Toll样受体在脑卒中疾病中的研究进展

Research Progress of Toll-Like Receptors in Stroke Disease

摘要: 脑卒中是危害人类健康的首要杀手，它具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率、高经济负担5大特点，为患者及家庭带来严重负担。脑缺血后的炎症反应是加重神经功能损伤的病理机制之一。Toll样受体在炎症反应中发挥重要作用，近年来已成为人们关注和研究的焦点之一。文章就Toll样受体在脑卒中导致的缺血损伤过程中的炎症反应研究做一综述，旨在为Toll受体在脑缺血损伤病理机制中作用的进一步研究和治疗药物靶点的确定提供参考。

Abstract: Stroke is the main killer of human health. It has five characteristics: high morbidity, high mortality, high disability rate, high recurrence rate and high economic burden, which brings serious burden to patients and families. The inflammatory response after cerebral ischemia is one of the pathological mechanisms that aggravate nerve function injury. Toll-like receptors play an important role in inflammatory response and have become one of the focuses of attention and research in recent years. This article reviews the study on the inflammatory response of Toll-like receptors in ischemic injury caused by stroke, aiming to provide reference for further study on the role of Toll-like receptors in the pathological mechanism of ischemic injury and identification of therapeutic drug targets.

1. 引言

“脑卒中”又称“中风”，包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中，是一种脑血管疾病，它的病因是脑部血管突然破裂或阻塞导致血液不能流入大脑，进而引起脑组织的损伤[1]。作为常见的脑血管疾病，脑卒中在我国的发病率持续上升，每年的新发病例约占全球的四分之一。尤其是缺血性脑卒中，在我国40岁及以上的人群中发病率约占所有卒中类型的86.8% [2]。研究发现，在脑卒中发生后的一系列病理生理过程中，神经炎症是导致神经损伤的重要因素之一[3]。之前的研究表明，病原相关分子模式激活多种模式识别受体，其中Toll样受体(Toll-like receptor, TLRs)在脑卒中后被激活，启动炎症级联反应，通过识别外源性病原体相关分子模式和内源细胞损伤相关分子模式来激活一系列先天免疫反应[4]。在脑卒中的发生、发展过程的各个时期，TLRs信号发挥着重要作用，它可以触发炎症反应，阻止进一步的炎症进程，从而发挥干预作用。研究表明，抑制TLRs可以在一定程度上减少血管炎症和动脉粥样硬化斑块的形成进而减慢疾病的进展[5]。因此，明确TLRs在脑卒中过程中的发生发展机制，寻找药物治疗靶点在该领域有着重要价值，可为脑卒中的诊断、治疗及促进预后提供思路。

2. Toll样受体简介

TLRs的发现源于对果蝇Toll基因的鉴定，该基因在果蝇免疫系统中起着至关重要的作用[6]。1998年，第一批拥有Toll基因的哺乳动物同源物被鉴定出来，这些受体被命名为“Toll样受体”[7]。这些受体从受损细胞中识别保守的PAMPs或内部分子，并激活先天免疫反应。迄今为止，在哺乳动物物种中共鉴定出13种TLRs，人类细胞中已经发现了10种TLRs (TLR1~TLR10)，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10表达在细胞表面，并都有胞外的结构域，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9表达在胞内，它们位于内质网、内体和溶酶体中[8]-[10]。Toll样受体是一种能够参与天然免疫的Ⅰ型跨膜模式识别受体，主要由胞外区、跨膜区和胞内区三个功能区构成。它通过识别PAMPs在固有免疫和适应性免疫中发挥关键作用[11]。TLRs介导的信号通路主有两条，即MyD88 (myeloid differentiation factor 88, MyD88)依赖性通路和TRIF依赖性通路，启动免疫反应最常见的信号通路是MyD88依赖性通路[12]。TLRs经MyD88信号传导途径激活后，介导IL-1受体相关激酶磷酸化，识别肿瘤坏死因子受体相关因子6，激活NF-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)信号通路，增加促炎基因的转录及表达，导致肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素1β (IL-1β)和白细胞介素6 (IL-6)等炎性因子释放，加重炎症反应[13]。而TRIF对NF-κB的激活并不依赖于MyD88，TRIF依赖性通路的激活导致受体相互作用蛋白RIP1和TRAF6向受体募集，泛素受体蛋白TAB2识别被多泛素链修饰后的RIP1促进INF诱导基因的表达[14]。

3. TLRs与脑卒中

脑卒中被认为是现代危害人类生命健康的常见疾病之一，而神经炎症在脑卒中损伤的病理过程中发挥重要作用。脑卒中引起的神经功能受损是一个复杂的动态过程，包括一系列炎性信号通路的激活及炎性细胞因子的参与。TLRs是神经炎症反应的重要受体之一，可在缺血或出血性脑损伤过程中引起级联反应[15]。研究表明，TLRs在脑缺血再灌注损伤的病理过程中起重要作用，TLR2和TLR4介导的NF-κB信号通路激活参与急性缺血性脑卒中后继发性脑损伤[16]。TLR3介导的TRIF (Toll/IL-1 receptor domain containing adaptor inducing IFN-β)信号通路通过募集TRIF蛋白，激活关键转录因子IRF3参与脑缺血后炎症抑制的过程，显著减轻缺血性脑损伤[17]。TLR7/8受体的激活与细胞毒性T细胞反应、免疫抑制细胞以及参与炎症的基因如促炎细胞因子(TNF-α, IL6)和I型干扰素(IFN)的上调有关[18]。TLR9定位于胞浆的内体膜上，它可以被来自病原体的非甲基化CpG DNA激活，也能被组织损伤后产生的DNA片段激活，例如在线粒体受损后释放的线粒体DNA可以作为TLR9的配体激活TLR9，在缺血性损伤等非感染性炎症的病理生理过程中发挥重要作用[19]。Toll受体家族成员众多，而近年来研究者们对Toll受体与脑卒中的相关性研究多集中在Toll2/4以及Toll3上，因此本文重点论述以上3种受体与脑卒中的研究进展。

3.1. Toll2与脑卒中

TLR2在神经胶质细胞、神经元和内皮细胞中均有广泛的表达，通过识别和结合广泛的微生物成分如脂肽、脂膜酸等，激活先天免疫系统，参与机体炎症反应和免疫应答[20]。脑组织缺血或出血缺氧后，TLR2与炎症通路受体相结合，介导炎症通路加速促炎因子释放，使脑损伤加重[21]。TLR2-MyD88信号通路可激活丝裂原活化蛋白激酶，诱导基质金属蛋白酶-9表达上调，损伤脑血管屏障[13]。Jaber等人的病例对照研究表明：相比于对照组而言，TolL样受体2在急性缺血性脑卒中患者组体内有更高的表达水平，而Toll样受体2过表达可增加急性缺血性脑卒中的严重程度[22]。P Josić Dominović等人对TLR2缺陷小鼠和表达TLR2的野生型小鼠进行大脑中动脉闭塞以实现缺血性损伤，随后进行磁共振成像，利用Z-DEVD-氨基荧光素检测中风后28天小鼠脑细胞凋亡的范围，发现TLR2缺陷小鼠的中风后细胞凋亡低于表达TLR2的野生型小鼠，这提示了TLR2过表达在缺血性卒中中的负作用[23]。

3.2. Toll3与脑卒中

TLR3在体内识别配体后寡聚化，招募含有Toll-interleukin-1结构域的接头分子1 (TICAM-1)，触发NF-κB、β-连环蛋白、IRF3、AP-1的产生，从而导致干扰素的分泌以及招募适应性免疫反应发生。它还可能涉及决定细胞周期，调节发育阶段的间充质干细胞[24]。Jeong等人利用雄性Wistar大鼠构建了大脑中动脉单丝闭塞致暂时性局灶性脑缺血的模型，测量梗死体积及小胶质细胞中Toll样受体3mRNA表达水平，结果发现TLR3的激活减少了实验组小鼠的梗死体积，这表明小胶质细胞中的TLR3信号可能有助于脑缺血损伤的神经保护[25]。李等人采用实时荧光定量PCR法检测缺血性脑卒中患者及健康志愿者体内单个核细胞TLR3发现：缺血性脑卒中患者体内TLR3水平明显升高，TLR3 mRNA的表达水平同NISS评分及脑梗死的体积呈正相关，且同其下游的IRF-3和IFN-g mRNA水平的关系也呈现正相关，这提示了缺血性脑卒中患者体内的TLR3可能通过调节IRF和IFN-g进而参与神经功能损害的过程[26]。后来，胡等人利用动物实验在小鼠脑组织中发现栝楼桂枝汤可能通过促进TLR3信号通路的激活来抑制促炎因子的分泌，同时也可促进抗炎因子的合成，进而维持炎症稳态，此过程有效缓解了脑卒中后的过度炎症反应以及减轻运动神经元损伤，最终改善卒中后痉挛持续状态[27]。因此，Toll样受体3在缺血性脑卒中的作用可能是双向的，既促进了炎症反应的发生，又通过调节相关信号通路保护神经功能，但还需更进一步的研究来证实。

3.3. Toll4与脑卒中

Toll样受体4是一种I型跨膜糖蛋白受体，它在机体炎症反应过程中同样发挥重要作用，TLR4可通过髓样分化因子88依赖的信号通路启动一系列促炎基因、细胞表面分子和趋化因子的表达[28]。在急性缺血性脑卒中的炎症反应过程中，抑制TLR4/NF-κB信号的激活可降低炎性因子的表达，进而增强抗氧化活性，减轻脑组织炎症和氧化应激损伤，改善急性脑卒中患者神经功能[29]。Violeta等人使用髓细胞中不表达TLR4的小鼠及其相应的对照组构建脑中动脉闭塞致局灶性脑缺血模型，发现中性粒细胞TLR4缺失小鼠的梗死体积比对照组小鼠小。这表明TLR4在生理条件下特异性参与中性粒细胞动力学和脑卒中引起的组织损伤，TLR4可能是神经保护策略的潜在靶点[30]。Donya等人利用大鼠脑中动脉闭塞模型再灌注后静脉注射人羊膜间充质干细胞(hAMSC-CM)，结果显示海马区TLR4/NF-κB水平显著降低。而且海马CA1区组织损伤和神经元损伤细胞增加时，经hAMSC-CM处理后该结局可逆转。他们的研究表明hAMSC-CM可以通过降低TLR4/NF-κB信号通路的活性来减轻缺血性卒中后的脑组织损伤[31]。

4. Toll受体调节剂

Toll受体在脑缺血再灌注损伤的病理过程中发挥重要作用，不少学者认为Toll受体相关的调节剂可抑制脑卒中过程中该受体介导的炎症细胞因子、趋化因子通路，减少脑缺血再灌注损伤，改善神经功能[32]。Zhou等人发现tFNA (四面体骨架核酸)可以抑制由氧-葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)触发的钙过载和ROS再生，还可下调TLRs/NF-κB信号通路，从而对星形胶质细胞凋亡提供保护作用，促进星形胶质细胞从促炎M1表型向神经保护M2表型的极化，进而减轻了脑梗死体积，促进中枢神经功能的恢复，这可能是tFNA保护脑卒中星形胶质细胞的潜在机制[33]。ApToll是一种TLR4拮抗剂，在卒中临床前模型中具有神经保护作用。2023国际卒中大会(ISC2023)上，Hernández与其搭档提出ApToll的抗炎作用与高水平的脑保护有关，在临床前研究中可将梗塞体积减少高达65% [34]。Saeedeh等人的研究表明骨化三醇可在脑缺血24小时后调节TLR4/NF-kβ信号通路，减少TLR4/NF-κB激活的级联反应，在减少和改善缺血性中风患者的症状方面发挥有益作用[35]。Wang的团队利用大鼠构建脑卒中性肾血管性高血压(RHRSP)模型，通过颅内注射TLR2和TLR4拮抗剂，发现TLR4和TLR2拮抗剂经过PI3K/Akt/GSK3β通路实现对RHRSP的保护作用。此外他们还进行了体外实验，发现TLR4和TLR2拮抗剂可增加细胞活力，抑制细胞凋亡，并降低p-Akt和p-GSK3β表达，而PI3K抑制剂导致TLR4和TLR2拮抗剂的抗凋亡和抗炎作用降低[36]。TLRs靶向治疗较多的临床应用主要是在肿瘤和感染性疾病领域[37] [38]，但越来越多的研究证据表明，TLRs在脑卒中过程中发挥重要作用，选择性靶向TLRs治疗很可能成为一个有前景的脑卒中治疗方案。

5. 总结与展望

自从90年代研究人员发现TLRs以来，人们对其家族成员、分子结构、信号通路及其在疾病的发生发展过程中的重要作用机制进行了深入研究。TLRS家族成员可以激活免疫信号通路促进机体免疫，但也介导了炎症信号通路导致机体损伤。从目前的研究来看，脑卒中疾病多与TLR2、TLR3、TLR4密切相关。TLR2和TLR4主要通过MyD88通路进行信号转导，MyD88的激活诱导IRAKs磷酸化募集TAK1。TAK1激活下游途径进一步诱导促炎因子的表达。TLR3主要通过TRIF依赖的方式激活NF-κb，进而促进一系列炎症反映的发生。TLRs与脑卒中的关系研究目前多集中在TLR2、TLR3和TLR4且多是动物实验研究，另外由于TLRs家族成员分型较多，仍有一些TLRs的信号通路及在生理病理过程中的功能作用未被揭示，因此明确TLRs在脑卒中疾病中的生理病理反应过程的作用机制，有利于为脑卒中疾病的治疗提供新药研究的靶点和思路。未来的研究也应聚焦于这些TLRs在体内的信号通路及TLRs家族成员之间的相互作用，利用调节剂之类的药物调控其发生发展过程，减轻神经系统损伤，促进人类的身心健康。

NOTES

^*通讯作者。