表明，敲低TFRC可抑制宫颈癌细胞自噬，进而抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移能力，细胞周期阻滞在G2/M期。

AKT/mTOR信号通路和MAPK/ERK通路都参与调节包括自噬、细胞周期调节、癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡等多个细胞过程[22] [23]。MAPK级联反应是参与调节正常细胞增殖、存活和分化的关键信号通路，ERK是MAPK信号通路的下游组分[24]。mTOR作为细胞生长信号传导和增强蛋白质翻译的中心元件，ERK介导的Bcl-2磷酸化以及抑制mTOR均可诱导细胞自噬[25]。已有文献证实，MAP4K4通过抑制PI3K-AKT-mTOR通路和激活MAPK/ERK通路介导SOX6诱导宫颈癌细胞自噬[26]。本研究检测了ERK/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达，结果提示敲低TFRC后明显降低p-ERK、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平，说明TFRC抑制宫颈癌Hela细胞自噬可能是通过抑制ERK/AKT/mTOR信号通路调控。

综上所述，TFRC是宫颈癌细胞的促进因子，敲低TFRC可以抑制宫颈癌细胞自噬，进而抑制其增殖、迁移，为靶向TFRC联合自噬治疗宫颈癌提供新方向。但本研究仍不全面，还需加入相关通路激动剂来观察细胞功能及自噬相关蛋白表达变化，进一步完善其分子机制。

基金项目

青岛市市南区科技计划项目(2020-2-019-YY)。

NOTES

^*通讯作者。