1. 引言
葛根芩连汤出自《伤寒论》，药味组成为葛根、黄芩、黄连和炙甘草，为表里双解剂，主治热陷阳明、身热口渴、协热下利、胸肒烦热等[1] [2]。现代药理学研究发现，该方具有抗炎抑菌、抗病毒、止泻、解热、抗氧化等药理作用，临床上常用于治疗溃疡性结肠炎[3]-[5]。该方剂型大多为汤剂、片剂、丸剂、胶囊剂等传统剂型[6]-[9]，虽疗效确切，但由于溃疡性结肠炎的主要病灶部位在结肠，口服给药后药物在胃、小肠部位就会被释放、吸收和分解，难以达到结肠部位，生物利用度较低[10]，一定程度上制约了该方的临床应用与发展，故有必要在保证该方疗效的前提下将其原有剂型进行改良优化。课题组前期针对葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎的作用机制及药效物质基础进行了研究，通过构建谱效关系模型初步阐明其药效物质基础[11]-[15]。中药复方成分复杂，各药味通过相互作用实现其多成分、多靶点、多层次、多渠道的整体调节作用，药效物质成分群进入人体内作用于多个靶点并产生整体功效，是中药发挥疗效的根本保证[16] [17]。当前，在大部分对中药复方提取工艺的研究中，表征药效的有效成分往往被单一的化学成分所替代，多数提取工艺中的“煎煮成分”与“有效成分”相距甚远，为了更加全面地评价提取工艺，改变中药复方提取过程中单一成分的评价现状，强化“整体药物观”的概念，有必要对葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎的药效物质成分群进行提取，建立适宜的多成分含量测定方法，以药效物质成分群及其药效权重系数为考察指标，全面评价该方提取工艺，优化工艺参数，可为剂型工艺研究提供指导，对于更好地发挥该方的临床疗效具有重要意义。
Box-Behnken设计–响应面法(BoxBehnken design-response surface methodology, BBD-RSM)是一种应用广泛的多因素优化方法，运用多元回归方程拟合因素和效应值之间的函数关系，通过分析变量系统中变量之间的相互作用，有效地构建响应面模型，以寻求最佳提取工艺参数，具有精确度高、模拟程度好等优点，广泛应用于多个因素、多个水平共同作用的实验[18] [19]。本实验以前期研究的有效物质成分群为依据[13]，选取葛根素、大豆苷、黄连碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷和甘草酸铵10个有效成分作为考察指标，采用高效液相色谱法同时测定其含量变化并进行综合加权评分，同时以提取方法、乙醇浓度、提取时间、提取次数和溶剂倍数为考察因素，结合Box-Behnken响应面设计法，以综合加权评分值为评价指标对该方的提取工艺进行优化，并为该方剂型改良工艺研究提供前期实验基础和参考依据。
2. 材料
2.1. 仪器
安捷伦1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；G1314F紫外检测器(美国安捷伦公司，DAD型)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AUY220型万分之一电子天平(日本岛津公司)；AE/240型十万分之一电子天平(上海梅特勒仪器有限公司)。
2.2. 药品与试剂
葛根素(批号：110752-201514，含量：95.5%)、大豆苷(批号：111738-201803，含量：98.8%)、汉黄芩苷(批号：112002-201501，含量：98.8%)，均购自中国食品药品检定研究院；盐酸小檗碱(批号：520D024，含量：≥98%)、盐酸巴马汀(批号：472C021，含量：≥98%)、盐酸药根碱(批号：1204C021，含量：≥98%)、黄芩苷(批号：830K021，含量：≥98%)，均购自北京索莱宝科技有限公司；黄连碱(批号：200613，含量：≥98%)、表小檗碱(批号：200821含量：≥98%)，均购自成都植标化纯生物技术有限公司；甘草酸铵(批号：A1205AS，含量：≥98%)，购自大连美伦生物技术有限公司。葛根(批号：20200915，产地贵州)，购自怀仁大药房；黄芩(批号：20190721，产地内蒙)、黄连(批号：20201121，产地四川)、炙甘草(批号：2020610，产地甘肃)，均购买于北京同仁堂大药房；上述药材经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定。甲醇、磷酸、三乙胺和冰乙酸均为色谱纯(国药集团化学试剂公司)，娃哈哈纯净水(娃哈哈饮用水有限公司)，其他试剂均为分析纯。
3. 方法与结果
3.1. 溶液的制备
3.1.1. 对照品溶液的制备
精密称取葛根素、大豆苷、黄连碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷和甘草酸铵适量，分别置于25 mL容量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，得各对照品储备液。分别精密吸取各对照品储备液适量置25 mL容量瓶中，70%甲醇稀释至刻度，制得上述各成分质量浓度分别为91.68、115.65、138.66、105.34、79.76、413.16、115.34、763.80、142.28、55.86 μg/mL的混合对照品溶液。
3.1.2. 供试品溶液的制备
按2020年版《中国药典》一部葛根芩连方各药味比例(葛根:黄芩:黄连:炙甘草 = 8:3:3:2)分别称取葛根48 g、黄芩18 g、黄连18 g、炙甘草12 g，加10倍量水，煎煮2次，每次1 h，煎煮液趁热过滤，合并3次滤液，浓缩，55℃减压干燥成干浸膏。取葛根芩连汤干浸膏粉末(过5号筛) 0.10 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入70%甲醇，超声处理30 min，放冷，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
3.1.3. 阴性样品溶液的制备
按2020年版《中国药典》中记载的葛根芩连汤处方、制法项下方法制成分别不含葛根、黄芩、黄连、炙甘草的阴性样品。分别取缺葛根、黄芩、黄连、炙甘草的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备，即得。
3.2. 色谱条件
以ZORBAX SB-C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm)为色谱柱；以甲醇(A)-0.5%三乙胺、1%冰乙酸、0.8%磷酸水(B)为流动相，进行梯度洗脱(0~10 min, 16% → 22% A; 10~25 min, 22% → 26% A; 25~35 min, 26% → 30% A; 35~45 min, 30% → 30% A; 45~50 min, 30% → 35% A; 50~58 min, 35% → 41% A; 58~63 min, 41% → 41% A; 63~73 min, 41% → 48% A; 73~80 min, 48% → 55% A; 80~90 min, 55% → 70% A; 90~100 min, 70% → 30% A)；检测波长为270 nm；流速为1 mL/min；柱温为45℃；进样量为10 μL。
3.3. 方法学考察
3.3.1. 系统适用性试验
分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.2”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。从色谱图可见，缺葛根、缺黄芩、缺黄连、缺炙甘草阴性对照溶液在与混合对照品溶液相同的保留时间位置无相应的色谱峰出现，表明葛根素、大豆苷、黄连碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷和甘草酸铵共10个成分分离良好，阴性无干扰。结果见图1。
1. Puerarin; 2. Daidzein; 3. Coptisine; 4. Epiberberine; 5. Rhizine hydrochloride; 6. Berberine hydrochloride; 7. Palmatine hydrochloride; 8. Baicalin; 9. Baicalin; 10. Ammonium glycyrrhizinate
1. 葛根素；2. 大豆苷；3. 黄连碱；4. 表小檗碱；5. 盐酸药根碱；6. 盐酸小檗碱；7. 盐酸巴马汀；8. 黄芩苷；9. 汉黄芩苷；10. 甘草酸铵
Figure 1. HPLC chromatogram of Gegenqinlian decoction. (a) Mixed control products; (b) Test products; (c) Negative samples lacking pueraria root; (d) Lack of scutellaria negative samples; (e) Negative samples of coptis deficiency; (f) Lack of grilled licorice negative samples
图1. 葛根芩连汤HPLC色谱图。(a) 混合对照品；(b) 供试品；(c) 缺葛根阴性样品；(d) 缺黄芩阴性样品；(e) 缺黄连阴性样品；(f) 缺炙甘草阴性样品
3.3.2. 线性关系考察
分别精密吸取“2.1.1”项下制备的混合对照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL，置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，配制成不同系列浓度的混合对照品溶液，按照“2.2”项下的色谱条件进行测定。以对照品的浓度为横坐标(x)，以峰面积为纵坐标(y)进行线性分析。从回归方程可知，10种对照品在一定质量浓度范围内呈现出较好的线性关系。结果见表1。
Table 1. Linear results and equations of 10 components
表1. 10种成分线性结果及方程
待测成分 |
回归方程 |
r |
线性范围(µg/mL) |
葛根素 |
y = 25.313x − 22.8390 |
0.9994 |
4.584~73.344 |
大豆苷 |
y = 29.608x + 7.0752 |
0.9999 |
5.782~92.512 |
黄连碱 |
y = 29.946x + 3.9836 |
0.9999 |
6.933~110.928 |
表小檗碱 |
y = 35.253x + 0.4407 |
0.9997 |
5.267~84.272 |
盐酸药根碱 |
y = 42.406x + 7.1764 |
0.9996 |
3.988~63.968 |
盐酸小檗碱 |
y = 42.468x + 14.939 |
0.9995 |
20.658~330.534 |
盐酸巴马汀 |
y = 41.482x + 2.7043 |
0.9995 |
5.767~92.272 |
黄芩苷 |
y = 28.414x + 53.211 |
0.9999 |
38.190~611.040 |
汉黄芩苷 |
y = 31.875x + 13.621 |
0.9995 |
7.114~113.824 |
甘草酸铵 |
y = 3.9254x − 0.3886 |
0.9999 |
2.793~44.688 |
3.3.3. 精密度试验
按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下连续进样6次，每次10 μL，测定峰面积。得到10种成分峰面积的RSD分别为0.39%、0.81%、0.99%、1.13%、0.77%、0.91%、0.65%、0.69%、0.64%和0.87%，表明仪器精密度良好。结果见表2。
Table 2. Results of precision peak area and RSD% determination of 10 components
表2. 10种成分精密度峰面积及RSD%测定结果
成分 |
峰面积 |
RSD (%) |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
葛根素 |
496.6 |
494.5 |
496.2 |
495.3 |
496.2 |
500. 1 |
0.39 |
大豆苷 |
403.5 |
401.2 |
401.7 |
407.1 |
408.5 |
408.0 |
0.81 |
黄连碱 |
1227.5 |
1209.3 |
1236.0 |
1225.9 |
1237.2 |
1244. 1 |
0.99 |
表小檗碱 |
853.9 |
839.7 |
825.8 |
831.8 |
840.6 |
839.7 |
1. 13 |
盐酸药根碱 |
721.2 |
729.6 |
713.5 |
720.8 |
721.2 |
726.9 |
0.77 |
盐酸小檗碱 |
4316.2 |
4233.7 |
4254.2 |
4296.2 |
4311.4 |
4334.5 |
0.91 |
盐酸巴马汀 |
1164.0 |
1157.3 |
1158.5 |
1170.2 |
1171.2 |
11176.2 |
0.65 |
黄芩苷 |
10179.2 |
10012.6 |
10062.4 |
10101. 1 |
10137.3 |
10193.3 |
0.69 |
汉黄芩苷 |
2576.7 |
2542.8 |
2556.5 |
2565.2 |
2574.5 |
2589.8 |
0.64 |
甘草酸铵 |
67. 1 |
67. 1 |
67.9 |
67.0 |
67.6 |
68.5 |
0.87 |
3.3.4. 重复性试验
按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进行测定，进样10 μL，记录色谱图及峰面积。得到10种成分峰面积的RSD分别为1.76%、1.34%、1.97%、2.09%、2.03%、1.65%、1.97%、1.83%、1.79%和1.83%，表明该试验方法的重复性良好。结果见表3。
Table 3. Results of repeatability peak area and RSD% of 10 components
表3. 10种成分重复性峰面积及RSD%测定结果
成分 |
峰面积 |
RSD (%) |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
葛根素 |
421.5 |
417.9 |
430.9 |
436.2 |
418. 1 |
421.5 |
1.76 |
大豆苷 |
338.2 |
334.8 |
345.8 |
353.8 |
343.6 |
342.7 |
1.34 |
黄连碱 |
1038.4 |
1028.1 |
1058.6 |
1083.8 |
1035.8 |
1037.6 |
1.97 |
表小檗碱 |
702.2 |
691.9 |
714.6 |
732.4 |
698.0 |
699.3 |
2.09 |
盐酸药根碱 |
607.0 |
597.0 |
620.3 |
631.0 |
602.6 |
610.5 |
2.03 |
盐酸小檗碱 |
3654. 1 |
3601.4 |
3786.2 |
3655.2 |
3659. 1 |
3724.5 |
1.65 |
盐酸巴马汀 |
974.5 |
962.2 |
991.5 |
1019.3 |
979.3 |
984.2 |
1.97 |
黄芩苷 |
8599.4 |
8469.7 |
8752.2 |
8902 |
8540.2 |
8589.6 |
1.83 |
汉黄芩苷 |
2166.9 |
2129.4 |
2202.1 |
2237.9 |
2150. 1 |
2164.5 |
1.79 |
甘草酸铵 |
58.8 |
57.4 |
60.1 |
60.1 |
58.1 |
58.2 |
1.83 |
3.3.5. 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液各10 μL，按“2.2”项下色谱条件分别于0、2、6、12、18、24 h进样测定，记录色谱图及峰面积。得到10种成分峰面积的RSD分别为1.01%、1.79%、1.80%、1.98%、2.04%、1.62%、1.79%、1.52%、2.25%和1.72%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。结果见表4。
Table 4. Results of stability peak area and RSD% of 10 components
表4. 10种成分稳定性峰面积及RSD%测定结果
成分 |
峰面积 |
RSD (%) |
0 h |
2 h |
6 h |
12 h |
18 h |
24 h |
葛根素 |
522.4 |
512. 1 |
516. 1 |
519.9 |
524. 1 |
526.2 |
1.01 |
大豆苷 |
420.2 |
409.3 |
414.8 |
425. 1 |
425.6 |
429.3 |
1.79 |
黄连碱 |
1301.3 |
1262.4 |
1276.8 |
1306.8 |
1306.6 |
1319.7 |
1.80 |
表小檗碱 |
943.0 |
901.6 |
913.4 |
936.0 |
935.5 |
949.4 |
1.98 |
盐酸药根碱 |
750.9 |
733.2 |
736.8 |
773. 1 |
754.7 |
763.7 |
2.04 |
盐酸小檗碱 |
4457. 1 |
4368.5 |
4397.7 |
4488.7 |
4523 |
4555.7 |
1.62 |
盐酸巴马汀 |
1219.2 |
1181.3 |
1196.3 |
1219.5 |
1229.4 |
1240.3 |
1.79 |
黄芩苷 |
10564.4 |
10302.3 |
10413.7 |
10627.7 |
10642.3 |
10734.7 |
1.52 |
汉黄芩苷 |
2678.5 |
2607. 1 |
2633.2 |
2687.3 |
2695.6 |
2782.3 |
2.25 |
甘草酸铵 |
70.7 |
69.0 |
69.2 |
71.4 |
71.3 |
71.9 |
1.72 |
3.3.6. 加样回收率试验
精密称取6份葛根芩连浸膏粉，约0.05 g，置于25 mL容量瓶中，加入各对照品适量，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，在“2.2”项下的液相色谱条件进行测定，计算回收率。得到10种成分的平均加样回收率分别为101.69%、101.58%、100.22%、99.31%、98.45%、100.40%、96.87%、99.70%，RSD分别为 2.00%、2.35%、1.54%、2.16%、2.68%、1.58%、2.03%、2.19%、1.34%、2.12%。结果见表5。
Table 5. Results of recovery of 10 components by adding samples
表5. 10种成分加样回收测定结果
成分 |
编号
|
取样量 (g) |
含量 (mg) |
加入量 (mg) |
测得量 (mg) |
回收率 (%) |
平均值 (%) |
RSD (%) |
葛根素 |
1 |
0.0500 |
0.2111 |
0.2310 |
0.4420 |
99.96 |
101.69 |
2.00 |
2 |
0.0501 |
0.2116 |
0.2310 |
0.4392 |
98.53 |
3 |
0.0500 |
0.2111 |
0.2310 |
0.4468 |
102.03 |
4 |
0.0502 |
0.2120 |
0.2310 |
0.4491 |
102.64 |
5 |
0.0503 |
0.2124 |
0.2310 |
0.4506 |
103.12 |
6 |
0.0501 |
0.2116 |
0.2310 |
0.4515 |
103.85 |
大豆苷 |
1 |
0.0500 |
0.3294 |
0.3186 |
0.6423 |
98.21 |
101.58 |
2.35 |
2 |
0.0501 |
0.3301 |
0.3186 |
0.6479 |
99.75 |
3 |
0.0500 |
0.3294 |
0.3186 |
0.6517 |
101.16 |
4 |
0.0502 |
0.3307 |
0.3186 |
0.6591 |
103.08 |
5 |
0.0503 |
0.3314 |
0.3186 |
0.6654 |
104.83 |
6 |
0.0501 |
0.3301 |
0.3186 |
0.6565 |
102.45 |
黄连碱 |
1 |
0.0500 |
0.4043 |
0.4050 |
0.8033 |
98.52 |
100.22 |
1.54 |
2 |
0.0501 |
0.4051 |
0.4050 |
0.8155 |
101.33 |
3 |
0.0500 |
0.4043 |
0.4050 |
0.8096 |
100.07 |
4 |
0.0502 |
0.4059 |
0.4050 |
0.8127 |
100.44 |
5 |
0.0503 |
0.4067 |
0.4050 |
0.8216 |
102.44 |
6 |
0.0501 |
0.4051 |
0.4050 |
0.8042 |
98.54 |
表小檗碱 |
1 |
0.0500 |
0.2480 |
0.2447 |
0.4887 |
98.37 |
100.70 |
2.16 |
2 |
0.0501 |
0.2485 |
0.2447 |
0.4898 |
98.61 |
3 |
0.0500 |
0.2480 |
0.2447 |
0.4918 |
99.63 |
4 |
0.0502 |
0.2490 |
0.2447 |
0.4990 |
102.17 |
5 |
0.0503 |
0.2495 |
0.2447 |
0.5036 |
103.84 |
6 |
0.0501 |
0.2485 |
0.2447 |
0.4970 |
101.55 |
盐酸 药根碱 |
1 |
0.0500 |
0.2067 |
0.2163 |
0.4197 |
98.47 |
100.41 |
2.68 |
2 |
0.0501 |
0.2071 |
0.2163 |
0.4262 |
101.29 |
3 |
0.0500 |
0.2067 |
0.2163 |
0.4173 |
97.36 |
4 |
0.0502 |
0.2075 |
0.2163 |
0.4308 |
103.24 |
5 |
0.0503 |
0.2079 |
0.2163 |
0.4321 |
103.65 |
6 |
0.0501 |
0.2071 |
0.2163 |
0.4200 |
98.43 |
盐酸 小檗碱 |
1 |
0.0500 |
1.2174 |
1.2375 |
2.4677 |
101.03 |
99.31 |
1.58 |
2 |
0.0501 |
1.2198 |
1.2375 |
2.4332 |
98.05 |
3 |
0.0500 |
1.2174 |
1.2375 |
2.4191 |
97.14 |
4 |
0.0502 |
1.2223 |
1.2375 |
2.4456 |
98.85 |
5 |
0.0503 |
1.2247 |
1.2375 |
2.4727 |
100.85 |
6 |
0.0501 |
1.2198 |
1.2375 |
2.4568 |
99.96 |
盐酸 巴马汀 |
1 |
0.0500 |
0.3352 |
0.3294 |
0.6537 |
96.69 |
98.45 |
2.03 |
2 |
0.0501 |
0.3359 |
0.3294 |
0.6564 |
97.30 |
3 |
0.0500 |
0.3352 |
0.3294 |
0.6533 |
96.57 |
4 |
0.0502 |
0.3366 |
0.3294 |
0.6619 |
98.76 |
5 |
0.0503 |
0.3372 |
0.3294 |
0.6720 |
101.64 |
6 |
0.0501 |
0.3359 |
0.3294 |
0.6645 |
99.76 |
黄芩苷 |
1 |
0.0500 |
3.8834 |
3.7375 |
7.5230 |
97.38 |
100.40 |
2.19 |
2 |
0.0501 |
3.8912 |
3.7375 |
7.6130 |
99.58 |
3 |
0.0500 |
3.8834 |
3.7375 |
7.6830 |
101.66 |
4 |
0.0502 |
3.8990 |
3.7375 |
7.5853 |
98.63 |
5 |
0.0503 |
3.9067 |
3.7375 |
7.7537 |
102.93 |
6 |
0.0501 |
3.8912 |
3.7375 |
7.7109 |
102.20 |
汉黄芩苷 |
1 |
0.0500 |
0.8257 |
0.8336 |
1.6267 |
96.09 |
96.87 |
1.34 |
2 |
0.0501 |
0.8273 |
0.8336 |
1.6310 |
96.41 |
3 |
0.0500 |
0.8257 |
0.8336 |
1.6189 |
95.15 |
4 |
0.0502 |
0.8290 |
0.8336 |
1.6440 |
97.69 |
5 |
0.0503 |
0.8306 |
0.8336 |
1.6546 |
98.85 |
6 |
0.0501 |
0.8273 |
0.8336 |
1.6363 |
97.05 |
甘草酸铵 |
1 |
0.0500 |
0.2467 |
0.2549 |
0.4949 |
97.37 |
99.70 |
2.12 |
2 |
0.0501 |
0.2472 |
0.2549 |
0.4992 |
98.86 |
3 |
0.0500 |
0.2467 |
0.2549 |
0.4992 |
99.02 |
4 |
0.0502 |
0.2477 |
0.2549 |
0.5060 |
101.33 |
5 |
0.0503 |
0.2482 |
0.2549 |
0.5111 |
103.13 |
6 |
0.0501 |
0.2472 |
0.2549 |
0.4983 |
98.51 |
3.4. 单因素实验
以葛根芩连汤中10种有效成分的含量变化为指标，单因素考察提取方法、乙醇浓度、提取时间、提取次数和溶剂倍数对葛根芩连汤提取工艺的影响。
3.4.1. 提取方法考察
葛根芩连汤传统方剂采用水煎煮法提取，但课题组在前期研究中发现水煎煮法所得有效成分含量较低，杂质较多，采用醇提法可提高其有效成分含量[20]。因此本实验按处方分别取同批葛根、黄芩、黄连、炙甘草(16 g、6 g、6 g、4 g) 9份，分别加入10倍量70%乙醇，3份超声提取2次(1.0 h/次)，另3份回流提取2次(1.0 h/次)，另3份煎煮提取2次(1.0 h/次)。合并2次的提取液，将提取液减压浓缩(50℃)，至55℃鼓风干燥箱中干燥成干浸膏。取所得浸膏按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样测定指标成分的含量。结果表明，不同提取方法对葛根芩连汤成分转移率有较大的影响，与超声提取法相比，回流提取法和煎煮法可显著提高葛根芩连汤的成分转移率，超声提取法所得成分含量最低。因此，结合实际操作及实验成本，选择回流提取法提取葛根芩连汤有效成分。结果见表6。
Table 6. Contents of 10 index components under different extraction methods (n = 3, mg/g)
表6. 不同提取方法下10个指标成分的含量(n = 3, mg/g)
成分 |
提取方法 |
超声提取 |
回流提取 |
煎煮提取 |
葛根素 |
2.721 |
2.968 |
2.639 |
大豆苷 |
0.902 |
1.968 |
1.811 |
黄连碱 |
3.617 |
7.346 |
6.923 |
表小檗碱 |
4.357 |
4.824 |
4.757 |
盐酸药根碱 |
2.825 |
3.661 |
3.580 |
盐酸小檗碱 |
7.482 |
19. 125 |
17.416 |
盐酸巴马汀 |
5.930 |
6.217 |
6. 100 |
黄芩苷 |
11.533 |
65.661 |
64.720 |
汉黄芩苷 |
5. 148 |
16.881 |
15. 193 |
甘草酸铵 |
4.522 |
4.478 |
4.433 |
10种成分总量 |
43.889 |
114.004 |
106.279 |
3.4.2. 乙醇浓度考察
按处方分别取同批葛根、黄芩、黄连、炙甘草(16 g、6 g、6 g、4 g)，分别加入10倍量20%、40%、60%、80%、100%乙醇回流提取2次(1.0 h/次)。合并2次的提取液，将提取液减压浓缩(50℃)，至55℃鼓风干燥箱中干燥成干浸膏。取所得浸膏按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样测定指标成分的含量。结果表明不同乙醇浓度对葛根芩连汤主要成分影响较大。生物碱类成分随乙醇浓度的升高含量增多，但黄芩苷和汉黄芩苷含量呈现一定下降趋势，当乙醇浓度为80%和100%时，黄酮类成分含量差别不大，综合考虑选择乙醇浓度为70%~90%进行后续实验。结果见表7。
Table 7. Contents of 10 index components under different ethanol concentrations (n = 3, mg/g)
表7. 不同乙醇浓度下10个指标成分的含量(n = 3, mg/g)
成分 |
乙醇浓度 |
20% |
40% |
60% |
80% |
100% |
葛根素 |
4.473 |
2.310 |
2.552 |
7.559 |
7.599 |
大豆苷 |
2.073 |
2.083 |
2.414 |
2.424 |
2.472 |
黄连碱 |
10.682 |
11.953 |
12.742 |
15.232 |
16.301 |
表小檗碱 |
6.780 |
6.849 |
7.210 |
9.164 |
9.185 |
盐酸药根碱 |
4.589 |
4.978 |
5.387 |
6.308 |
6.579 |
盐酸小檗碱 |
26.275 |
29.678 |
33.464 |
38.125 |
39.300 |
盐酸巴马汀 |
7.432 |
8.375 |
9.261 |
9.598 |
13.510 |
黄芩苷 |
79.748 |
94.150 |
77.543 |
82.163 |
80.173 |
汉黄芩苷 |
20.501 |
21.237 |
20.036 |
21.691 |
20.188 |
甘草酸铵 |
3.997 |
5.452 |
4.237 |
4.192 |
4.268 |
10种成分总量 |
166.55 |
187.065 |
174.846 |
196.42 |
199.575 |
3.4.3. 提取时间考察
按处方分别取同批葛根、黄芩、黄连、炙甘草(16 g、6 g、6 g、4 g)，加入10倍量70%乙醇，分别以1 h/次、1.5 h/次、2 h/次、2.5 h/次、3 h/次回流提取2次。合并2次的提取液，将提取液减压浓缩(50℃)，至55℃鼓风干燥箱中干燥成干浸膏。取所得浸膏按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样测定指标成分的含量。结果表明，提取时间对10个指标成分的含量有一定的影响，提取2 h即可将有效成分提取完全，为了使药物成分能最大限度溶出，选择提取时间为1.5~2.5 h进行后续实验。结果见表8。
Table 8. Contents of 10 index components under different extraction times (n = 3, mg/g)
表8. 不同提取时间下10个指标成分的含量(n = 3, mg/g)
成分 |
提取时间 |
1.0 h |
1.5 h |
2.0 h |
2.5 h |
3.0 h |
葛根素 |
1.960 |
2.359 |
3.779 |
3.419 |
3.521 |
大豆苷 |
2.829 |
4.624 |
5.648 |
4.283 |
4.464 |
黄连碱 |
16.649 |
14.321 |
16.993 |
16.579 |
15.184 |
表小檗碱 |
9.055 |
8.027 |
8.708 |
9.161 |
8.598 |
盐酸药根碱 |
6.853 |
6.502 |
8.024 |
6.528 |
6.188 |
盐酸小檗碱 |
42.976 |
38.627 |
39.332 |
40.987 |
36.019 |
盐酸巴马汀 |
10.294 |
10.692 |
11.454 |
11.009 |
10.024 |
黄芩苷 |
65.109 |
78.869 |
77.291 |
71.321 |
74.351 |
汉黄芩苷 |
17.379 |
21.346 |
20.714 |
17.721 |
21.739 |
甘草酸铵 |
5.724 |
6.008 |
5.357 |
5.433 |
5.724 |
10种成分总量 |
113.719 |
191.375 |
197.3 |
177.28 |
164.44 |
3.4.4. 提取次数考察
按处方分别取同批葛根、黄芩、黄连、炙甘草(16 g、6 g、6 g、4 g)，分别加入10倍量70%乙醇回流提取1次(2.0 h/次)、2次(2.0 h/次)、3次(2.0 h/次)。分别合并提取液，将提取液减压浓缩(50℃)，至55℃鼓风干燥箱中干燥成干浸膏。取所得浸膏按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样测定指标成分的含量。结果发现葛根芩连汤经2次提取后大部分成分可被完全提出，因此将提取次数定为2次。结果见表9。
Table 9. Contents of 10 index components under different extraction times (n = 3, mg/g)
表9. 不同提取次数下10个指标成分的含量(n = 3, mg/g)
成分 |
提取次数 |
1次 |
2次 |
3次 |
葛根素 |
4.448 |
4.804 |
4.906 |
大豆苷 |
3.360 |
3.299 |
3.951 |
黄连碱 |
15.885 |
16.937 |
16.310 |
表小檗碱 |
8.834 |
8.742 |
8.725 |
盐酸药根碱 |
6.961 |
6.476 |
6.425 |
盐酸小檗碱 |
40.245 |
43.382 |
43.552 |
盐酸巴马汀 |
10.840 |
9.946 |
10.344 |
黄芩苷 |
58.237 |
88.487 |
88.380 |
汉黄芩苷 |
17.136 |
22.412 |
22.125 |
甘草酸铵 |
5.724 |
6.657 |
6.515 |
10种成分总量 |
154.534 |
211.142 |
189.108 |
3.4.5. 溶剂倍数考察
按处方分别取同批葛根、黄芩、黄连、炙甘草(16 g、6 g、6 g、4 g)，分别加入6、8、10、12、15倍量70%乙醇回流提取2次(2.0 h/次)。合并2次的提取液，减压浓缩(50℃)，至55℃鼓风干燥箱中干燥成干浸膏。取所得浸膏按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样测定指标成分的含量。结果表明溶剂倍数对10个指标成分的含量有一定的影响，其中葛根素、黄连碱、盐酸小檗碱、甘草酸铵的含量在10倍量时达到最大水平，一些成分的含量在12、15倍量时达到最大水平，大多成分的含量在10倍量与12倍量时差异较小，从经济节约的角度综合考虑，选择溶剂倍数为8~12倍进行后续实验。结果见表10。
Table 10. Contents of 10 index components under different solvent multiples (n = 3, mg/g)
表10. 不同溶剂倍数下10个指标成分的含量(n = 3, mg/g)
成分 |
溶剂倍数 |
6倍 |
8倍 |
10倍 |
12倍 |
15倍 |
葛根素 |
3.056 |
4.133 |
4.681 |
3.985 |
4.518 |
大豆苷 |
2.813 |
3.868 |
3.538 |
4.332 |
5.712 |
黄连碱 |
18.066 |
14.461 |
19.592 |
16.124 |
17.534 |
表小檗碱 |
9.846 |
8.664 |
10.623 |
10.641 |
8.871 |
盐酸药根碱 |
7.345 |
6.486 |
7.030 |
7.747 |
7.021 |
盐酸小檗碱 |
45.696 |
37.185 |
47.826 |
42.975 |
40.517 |
盐酸巴马汀 |
11.792 |
10.326 |
11.420 |
11.940 |
12.190 |
黄芩苷 |
74.659 |
83.366 |
76.673 |
62.901 |
60.026 |
汉黄芩苷 |
21.223 |
22.080 |
17.205 |
15.697 |
17.990 |
甘草酸铵 |
6.280 |
6.135 |
7.179 |
6.982 |
6.084 |
10种成分总量 |
200.776 |
196.704 |
205.767 |
183.324 |
180.463 |
3.5. 多指标综合加权评分法
课题组前期采用灰色关联度分析方法对葛根芩连汤抗溃疡性结肠炎进行了谱效关联研究，确定了葛根芩连汤指纹图谱主要共有峰所表征的化学成分对其药效作用的贡献程度大小，并由各成分的关联度确定权重系数[12]。各权重系数分别为：葛根素0.0986、大豆苷0.0982、黄连碱0.0963、表小檗碱0.1049、盐酸药根碱0.0977、盐酸小檗碱0.1140、盐酸巴马汀0.0951、黄芩苷0.0997、汉黄芩苷0.0987和甘草酸铵0.0968，权重系数加和为1。对各指标进行加权加和作为综合评分，以综合评分值Pi对试验结果进行方差分析[21]：以Mij表示第i个试验号下第j个待测组分的测定值，以各指标的最大值作为参照对同一指标各数据进行标准化处理；Dij表示第i个试验号下第j个待测组分的标准值，Dij = Mij/(Mj)max，其中i = 1，2，……，17；j = 1，2，……，10，Pi = ∑权重分数 × Dij，以综合评分值Pi为评价指标，结果见表12。
3.6. Box-Behnken响应面法试验优化提取工艺
3.6.1. 实验设计与结果
由于提取方法和提取次数为非连续变量，无法进行回归处理，故在单因素考察结果的基础上，选择乙醇浓度(A)、溶剂倍数(B)和提取时间(C)为自变量，采用Design Expert 8.0.6软件Box-Behnken design响应面试验设计法进行三因素三水平试验，以综合评分Pi为评价指标，优选葛根芩连汤提取工艺。因素与水平见表11，试验安排与结果见表12。
Table 11. Test factors and levels of response surface for extraction process of Gegen Qinlian decoction
表11. 葛根芩连汤提取工艺响应面试验因素与水平
水平 |
乙醇浓度-A (%) |
溶剂倍数-B (倍) |
提取时间-C (h) |
−1 |
70 |
8 |
1.5 |
0 |
80 |
10 |
2.0 |
1 |
90 |
12 |
2.5 |
Table 12. Box-Behnken response surface design and results
表12. Box-Behnken响应面设计与结果
试验号 |
A乙醇浓度(%) |
B溶剂倍数(倍) |
C提取时间(h) |
Pi综合得分(分) |
1 |
90 |
8 |
2 |
75.5445 |
2 |
80 |
10 |
2 |
79.1173 |
3 |
90 |
10 |
1.5 |
70.9555 |
4 |
90 |
10 |
2.5 |
81.3993 |
5 |
80 |
12 |
1.5 |
76.6182 |
6 |
80 |
10 |
2 |
78.2005 |
7 |
90 |
12 |
2 |
71.5579 |
8 |
80 |
8 |
2.5 |
85.1897 |
9 |
70 |
8 |
2 |
74.1366 |
10 |
80 |
10 |
2 |
79.6627 |
11 |
70 |
10 |
2.5 |
72.1461 |
12 |
80 |
8 |
1.5 |
75.2396 |
13 |
70 |
10 |
1.5 |
78.8555 |
14 |
80 |
10 |
2 |
79.9149 |
15 |
70 |
12 |
2 |
68.7896 |
16 |
80 |
12 |
2.5 |
73.2313 |
17 |
80 |
10 |
2 |
79.1307 |
3.6.2. 模型拟合与响应面结果分析
利用Design Expert 8.0.6软件以乙醇浓度(A)、溶剂倍数(B)、提取时间(C)三个因素对待测组分的综合加权评分进行响应面分析，对试验结果进行回归拟合得回归方程为：Y = 79.21 + 0.69A − 2.49B + 1.29C + 0.34AB + 4.28AC − 3.33BC − 4.21A2 − 2.49B2 + 0.85C2，R2 = 0.9867。结果显示模型的各项方差分析中模型本身的P < 0.0001，具有显著性，失拟项P = 0.3069 > 0.05，无显著性差异，表明模型建立成功；另外该模型的校正决定性系数Radj2为0.9696，表明模型对葛根芩连汤有效成分提取实验的拟合度良好。因此，该模型可用于葛根芩连汤提取工艺的分析和预测。结果见表13。
Table 13. Variance analysis of response surface test of extraction process of Gegen Qinlian decoction
表13. 葛根芩连汤提取工艺响应面试验方差分析
方差来源 |
平方和 |
自由度 |
均值 |
F值 |
P值 |
显著性 |
模型 |
291.6273 |
9 |
32.4030 |
57.76991 |
<0.0001 |
极显著 |
A |
3.796978 |
1 |
3.7970 |
6.769462 |
0.0353 |
|
B |
49.56782 |
1 |
49.5678 |
88.37224 |
<0.0001 |
|
C |
13.30148 |
1 |
13.3015 |
23.7146 |
0.0018 |
|
AB |
0.462757 |
1 |
0.4628 |
0.825028 |
0.3939 |
|
AC |
73.40361 |
1 |
73.4036 |
130.868 |
<0.0001 |
|
BC |
44.46891 |
1 |
44.4689 |
79.28162 |
<0.0001 |
|
A2 |
74.70103 |
1 |
74.7010 |
133.1811 |
<0.0001 |
|
B2 |
26.02185 |
1 |
26.0219 |
46.39319 |
0.0003 |
|
C2 |
3.045558 |
1 |
3.0456 |
5.429788 |
0.0526 |
|
残差 |
3.926287 |
7 |
0.5609 |
|
|
|
失拟项 |
2.190574 |
3 |
0.7302 |
1.682747 |
0.3069 |
不显著 |
误差 |
1.735713 |
4 |
0.4339 |
|
|
|
总离差 |
295.5536 |
16 |
|
|
|
|
因素A、B的二次项存在显著性差异(P < 0.01)，表明各因素对综合评分并非一般的线性影响。其中，单因素中B和C为高度显著项(P < 0.01)，A为显著项(P < 0.05)，表明因素B和C对提取工艺综合评分影响大于因素A，其影响大小顺序为：B > C > A。AC、BC为极显著项(P < 0.01)，AB、C2为不显著项，表明乙醇浓度与提取时间的交互作用对结果有显著性影响，溶剂倍数与提取时间的交互作用对结果有显著性影响，乙醇浓度与溶剂倍数的交互作用对结果影响不大。预测最佳工艺为：按生药量加8倍量的85.5%乙醇，提取2次，每次2.5 h。各因素交互作用3D曲面图见图2。
Figure 2. Ethanol concentration (a), solvent multiple (b) and extraction time (c). The response surface of the interaction of three factors to the comprehensive score
图2. 乙醇浓度(a)、溶剂倍数(b)和提取时间(c)。三因素交互作用对综合得分的响应面图
3.6.3. 提取工艺验证
分别精密称取3份葛根芩连汤药材各32 g，加入8倍量85.5%乙醇，回流提取2次，每次2.5 h。按相同条件进行平行试验，进样测定葛根芩连汤中10种成分的含量。结果表明，根据Box-Behnken响应面法优选所得葛根芩连汤提取工艺稳定可靠，所提取的10种成分含量较高，且各批次指标成分含量的RSD均小于3%。结果见表14。
Table 14. Verifies the test results
表14. 验证试验结果
成分 |
含量(mg·g−1) |
RSD (%) |
1 |
2 |
3 |
均值 |
葛根素 |
4.780 |
4.930 |
4.945 |
4.885 |
1.869 |
大豆苷 |
5.248 |
5.131 |
5.053 |
5.144 |
1.908 |
黄连碱 |
18.852 |
18.947 |
19.186 |
18.995 |
0.906 |
表小檗碱 |
11.063 |
10.730 |
10.885 |
10.893 |
1.530 |
盐酸药根碱 |
7.711 |
7.843 |
8.069 |
7.874 |
2.299 |
盐酸小檗碱 |
48.637 |
48.594 |
49.273 |
48.835 |
0.779 |
盐酸巴马汀 |
13.515 |
13.186 |
12.944 |
13.215 |
2.169 |
黄芩苷 |
58.723 |
61.437 |
60.806 |
60.322 |
2.354 |
汉黄芩苷 |
19.109 |
19.610 |
19.046 |
19.255 |
1.605 |
甘草酸铵 |
5.677 |
5.519 |
5.554 |
5.583 |
1.486 |
综合得分 |
86.369 |
86.496 |
86.509 |
86.458 |
0.089 |
4. 讨论
2020年版《中国药典》仅要求对葛根芩连方中葛根素、盐酸小檗碱、黄芩苷3个成分进行含量测定分析[22]。而中药复方所含化学成分复杂，且具有多靶点、多途径、整体作用的特点，在提取过程中，相同的处方经过不同工艺，其化学成分和临床疗效会产生较大的差异，因此仅采用方中简易可测的化学成分作为指标成分难以表征复方制剂的整体质量，也就无法确保复方制剂在临床使用中对症的有效性。在整个制备过程中，应以有效物质成分群为指标，整体评价“活性混合物”在制备过程中的变化情况，确保其在制剂处理过程中最大限度地富集，提高转移率；同时，动态观测“活性混合物”在制备工艺过程中的降解、转化及保留与否，相互比较不同工艺过程中药效成分累计总量，以客观评价不同工艺的优劣[23]。课题组在前期研究中通过灰色关联度分析初步阐明葛根芩连汤抗溃疡性结肠炎的药效物质基础，本实验则基于此确定10个活性成分作为指标成分对葛根芩连汤进行提取工艺考察。方中君药葛根所含的葛根素和大豆苷具有较好的止泻、抗炎、抗氧化等药理作用[24] [25]；臣药黄芩所含的黄芩苷和汉黄芩苷具有抗炎、抗氧化、抗结肠癌、抗免疫等药理作用[26] [27]，其中黄芩苷可通过降低炎症反应、抗氧化应激、调控细胞凋亡、调节肠道菌群和细胞自噬等多种机制发挥抗结肠炎的作用[28]，而汉黄芩苷可通过调节氧化因子和抗氧化因子平衡，拮抗氧化应激进程从而发挥对溃疡性结肠炎的治疗作用[26]；臣药黄连所含的黄连碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀具有抗病原微生物、抗炎抑菌、改善消化系统等药理作用[29]-[31]；佐使药甘草所含的甘草酸铵具有抗炎、抗病毒、免疫调节等药理作用[32]。多种活性成分协同发挥了葛根芩连汤抗溃疡性结肠炎的药效作用。
本研究在建立HPLC法时分别比较了以磷酸水溶液–甲醇，0.1%磷酸二氢钾水溶液–乙腈，0.5%三乙胺、1%冰乙酸、0.8%磷酸水溶液–甲醇为流动相的分离效果，结果发现，当以0.5%三乙胺、1%冰乙酸、0.8%磷酸水溶液–甲醇为流动相时，所得色谱图的基线平稳、各色谱峰分离效果良好。葛根芩连汤中有效成分为黄酮类、生物碱类和皂苷类，最大吸收波长不一样，本研究比较了不同检测波长，发现在270 nm波长下检测的色谱峰高低比例比较均匀、基线平稳，因此确定270 nm为检测波长。
传统多采用水煎法制备葛根芩连汤，但前期研究发现醇提法可以大幅度提高指标成分的含量，因此本实验采取乙醇作为葛根芩连汤的提取溶剂。为了更全面地评估提取条件对各个成分的综合影响，本研究针对各成分的药效关联度分别赋予其权重系数，通过加权加和将多个指标的试验结果转化为单一评价指标，并利用响应面法进行分析评价。由前期预实验及单因素考察的结果发现，乙醇浓度、溶剂倍数与提取时间对葛根芩连汤的10种有效成分的含量影响较大，提取次数为非连续性变量，所以单因素考察后确定为2次，故选取上述3个因素，进行3因素3水平试验，基于10种成分含量的综合评分来评价响应面试验设计的结果，优选葛根芩连汤的提取工艺条件。通过方差分析，确定溶剂倍数与提取时间对综合评分具有显著性影响，其影响大小顺序为溶剂倍数 > 提取时间 > 乙醇浓度，得到最佳提取工艺为按处方称取药材用8倍量的85.5%乙醇，提取2次，每次2.5 h。通过验证试验证明该条件下各指标成分含量、浸膏得率较高，且RSD值均小于3%，表明该提取工艺稳定可行，重复性良好，对葛根芩连汤提取工艺的方法研究具有参考价值，可以将该方法应用于后续成型工艺的研究中。
基金项目
国家自然科学基金资助项目(No. 81660666, No. 82060704, No. 81860706)；贵州省教育厅项目(No. 黔教合KY字〔2020〕006)；贵州中医药大学药用高分子材料研究中心(贵中医党办发[2019]70)。
NOTES
*通讯作者。