健神利水方对脑出血大鼠p38 MAPK表达的影响

Effect of Jianshen Lishui Decoction on p38 MAPK Expression in Rats with Cerebral Hemorrhage

摘要: 目的：探究健神利水方对脑出血大鼠p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-Activated Protein Kinase, p38 MAPK)表达的影响。方法：将50只SD大鼠随机分为假手术组(n = 10)和脑出血模型组(n = 40)，采用胶原酶制作脑出血大鼠模型，假手术组以等量生理盐水代替胶原酶造模；造模成功后，脑出血模型组随机均分为脑出血组(n = 10)、健神利水方低剂量组(n = 10)、健神利水方中剂量组(n = 10)及健神利水方高剂量组(n = 10) 4个组。其中，假手术组和脑出血组以等量生理盐水灌胃，健神利水方低、中、高剂量组分别以等量低、中、高剂量健神利水方灌胃，连续灌胃7天；采用Longa评分法对大鼠的神经功能进行评分；取大鼠脑组织，采用蛋白免疫印迹法(Western Blot, WB)检测p38 MAPK表达，采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测大鼠脑组织p38 MAPK的mRNA表达水平。最后用统计软件SPSS 25.0对数据进行统计分析。结果：脑出血组较假手术组Longa评分、p38 MAPK、p38 MAPK的mRNA表达水平均显著升高(均P < 0.01)；低剂量组较脑出血组Longa评分、p38 MAPK、p38 MAPK的mRNA表达水平均升高(均P < 0.05)；中剂量组较低剂量组p38 MAPK、p38 MAPK的mRNA表达水平均升高(均P < 0.05)；高剂量组较中剂量组p38 MAPK、p38 MAPK的mRNA表达水平均升高(均P < 0.05)。结论：健神利水方能有效改善脑出血大鼠的神经损伤症状，其作用机制与抑制p38 MAPK的表达相关。

Abstract: Objective: To explore the effect of Jianshen Lishui decoction on the expression of p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (p38 MAPK) in rats with cerebral hemorrhage. Methods: Fifty SD rats were randomly divided into sham operation group (n = 10) and cerebral hemorrhage model group (n = 40). The cerebral hemorrhage rat model was made with collagenase, and the sham operation group was made with the same amount of normal saline instead of collagenase. After the successful modeling, the cerebral hemorrhage model group was randomly divided into 4 groups: cerebral hemorrhage group (n = 10), Jianshen Lishui decoction prescription low-dose group (n = 10), Jianshen Lishui decoction prescription medium-dose group (n = 10) and Jianshen Lishui decoction prescription high-dose group (n = 10). Among them, sham operation group and cerebral hemorrhage group were given the same amount of normal saline, while Jianshen Lishui decoction prescription low-, medium- and high-dose groups were given the same amount of low-, medium- and high-dose of Jianshen Lishui decoction prescription, respectively, for continuous 7 days. The neural function of rats was evaluated by Longa score. The expression of p38 MAPK in rat brain tissues was detected by Western Blot (WB), and the mRNA expression level of p38 MAPK in rat brain tissues was detected by Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Finally, statistical software SPSS 25.0 was used to analyze the data. Results: Compared with sham operation group, Longa score, p38 MAPK and p38 MAPK mRNA expression levels in cerebral hemorrhage group were significantly increased (all P < 0.01). Compared with cerebral hemorrhage group, Longa score, p38 MAPK and p38 MAPK mRNA expression levels in low-dose group were increased (all P < 0.05). The mRNA expression levels of p38 MAPK and p38 MAPK in medium dose group were increased compared with those in low dose group (all P < 0.05). The mRNA expression levels of p38 MAPK and p38 MAPK in high-dose group were higher than those in medium-dose group (all P < 0.05). Conclusion: Jianshen Lishui decoction can effectively improve the symptoms of nerve injury in rats with cerebral hemorrhage, and its mechanism is related to inhibiting the expression of p38 MAPK.

1. 引言

脑卒中为人类健康第二杀手，也是我国人口重要死因[1]-[4]。它是指脑内血管破裂，导致血液在脑实质内聚集[5]，作为脑卒中第二高发病率类型，约占所有中风的10%至20% [6]，但致残率和致死率高，报告的病死率从1个月时的约10%到3个月时的25%和1年时的30%不等，约有一半的脑出血患者在1个月和3个月时死亡或残疾，并且这一比例在1年内略有下降[7]-[11]。全国性的研究和定期的政府报告表明，中风的负担很高，而且还在不断增加[12] [13]，中国每年治疗脑血管病的费用高达200亿元，为患者家庭乃至全社会造成了沉重的经济负担。研究证实[14]-[16]，中药通过多靶点、多途径的方式治疗脑出血，起到减轻血脑屏障破坏、减少脑水肿、改善神经功能障碍、减少神经细胞凋亡等作用。p38 MAPK作为p38 MAPK通路中的关键蛋白，在脑出血后炎症产生及细胞凋亡中起重要作用，为脑出血治疗研究的热点。我们前期的研究证实[14] [15]，健神利水方在脑出血治疗中起减少炎症反应、减轻脑水肿、减少细胞凋亡、改善神经功能损伤的作用。为了深入研究其炎症反应机制，本项目拟构建脑出血模型，观察健神利水方对脑出血大鼠p38 MAPK表达的影响，具体汇报如下。

2. 资料与方法

2.1. 实验动物与材料

清洁级别健康10月龄雌性SPF级大鼠50只，采购来源于长沙市天勤生物技术有限公司(许可证号：SCXK湘2019-001)。实验材料：p38 MAPK抗体，Western blot一抗稀释液(biosharp, lot: 70015829)，胶原蛋白酶(美国Sigma公司，lot: C0130)，内参Antin (biosharp, lot: 69070015)，ECL化学发光试剂盒(biosharp, lot: 69070015, BL523A)，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5X (biosharp, lot: 69078121c)。健神利水方组成：丹参15 g，猪苓15 g，茯苓15 g，泽泻10 g，白术10 g，三七粉3 g，桂枝6 g，来自一方药业有限公司。实验器械：脑立体定位仪(江苏赛昂斯生物科技有限公司，SA301)，5 μL、100 μL微量注射器，组织研磨仪(上海净信实业发展有限公司，型号：KZ-Ⅱ)，电子分析天平(上海右一仪器有限公司，型号BSA124S)，发光凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司，型号：1708280)。

2.2. 研究方法

2.2.1. 脑出血大鼠模型

脑出血模型：实验大鼠术前4 h禁水禁食。使用剂量为45 mg/kg的3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠。麻醉成功后，将大鼠放置于立体定位仪上，确保前囟和后囟处于同一水平面。然后，在前囟后1毫米、右侧3毫米的位置(即为右侧尾状核的位置)钻一个直径约为1毫米的小孔。使用立体定位仪上的微量注射器进针6毫米，在10分钟内注射0.5单位的胶原酶Ⅶ。注射结束后停针5分钟，然后缓慢退针。假手术模型：建立方法与胶原酶脑出血模型相同，只是使用等量的生理盐水替代胶原酶。

2.2.2. 分组及造模

实验动物和分组：取50只10月龄的成年雄性SD大鼠，体重500 ± 35 g，分别两次采用SPSS Statistics 25.0产生随机序列。第一次随机分出假手术组(n = 10，注射等剂量生理盐水)，以及脑出血模型组(n = 40，注射胶原酶制备脑出血模型)。在脑出血模型建立后再次进行随机分组为4个组：脑出血组、健神利水方低剂量组、健神利水方中剂量组及健神利水方高剂量组，每个组10只大鼠。

2.2.3. 干预方法

在造模成功后，假手术组及脑出血组均给予等剂量生理盐水灌胃，健神利水方低、中、高剂量组分别予等剂量低、中、高剂量健神利水方药液灌胃。其中，健神利水方煎成生药量分别为1 g/mL、2 g/mL、4 g/mL的中药药液，参考动物和人体表面积折算的对应等效药物剂量比率表，按照人体的等效量来计算大鼠的给药量。经换算，健神利水方低、中、高剂量组分别以6.25 g/kg、12.50 g/kg、25.00 g/kg的剂量给大鼠灌胃，每天1次，连续7天。治疗结束后，对大鼠神经功能进行评分。评分由两名人员按照双盲原则进行评估。

2.2.4. 取材及处理

在大鼠麻醉后，我们开胸，使用钝头灌注针穿入主动脉，固定针头并剪开心耳。然后，予生理盐水快速进行冲洗，直到流出的液体不再带有血水，且大鼠的上肢变得苍白。接着，我们换用4%多聚甲醛溶液进行心脏灌注固定。在固定过程中，多聚甲醛溶液的注入速度先快后慢，直到大鼠变得僵硬如板状。最后，迅速打开颅腔取出脑组织，并根据免疫印迹法的检测要求制作相应的标本以供保存。

2.3. 观察指标

2.3.1. 神经功能评分

以Longa评分法，对各组大鼠神经功能进行评分：正常为0分；脑出血部位对侧的前肢无法伸展记1分；脑出血部位对侧的前肢屈曲记2分；向脑出血部位对侧轻度转圈记3分；明显向脑出血对侧转圈记4分；爬行时向脑出血对侧倾倒记5分。

2.3.2. 免疫印迹(Western Blot, WB)检测p38 MAPK的表达水平

取各组大鼠一半脑组织放入0.5 mL印迹缓冲液中，并用超声波匀浆。将匀浆后的组织置于1.5 mL离心管中，使用电动组织研磨棒进行研磨。将研磨后的组织加入蛋白裂解液，裂解5分钟后在4℃、1000 rpm离心10分钟，去除沉淀并保留上清液。测量各样本的蛋白质浓度。然后进行电泳，使用8%胶浓度分离，每个泳道加入50 μg蛋白样品。等到溴酚蓝到达分离胶底部后转膜。转膜完成后，将PVDF膜放入含5%脱脂奶封闭液中，室温封闭1小时，然后加入一抗，在4℃孵育过夜。次日使用WB洗涤液洗涤PVDF膜3次后，加入二抗，在室温孵育1小时。再次使用WB洗涤液洗涤PVDF膜3次后加入3 mL化学发光溶液(ECL)，随即进行光敏胶片显像。使用ImagJ图像分析系统测量蛋白信号的灰度值，以Actin作为内参蛋白，并对蛋白相对表达量进行统一处理。

2.3.3. RNA提取与反转录聚合酶链反应(RT-PCR)

取各组大鼠另一半脑组织匀浆，TRIzol法提总RNA，逆转录试剂盒得cDNA。SYBR Green法行PCR扩增，反应条件：95℃，30 s；95℃，5 s；62℃，34 s；40个循环；3个复孔；2-ΔΔCt法计算相对表达量。

2.4. 统计学方法

用统计软件SPSS 25.0进行统计分析正态分布的计量资料，两组组间进行比较，采用t检验，5组组间比较采用方差分析；非正态分布的计量资料组间比较则采用非参数法，以P < 0.05视为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. Longa评分结果

假手术组、模型组和低、中、高剂量实验组的Longa评分分别为0、(3.70 ± 0.95)、(1.90 ± 0.57)、(1.30 ± 0.48)和(1.00 ± 0.00)分。与脑出血组相比，低、中、高剂量组的Longa评分均显著降低(均P < 0.01)。详见表1、图1。

Table 1. Longa scores of rats in each group

表1. 各组大鼠Longa评分

组别	例数(只)	Longa评分(分)
假手术组	10	0
脑出血组	10	3.70 ± 0.95
低剂量组	10	1.90 ± 0.57
中剂量组	10	1.30 ± 0.48
高剂量组	10	1.00 ± 0.00

注：***表示P < 0.01，#表示P > 0.05。

Figure 1. Comparison of Longa scores in each group

图1. 各组大鼠Longa评分比较

3.2. p38 MAPK的免疫印记表达

与假手术组对比，脑出血组大鼠脑组织中p38 MAPK的表达水平显著升高(P < 0.01)，健神利水方低、中、高剂量组大鼠脑组织中p38 MAPK的表达水平均升高(P < 0.05)；与脑出血组对比，健神利水方低、中、高剂量组大鼠的脑组织中p38 MAPK的表达水平均下降(P < 0.05)，其中，高剂量健神利水方组大鼠的脑组织中p38 MAPK的表达水平低于中剂量健神利水方组(P < 0.05)，中剂量健神利水方组大鼠的脑组织中p38 MAPK的表达水平低于低剂量健神利水方组(P < 0.05)。详见表2、图2、图3。

Figure 2. Expression of p38 MAPK in brain tissue of rats in each group

图2. 各组大鼠脑组织中p38 MAPK的表达量

Table 2. Expression level of p38 MAPK in brain tissue of rats in each group

表2. 各组大鼠脑组织中 p38 MAPK的表达水平

组别	例数(只)	p38 MAPK
假手术组	10	0.41 ± 0.09
脑出血组	10	1.01 ± 0.16
低剂量组	10	0.70 ± 0.11
中剂量组	10	0.63 ± 0.10
高剂量组	10	0.55 ± 0.12

注：*表示P < 0.05，***表示P < 0.01。

Figure 3. Comparison of p38 MAPK expression levels in brain tissues of rats in each group

图3. 各组大鼠脑组织中p38 MAPK的表达水平比较

3.3. 各组PCR分析

与假手术组对比，脑出血组大鼠脑组织中p38 MAPK的mRNA表达水平显著升高(P < 0.01)，健神利水方低、中、高剂量组大鼠脑组织中p38 MAPK的mRNA表达水平均升高(P < 0.05)；与脑出血组对比，健神利水方低、中、高剂量组大鼠的脑组织中p38 MAPK的mRNA表达水平均明显下降(P < 0.01)，其中，高剂量健神利水方组大鼠的脑组织中p38 MAPK的mRNA表达水平低于中剂量健神利水方组(P < 0.05)，中剂量健神利水方组大鼠的脑组织中p38 MAPK的mRNA表达水平低于低剂量健神利水方组(P < 0.05)。详见表3、图4。

Table 3. mRNA expression of p38 MAPK in brain tissues of rats in each group

表3. 各组大鼠脑组织中p38 MAPK的mRNA表达量

组别	例数(只)	p38 MAPK
假手术组	10	0.37 ± 0.14
脑出血组	10	1.02 ± 0.17
低剂量组	10	0.64 ± 0.10
中剂量组	10	0.56 ± 0.08
高剂量组	10	0.51 ± 0.11

注：*表示P < 0.05，***表示P < 0.01。

Figure 4. Comparison of mRNA expression of p38 MAPK in brain tissues of rats in each group

图4. 各组大鼠脑组织中p38 MAPK的mRNA表达量比较

4. 讨论

脑出血属于中医领域的“中风”范畴。健神利水方由广西名中医刘泰教授创立，他认为脑出血的病机关键为“脑内蓄血”及“瘀水内阻”[17]，导致神明失司，出现突然昏仆、不省人事；瘀水阻络，气血运行不畅，不能濡养肢体，则半身不遂、肢体麻木、失语。其治法当以利水行瘀为法，故以利水行瘀之经方五苓散为基础，加上丹参和三七，创立了健神利水方。本方以泽泻为君药，取其甘淡直达肾与膀胱，利水渗湿；以茯苓、猪苓为臣，加之淡渗加强利水渗湿之力；佐以白术健脾补气，运化水湿，合茯苓健脾利水；又佐以辛温之桂枝，温阳化气，以助利水；加三七散瘀止血而不留瘀，丹参活血祛瘀，疏通经络。本研究中，健神利水方低、中、高剂量组脑出血大鼠神经功能评分均较脑出血模型组低，且高剂量健神利水方神经功能评分最低，证明健神利水方能有效改善脑出血导致的神经损伤，且高剂量健神利水方效果更佳。

脑出血为常见的神经系统疾病，最常见的病因是高血压合并动脉粥样硬化。脑出血后的损伤机制，包括血肿形成、压迫周围组织加重脑缺血、氧化应激、炎症反应及神经元凋亡等[18]。我们前期研究[14] [15] [17]已经证实，健神利水方能抑制水通道蛋白4的表达，减少脑出血大鼠脑组织含水量，减轻脑水肿，减少神经元凋亡数量，同时可有效降低脑出血患者C反应蛋白、降钙素原水平，减轻炎症反应，改善神经损伤症状。

MAPK是一组分化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包含p38 MAPK、胞外信号调节激酶、c-Jun氨基端激酶和胞外信号调节激酶5 [19]。p38 MAPK通路是其中的促凋亡信号通路，可通过增加c-Myc的表达、诱导BAX转位、磷酸化p53等通路诱导细胞凋亡[20] [21]，同时在轴突的生长、自噬过程、氧化应激以及维持神经元存活等方面扮演着至关重要的角色[22]。在神经系统，p38 MAPK通路可通过多种刺激因素被激活，如神经递质、细胞因子、谷氨酸等。激活后的p38 MAPK通路，通过影响不同的细胞类型，引发特定的生物学效应。在神经细胞内，当代谢性谷氨酸受体被激活时，磷脂酶C的活化会促进MAPKK3/6的磷酸化，进而激活p38 MAPK信号通路[23]。这一过程会导致p38的不同亚型产生不同的生物学效应：p38α和p38β能够影响突触可塑性相关蛋白的表达，而p38γ和p38δ则参与突触相关蛋白的调节[24]。过量的谷氨酸和Aβ能够激活p38α和p38β。p38α的激活会增强其下游信号分子核因子κB (Nuclear Factor-κB, NF-κB)的表达，导致活性氧累积及星形胶质细胞活化，引起细胞炎症；与此同时，p38β的激活则有助于抑制星形胶质细胞的凋亡过程[25]。

方中的活血化瘀药丹参，其主要成分中的丹参酮ⅡA可以通过抑制MAPK通路，减少氧化还原反应，减轻对上皮细胞的损伤[26]。同时，有学者通过分析丹参酮ⅡA对小鼠的非编码RNA (ncRNA)表达谱，发现其主要参与MAPK等通路，通过减轻细胞炎症调控ncRNA表达[27]。研究发现，大鼠脑出血部位的磷酸化p38 MAPK水平升高，通过小干扰RNA抑制p38 MAPK的表达，可缩小脑出血诱导的脑部血肿，减少神经元凋亡，改善神经功能[28]。董西朝[27]等人的研究也证实，脑出血大鼠p38 MAPK升高，降低p38 MAPK后，神经功能改善。同样地，本研究证明，脑出血大鼠p38 MAPK水平升高，对应的mRNA高表达；经健神利水方干预，脑出血大鼠p38 MAPK水平及mRNA表达均下降，神经功能评分也下降，神经功能改善。

综上，本研究证明，脑出血大鼠p38 MAPK升高，在健神利水方的干预下，脑出血模型大鼠的p38 MAPK下降，同时神经功能改善。健神利水方治疗脑出血的作用机制与抑制p38 MAPK的表达相关。近几年来，关于p38 MAPK与脑出血的实验研究[29]-[31]多在蛋白表达水平，本研究结合RT-PCR技术，将蛋白与基因联合研究，研究内容更深入，更具实验依据。同时，以健神利水方为干预药物，为进一步研究健神利水方治疗脑出血的作用机制提供试验依据。不足之处在于健神利水方为复方制剂，其作用靶点有待进一步研究，作用机制也有待深入阐明。

基金项目

广西壮族自治区教育厅高校中青年教师科研基础能力提升项目(2020KY07015)：健神利水颗粒对大鼠脑出血后脑组织水肿标志物AQP-4、MMP-9的影响，负责人：高玉广。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。