1. 引言
心力衰竭(Heart failure, HF)作为心血管病(Cardiovascular disease, CVD)的终末期，表现为心脏结构或功能改变导致射血功能减低，机体能量代谢不足的失代偿状态。据报道，我国现有心衰患者890万人[1]，不仅影响居民生活水平，更加重了社会经济负担。HF在中医学中属“心水”“心胀”“喘证”等范畴，主要病机为心阳气虚，血瘀痰饮内生，属本虚标实之证，临证中常予真武汤、血府逐瘀汤等温阳利水、活血化瘀。
《难经·十四难》首次提出“损其心者，调其营卫”，其表明心脏功能受损，可通过调补营卫恢复心脏正常生理功能。目前已有学者将此理论应用于治疗冠状动脉粥样硬化[2]、心律失常[3]、心脏神经症[4]、病毒性心肌炎[5]等疾病，但用于HF的研究较少。因此，本文主要通过网络药理学分析，探讨调和营卫经典药对“桂枝–白芍”的药效活性成分及潜在作用靶点，阐明“桂枝–白芍”改善心力衰竭的分子机制。
2. 网络药理学分析
2.1. 材料与方法
2.1.1. 桂枝–白芍活性成分的筛选及靶点预测
运用中药系统药理学分析平台TCMSP数据库(https://tcmsp.91medicine.cn/#/home)对桂枝(Cinnamomi ramulus)、白芍(Paeoniae Radix Alba)进行检索，获得桂枝–芍药的主要化学成分，并依据其口服生物利用度(OB)和类药性(DL)作为筛选条件对其化学成分进行筛选，选取OB ≥ 20%、DL ≥ 0.1的成分为“桂枝–白芍”治疗心力衰竭的主要活性成分。并将TCMSP数据库获得主要活性成分的靶蛋白英文名导入蛋白质数据库(Uniprot, https://www.uniprot.org/)，收集相关靶点基因符号，并导入Cytoscape 3.10.0软件进行可视化处理。
2.1.2. 心力衰竭相关靶点预测
使用关键词“Heart Failure”在GeneCards数据库(http://www.genecards.org)中进行检索，筛选出潜在靶点，利用中位数筛选，以获取心力衰竭的基因靶点。
2.1.3. 构建“中药–疾病”交集靶点数据库
将“桂枝–白芍”及“心力衰竭”相关靶点导入Excel软件，利用VLOOKUP函数获取交集靶点基因，并使用韦恩图制作工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)进行可视化呈现。
2.1.4. 蛋白互作网络的构建分析
将筛选出交集靶点基因导入String数据库(https://cn.string-db.org/)，将物种设置为“Homo sapiens”，最小互作阈值设置为“medium confidence (0.400)”，得到相应蛋白互作网络(PPI)并保存TSV格式数据文件，并导入Cytoscape 3.10.0软件进行处理，并根据度值(Degree)确定核心靶点蛋白。
2.1.5. 基因本体(GO)富集与京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析
将2.1.3中所获得交集靶点基因通过仙桃学术(https://www.xiantaozi.com/)，物种选择“人源(Homo sapiens)”进行GO和KEGG信号通路富集分析，并在仙桃学术中进行可视化分析，得到相关细胞组成(Cellular Component)、分子功能(Molecular Function)以及生物过程(Biological Process)数值。
3. 结果
3.1. “桂枝–白芍”药效成分筛选及靶点预测
本研究利用TCMSP数据库，依据OB ≥ 20%、DL ≥ 0.1为筛选标准共获得“桂枝–白芍”药效成分59种，其中桂枝34种，白芍25种，经剔除未筛查到的靶点，最终获得药效成分39种，其中有6种重复成分：豆甾烯基吡喃葡萄糖苷(Sitogluside)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、谷固醇(sitosterol)、儿茶素(catechin)、α-雪松烯(alpha-cedrene)、酞酸丁酯(DBP)，表1为成分筛选后的结果，图1为有效成分及作用靶点网络。
Table 1. Screening results of pharmacodynamic components of “Cinnamon Branch-White Paeoniae”
表1. “桂枝–白芍”药效成分筛选结果
序号 |
化合物 |
OB(%) |
DL |
来源 |
1 |
ST069309 |
24.02 |
0.38 |
桂枝 |
2 |
DMEP |
55.66 |
0.15 |
3 |
1,2-Dibenzoylethane |
57.97 |
0.12 |
4 |
WLN: RVO2R |
31.04 |
0.1 |
5 |
(-)-taxifolin |
60.51 |
0.27 |
6 |
ELD |
31.2 |
0.14 |
7 |
YW1 |
82.33 |
0.12 |
8 |
copaene |
24.08 |
0.12 |
9 |
()-alpha-Longipinene |
57.47 |
0.12 |
10 |
(-)-Caryophyllene oxide |
32.67 |
0.13 |
11 |
ent-Epicatechin |
48.96 |
0.24 |
12 |
α-Longipinene |
53.26 |
0.12 |
13 |
DIBP |
49.63 |
0.13 |
14 |
EIC |
41.9 |
0.14 |
15 |
()-Aromadendrene |
55.74 |
0.1 |
16 |
beta-Cubebene |
32.81 |
0.11 |
17 |
(-)-Epoxycaryophyllene |
35.94 |
0.13 |
18 |
oleic acid |
33.13 |
0.14 |
19 |
Hepanal |
53.83 |
0.1 |
20 |
58870_FLUKA |
49.01 |
0.1 |
21 |
(−)-Alloaromadendrene |
54.04 |
0.1 |
22 |
phytol |
33.82 |
0.13 |
23 |
copaene |
29.47 |
0.12 |
24 |
taxifolin |
57.84 |
0.27 |
25 |
YW2 |
55.17 |
0.13 |
26 |
()-alpha-Funebrene |
49.41 |
0.1 |
27 |
Sitogluside |
20.63 |
0.62 |
共有 |
28 |
beta-sitosterol |
36.91 |
0.75 |
29 |
sitosterol |
36.91 |
0.75 |
30 |
(+)-catechin |
54.83 |
0.24 |
31 |
(-)-alpha-cedrene |
55.56 |
0.1 |
32 |
DBP |
64.54 |
0.13 |
33 |
Methyl linolelaidate |
41.93 |
0.17 |
白芍 |
34 |
paeoniflorgenone |
87.59 |
0.37 |
35 |
YW3 |
43.56 |
0.53 |
36 |
paeoniflorin |
53.87 |
0.79 |
37 |
Mairin |
55.38 |
0.78 |
38 |
oleanolic acid |
29.02 |
0.76 |
39 |
kaempferol |
41.88 |
0.24 |
YW1: 1H-Cycloprop(e)azulen-7-ol, decahydro-1,1,7-trimethyl-4-methylene-, (1aR-(1aalpha,4aalpha,7beta,7abeta,7balpha))-; YW2: 1,2-Benzenedicarboxylicacid, mono(2-ethyl) hexylester;
YW3: (3S, 5R, 8R, 9R, 10S, 14S)-3,17-dihydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-2,3,5,6,7,9-hexahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-15,16-dione.
Figure 1. Active ingredient and target network of “Guizhi-Paeonia alba”
图1. “桂枝–白芍”有效成分及作用靶点网络
3.2. 心力衰竭相关靶点预测
使用关键词“Heart Failure”在GeneCards数据库中进行检索，共获得15,687个疾病靶点，利用中位数筛选，共选取892个疾病靶点。
3.3. 建立“中药–疾病”交集靶点数据库
将药物靶点和疾病靶点取交集后，构建VENNY图(见图2)，“桂枝–芍药”与心力衰竭存在44个交集基因靶点：C3、TNF、CRP、MMP1、HMGCR、CAT、APOB、ERBB2、SERPINE1、MPO、EDN1、INSR、ADRB2、CHRM2、NR3C2、ADRB1、CYP3A4、F7、HMOX1、AR、CETP、SELE、PRKACA、ADRA2C、VCAM1、BDNF、SLC6A2、NOS3、SLC6A4、AKT1、NOS2、PTG、PPARG、CASP3、XDH、PIK3CG、MTTP、UCP2、BAX、PPARA、PDE3A、SCN5A、PON2、PTPN22。
Figure 2. Intersection target of “Guizhi-Paeonia alba” and heart failure
图2. “桂枝–白芍”与心力衰竭交集靶点
3.4. 蛋白互作网络的构建分析
将“桂枝–白芍”和心力衰竭的共同靶点导入String数据库，将物种设置为“Homo sapiens”，最小互作阈值设置为“medium confidence (0.400)”，去除不相关联节点，结果共42个节点及300个边，平均节点度为14.28，得到PPI互构网络(见图3)，并依据Degree值选取前5个为关键靶点：TNF、AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3。
Figure 3. PPI network diagram of the intersection of Guizhi-Paeonia alba and heart failure
图3. “桂枝–白芍”与心力衰竭交集靶点PPI网络图
3.5. 基因本体(GO)富集与京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析
通过仙桃学术对所获得的44个“桂枝–白芍”与心力衰竭的共同靶点进行富集分析(见图4)。GO富集分析结果显示：BP与response to decreased oxygen levels (氧水平降低的反应)、response to oxygen levels (对氧水平的反应)、response to hypoxia (对缺氧的反应)等1759条通路相关；CC与membrane raft (膜筏)、membrane microdomain (质膜微区)、plasma membrane raft (质膜筏)等44条通路相关；MF与heme binding (血红素结合)、tetrapyrrole binding (四吡咯结合)、G protein-coupled amine receptor activity (G蛋白偶联胺受体活性)等83条通路相关。
“桂枝–白芍”治疗心力衰竭在KEGG生物学通路中富集了共计108个通路，排名前10为AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications (糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路)、HIF-1 signaling pathway (HIF-1信号传导途径)、Lipid and atherosclerosis (脂质和动脉粥样硬化)、Regulation of lipolysis in adipocytes (脂肪细胞脂解的调控)、cAMP signaling pathway (环腺苷酸信号途径)、TNF signaling pathway (TNF信号通路)、cGMP-PKG signaling pathway (cGMP-PKG信号通路)、Longevity regulating pathway (寿命调节通路)、Fluid shear stress and atherosclerosis (流体剪切力与动脉粥样硬化)、Non-alcoholic fatty liver disease (非酒精性脂肪肝(NAFLD))。
Figure 4. GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis of Guizhi-Paeonia Alba in the treatment of heart failure
图4. “桂枝–白芍”治疗心力衰竭的GO富集分析及KEGG富集分析
4. 讨论
心力衰竭作为各种心脏疾病的终末阶段，是一种多种因素疾病，受遗传易感性和环境因素复杂相互作用的影响[6]。HF在中医学中属“心水”“心胀”“喘证”等范畴，属本虚标实之证，本虚即气虚、阴虚、阳虚；标实及瘀血、痰湿、水饮，且气虚、血瘀贯穿整个疾病过程。“桂枝–白芍”作为调和营卫的经典药对，广泛应用于内科疾病，和合阴阳以恢复脏腑功能，目前已有学者结合临床体会，表明“调和营卫”法在应用于气虚血瘀证[7]、痰饮阻肺证[8]、阳虚水泛证[9]心力衰竭治疗时，收效显著。
中医药作为中华民族的瑰宝，已有几千年的历史，可通过多途径、多靶点改善心衰症状、心脏功能和提高生活质量方面具有独特优势[10]，但其具体机制很难阐明。网络药理学作为一种通过整合系统生物学、计算机生物学，多角度、多层次、系统地阐明中药复方与疾病的关联的方法[11]，可为中医药系统深入研究提供科学依据。
本研究结果表明，“桂枝–白芍”与心力衰竭(HF)交集靶点共有44个，通过String数据库构建的PPI网络图可以展示蛋白质之间的非线性复杂关系，其核心靶点为TNF、AKT1、PTGS2、PPARG、CASP3。肿瘤坏死因子(TNF)能够影响脂代谢环节、增加黏附分子的表达、提高血小板黏附性[12]，破坏内皮细胞稳定性，诱发炎症反应[13]，TNF有TNF-α和TNF-β两种亚型，且心力衰竭患者体内TNF-α明显升高，TNF-α高表达可影响线粒体功能，引发心肌细胞能量代谢障碍，从而加重心衰[14]，有学者发现苓桂术甘汤可明显减低心衰患者体内TNF-α含量，减轻炎症反应，改善心功能[15]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)有3种亚型基因(Akt1、Akt2、Akt3)，是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号转导通路的主要下游效应因子，其可通过与关键的干性转录因子相互作用，调节细胞的自我更新[16]，AKT1可作用于血管平滑肌细胞(VSMCs)，通过抑制FOXO3α和GSK3β防止细胞凋亡[11]，有学者发现参芪益心颗粒可提高心衰患者体内AKT蛋白表达，调节细胞凋亡和增殖，改善心衰症状[17]。PTGS2又称环氧化酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)，参与花生四烯酸向前列腺素的转化，并在炎症过程中表达[18]，且COX-2缺陷常会导致心肌细胞能量代谢失常[19]，有学者发现苓桂术甘汤内肉桂酸可通过降低PTGS2表达，抑制心肌细胞氧化应激，改善心功能[10]。PPARG基因位于人类3号染色体p25区域，可通过影响血脂水平，参与炎症反应，罹患心血管疾病[20]。Caspase3 (CASP3)是细胞凋亡过程中的关键靶点，CASP3升高常见于心肌缺血、心肌病、心力衰竭等[21]，有研究表明芒柄花素可通过抑制HSP90的表达，促进AKT磷酸化，降低CASP3的表达，减少心肌细胞凋亡，改善心肌组织损伤[22]，有学者发现真武汤可明显降低心力衰竭大鼠体内Caspase3含量，减轻心衰大鼠心肌细胞凋亡及心肌病理改变，增强HF大鼠心肌收缩力，进而延缓大鼠心衰进程[23]，亦有学者发现柴胡三参胶囊可通过调控PI3K/Akt和p38MAPK通路，调低Caspase3的表达，抑制氧化应激和细胞凋亡，改善阿霉素诱导的心脏毒性[24]。
综上所述，本研究基于网络药理学构建“桂枝–白芍”网络、PPI网络预测“桂枝–白芍”的核心有效成分及作用靶点，但本研究并未衡量其在配伍中的含量及相互作用等问题，存在一定的局限性，但为临床和实验研究提供了大致的参考方向。
NOTES
*通讯作者。