摘要: 目的：利用网络药理学探究栀子生姜豉汤治疗心脏神经官能症(Cardiac neurosis, CN)的作用机制。方法：利用TCMSP检测栀子生姜豉汤的活性成分；通过GeneCards、OMIM数据库获取与CN相关的靶点；取栀子生姜豉汤与CN交集靶点；运用Cytoscape软件建立“药物–活性成分–靶点”的调控网络；运用STRING数据库构建蛋白质互作(PPI)网络图；利用Metascape平台进行GO和KEGG富集分析。结果：栀子生姜豉汤治疗CN的主要活性成分包括槲皮素、
β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇等。核心靶点有TP53、AKT1、ESR1、MAPK1、IL6、TNF、IL1B、EGFR、CASP3等。KEGG分析主要涉及脂质和动脉粥样硬化通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲状腺激素信号通路通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性通路等184条信号通路。结论：栀子生姜豉汤通过多成分、多靶点、多通路治疗心脏神经官能症，为临床的CN治疗及新药的研究提供了新的思路。
Abstract:
Objective: To investigate the mechanism of action of Gardenia Sangjang Dangdang Tang in the treatment of Cardiac neurosis (CN) using network pharmacology. METHODS: The active ingredients of Gardenia Sangjang Dangdang Tang were detected by TCMSP; the targets related to CN were obtained by GeneCards and OMIM database; the intersection targets of Gardenia Sangjang Dangdang Tang and CN were taken; the regulatory network of “drug-active ingredient-target” was established by Cytoscape software; and protein interactions (PPI) were constructed by STRING database; the PPIs were also investigated by network pharmacology. STRING database was used to construct the protein-protein interaction (PPI) network map; Metascape platform was used for GO and KEGG enrichment analysis. RESULTS: The main active ingredients of Gardenia, Ginger, and Black Bean Soup for CN include quercetin, β-sitosterol, kaempferol, and stigmasterol. The core targets were TP53, AKT1, ESR1, MAPK1, IL6, TNF, IL1B, EGFR, CASP3, etc. KEGG analysis was mainly involved in 184 signaling pathways such as lipid and atherosclerosis pathway, AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications, thyroid hormone signaling pathway pathway, and EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance pathway. Conclusion: Gardenia, ginger, and black bean soup provides new ideas for clinical CN treatment and research of new drugs through multi-component, multi-target, and multi-pathway treatment of cardiac neurosis.
1. 引言
心脏神经官能症(Cardiac neurosis, CN)又被称为心血管神经症，是一种没有器质性心脏病变的临床综合征，主要表现为心悸、胸闷气短、呼吸不畅、心前区疼痛不适等症状，常伴随有焦虑、双手震颤、失眠、多汗等自主神经功能紊乱的情况，且症状轻重与情绪波动有着密切的关系[1]。本病好发于青中年人群，20~40岁者最多，女性多于男性，尤多见于更年期妇女，约占心血管疾病的10% [2]。西医对于心脏神经官能症的治疗，多以心理治疗为主，抗焦虑、抑郁治疗为辅，对症处理相应症状，干预危险因素，虽然缓解了症状，但长期服药易引起药物依赖性，还易引起性功能障碍、肝肾功能受损等药物副作用，引起病情复发，给患者的日常生活带来很大不便[3]。一般而言，中药相对来说，副作用更小，且能改善患者远期预后，疗效甚佳。通过总结治疗心脏神经官能症的相关中医药文献，并结合临床治疗经验，发现栀子生姜豉汤对此病疗效显著，但作用机制尚不明确，故而本研究通过观察栀子生姜豉汤治疗CN的网络药理学研究，探究其作用机制，现将研究结果报道如下。
2. 资料与方法
2.1. 筛选栀子生姜豉汤的活性成分及预测靶点基因
以“栀子”“生姜”“淡豆豉”作为关键词，在TCMSP数据库中进行检索，设置OB ≥ 30%；DL ≥ 0.18，预测得到活性成分及靶点基因。使用Uniprot数据库进行检索，设置物种为“Homo sapiens”，状态为“已证实”，将上述得到的活性成分的靶点基因进行标准化处理，并将所得结果合并，删除重复项后得到对应的药物靶点基因。
2.2. 获取心脏神经官能症相关靶点
以“Cardiac neurosis”、“Cardiac Neuroses”、“Cardiac Phobia”、“Effort Syndrome”、“Hyperkinetic Heart Syndrome”、“Neurocirculatory Asthenia”作为关键词，通过对GeneCards数据库和OMIM数据库的检索，将两者获取的基因取并集，对基因名称进行规范化处理，删除没有Uniprot标识符或重复的靶点，以获得综合的心脏神经官能症相关的致病靶点。
2.3. 构建中药–成分–疾病靶点的网络
在微生信平台，将药物靶点和疾病靶点取交集，得到栀子生姜豉汤治疗CN的作用靶点，并绘制韦恩图，使用Cytoscape3.10.2软件构建中药–成分–疾病靶点的网络调控图。
2.4. 构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络并筛选核心靶点
将上述得到的交集靶点导入STRING数据库中，设置最低相互作用分数值为0.9，其他默认设置，隐藏离散点，即得到构建好的PPI网络图。导出图片，将生成的TSV文件导入Cytoscape3.10.2软件，利用CytoNCA插件对网络进行拓扑分析，并得到网络中的核心靶点。
2.5. GO富集分析与KEGG通路分析
将经PPI筛选后的关键靶点导入Metascape平台，进行GO富集分析与KEGG通路分析，导出分析结果，按照Count值进行降序排列，用微生信平台进行可视化分析，以研究栀子生姜豉汤治疗CN所参与细胞内的生物过程、分子功能、细胞结构以及涉及的分子通路。
3. 结果
3.1. 栀子生姜豉汤活性成分及潜在靶点基因
检索TCMSP平台，一共得到有关栀子生姜豉汤的15个活性成分。将上述药物活性成分作用靶点去除重复项后，共得到栀子生姜豉汤活性成分对应的潜在靶点共114个。
3.2. CN相关致病基因及构建疾病-药物交集靶点韦恩图
对GeneCards、OMIM数据库进行检索后，总共得到CN的致病基因16,177个。在微生信平台上，获得中药活性成分的靶点基因与疾病相关致病基因的交集基因，共得到栀子生姜豉汤干预CN的潜在靶点共113个，见图1。
3.3. 构建中药-活性成分-疾病靶点网络
使用Cytoscape3.10.2软件对交集靶点进行分析，得到“中药–活性成分–靶点”网络图，见图2。这个网络包含了131个节点和297条边。图形越大，意味着该活性成分在网络中发挥主要作用。其中浅绿色圆形对应中药，粉色八边形对应栀子的活性成分，红色八边形对应生姜的活性成分，浅紫色八边形对应淡豆豉的活性成分，浅黄色六边形(A1, A2)对应栀子和生姜共有的活性成分，菱形对应药物和疾病的交集基因，利用Analyze Network对网络进行分析，度值越高，节点越大，表明与疾病的治疗越相关，得出Degree值排名前5的活性成分包括槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、伞房花耳草素，其中β-谷甾醇、豆甾醇是栀子和生姜共有的活性成分。
Figure 1. Wayne’s diagram of gardenia, gardenia, ginger and black bean soup active ingredient-CN intersection targets
图1. 栀子生姜豉汤活性成分–CN交集靶点韦恩图
Figure 2. Network diagram of “traditional Chinese medicine-active ingredient-target”
图2. “中药–活性成分–靶点”网络图
3.4. 栀子生姜豉汤-心脏神经官能症PPI网络构建及筛选核心靶点
在STRING数据库中对图1交互得到的113个潜在靶点进行了PPI分析，获得PPI网络见图3。在Cytoscape3.10.2软件中，将PPI网络对应的TSV文件开展可视化分析，得到图4，它包含了92个节点，节点对应蛋白，还囊括了267条边，线条意味着蛋白之间存在联系，选择CytoNCA插件对其进行分析，得到每个节点对应的Degree值。根据Degree值将92个关键靶点进行降序排列，按照大小调整位置，绘制成关键靶点图，并把排名前13的靶点(TP53、AKT1、ESR1、MAPK1、IL6、TNF、IL1B、CCND1、RELA、EGFR、MYC、BCL2和CASP3)作为栀子生姜豉汤治疗CN的核心靶点，见图4。
Figure 3. PPI network diagram of Gardenia gardenia, ginger and black bean soup-cardiac neurosis
图3. 栀子生姜豉汤–心脏神经官能症的PPI网络图
节点越大颜色越深，代表节点在基因互相作用网络中越重要
Figure 4. Gardenia gardenia, ginger, black bean soup- CN key target PPI visualization and core target network map
图4. 栀子生姜豉汤–CN关键靶点PPI可视化分析图及核心靶点网络图
3.5. GO生物功能富集分析
对栀子生姜豉汤干预CN的潜在机制做进一步探究，在Metascape平台中，将上述筛选后的92个关键靶点进行GO生物功能分析，共得到GO富集结果1620条，包括三部分，分别为生物过程(BP) 1419条、细胞组成(CC) 63条及分子功能(MF) 138条，并把各项中排名前10的数据在微生信平台上进行可视化，见图5。其中BP主要涉及细胞对氮化合物、异源性刺激、炎症、脂质、氧气水平的反应，细胞群增殖的负调控，凋亡信号通路的调控等；其中CC主要包含膜筏、转录调节因子复合物、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、丝氨酸型肽酶复合物等；其中MF主要涉及RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、蛋白质结构域特异性结合、细胞因子受体结合、G蛋白偶联胺受体活性、雌激素16-ɑ-羟化酶活性、丝氨酸水解酶活性等。
Figure 5. GO biofunctional enrichment analysis
图5. GO生物功能富集分析
3.6. KEGG通路富集分析
同样在Metascape平台进行KEGG通路富集分析，共得到184条富集通路，P值从小到大取排在前20条通路在微生信平台上进行可视化，见图6。图中气泡颜色代表P值，大小代表基因的数量。其中通路主要包括癌症通路、脂质和动脉粥样硬化通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、化学致癌作用-受体激活通路、人T细胞白血病病毒1型感染通路、甲状腺激素信号通路、铂类耐药性通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性通路等。
Figure 6. KEGG pathway enrichment analysis
图6. KEGG通路富集分析
4. 讨论
栀子生姜豉汤出自《伤寒论》第76条，原文中曾说道：“……发汗吐下后，虚烦不得眠，若剧者，必反复颠倒，心中懊恼，栀子豉汤主之；……若呕者，栀子生姜豉汤主之。”此条文讲的是，太阳病汗吐下后变证，疾病未痊愈，病人自觉心胸中闷热，莫可名状，因此烦躁不安，辗转反侧。只因无形邪热郁扰胸膈，属于虚烦，应当用栀子豉汤清宣郁热，此方中栀子味苦性寒，清泄邪热，臣以豆豉轻清宣透，除热去烦，郁热犯胃上逆而成呕，故加生姜用以和胃降逆止呕[4]。心在五行中属火，心为阳中之阳，心主神明，故而火热内炽会导致心病，扰动心神，火热被遏，伏于体内，当以清热发汗、解郁安神，故栀子生姜豉汤是仲景用“火郁发之”思想治疗热郁胸膈心病的经典方剂之一[5]。
根据“中药–活性成分–靶点”网络研究表明，栀子生姜豉汤治疗CN的活性成分主要包括槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇等。有研究证实，槲皮素具有预防内皮功能紊乱、降压、降血脂、抗炎、抗血小板聚集、抑制细胞凋亡和双重调节免疫的作用，能通过抑制MAPK途径的激活，从而逆转氧化和内质网应激引起的心肌损伤[6]。β-谷甾醇可通过下调IL-1β、IL-6和TNF-α水平来降低炎症反应；通过下调ERK1/2，上调Bcl-2/Bax来抑制心肌细胞凋亡[7]。山柰酚能够降低心肌梗死大鼠CK-MB和cTnI水平，提高射血分数水平，可通过下调PARP-1表达，抑制炎症因子活性，减轻心梗后心肌损伤，改善心功能障碍，从而起到保护心功能的作用[8]。豆甾醇可通过调节雌激素信号通路干预MAPK3、PRKACA的mRNA和蛋白表达，调控细胞因子的释放，发挥抗炎的作用[9]。此外，豆甾醇还能逆转线粒体脂质过氧化的增加，影响CASP3和CASP9的表达，降低严重细胞损伤，减少过多细胞凋亡[10]。上述研究表明，这些主要活性成分可能是通过氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等方面来起到治疗CN的作用。
根据PPI网络分析显示，度值较高的靶点主要有TP53、AKT1、ESR1、MAPK1、IL6、TNF、IL1B、CCND1、EGFR、CASP3等，表明这些靶点可能是栀子生姜豉汤治疗CN的核心靶点。有研究显示[11]，血清肿瘤蛋白P53 (TP53)是一种重要的抑癌基因，并在细胞周期中发挥关键作用，其在动脉粥样硬化组织中呈明显高表达，在ACS发病机制中发挥作用，可用于评估ACS患者PCI术后预后。AKt1主要参与细胞生长、增殖和葡萄糖代谢等过程，又可参与癌症的发生[12]。IL-6和TNF是重要的炎症因子，可介导各种炎性递质，其浓度高于阈值，会导致心血管不良事件的发生[13]。EGFR是表皮生长因子受体，它活性的抑制是治疗高血压、心脏肥大和腹主动脉瘤等疾病的潜在治疗策略，在介导血管重塑中起着关键作用[14]。
KEGG通路富集分析表明，栀子生姜豉汤可能主要通过癌症通路、脂质和动脉粥样硬化通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲状腺激素信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性通路等对CN进行作用。AGE是晚期糖基化终产物，能与AGE受体(RAGE)结合，进而产生细胞内活性氧(ROS)，刺激细胞内多种信号分子，导致炎症和促纤维化细胞因子的产生，是导致动脉粥样硬化和心血管疾病的途径[15]。血脂的沉积，血管内皮的受损，再加上外源性物质带来的炎症刺激，这些都会引起动脉粥样硬化，从而导致血管管腔狭窄，促进炎症和氧化应激的发生，进一步引发心血管事件[16]。有研究表明[17]，甲状腺激素，特别是生物活性T3，主要通过调节编码离子通道、收缩蛋白和结构蛋白的心脏基因转录，维持心脏横管的结构和功能。此外，恢复甲状腺激素的功能还能改善心力衰竭或心肌梗死患者的心室重塑和收缩功能，减轻临床症状和改善预后，减少心血管疾病发生的风险。
根据该研究结果，结合前人经验，栀子生姜豉汤可能通过槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇等多种活性成分，通过细胞对外源性刺激、脂质、氧化应激、炎症的反应和对细胞凋亡的调控、对细胞增殖的负调节等多个生物过程，经过脂质和动脉粥样硬化通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲状腺激素信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性通路等多个通路对CN发挥作用，同时栀子生姜豉汤中有多种成分还具有抗肿瘤、抗病毒感染的作用，体现异病同治的特点。总之，该研究为中医药治疗CN提供一定的理论基础，但仍存在一定的局限性，栀子生姜豉汤治疗CN的具体分子机制还需要基础实验和临床研究进一步验证。
NOTES
*通讯作者。