摘要: 目的：研究染色体核型分析和Y染色体微缺失在男性不育患者检测方法中的应用及结果分析。方法：选取陕西地区无精症、弱精症、少精症等男性不育患者120例，采用多重荧光定量PCR方法对Y染色体AZF的6个标签序列位点进行检测以及采用G显带方法分析其染色体核型。130例健康体检男性作为对照组。结果：120例受检不育患者中，Y染色体基因微缺失11例，检出率9.2% (11/120)，其中AZFc区缺乏为10例；对照组130例中检出Y染色体基因微缺失1例，检出率0.8% (1/130)，此例为AZFc区缺乏。两组比较，对照组比实验组检出率显著降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。实验组染色体核型异常检出率为4.2% (5/120)，对照组检出率0.8% (1/130)显著低于实验组，但差异无统计学意义(P > 0.05)。结论：在陕西地区男性不育患者中，Y染色体AZFc区缺失是最主要的遗传学因素，应提前完善精液常规检查，准确的病因诊断可指导临床医师正确地选择辅助生殖技术。
Abstract: Objective: Application and result analysis of chromosomal karyotype analysis and Y-chromosome microdeletions in the detection of male infertility patients were studied. Methods: A total of 120 male infertility patients with aspermia, asthenozoospermia and oligozoospermia in Shaanxi Province were selected, and the six sequence-tagged sit of Y chromosome AZF were detected by multiplex polymerase chain reaction (PCR) and Cytogenetic analysis was performed with the GTG banding technique. A total of 130 healthy men were treated as the control group. Result: Among 120 infertile patients tested, 11 cases had Y chromosome gene microdeletions, with a detection rate of 9.2% (11/120), including 10 cases with AZFc region deficiency; one case of Y chromosome gene microdeletion was detected in the control group of 130 cases, with a detection rate of 0.8% (1/130). This case is due to AZFc region deficiency. The detection rate of the control group was significantly lower than that of the experimental group, and the difference was statistically significant (P < 0.05). The detection rate of chromosomal karyotype abnormalities in the experimental group was 4.2% (5/120), while the detection rate in the control group was 0.8% (1/130), which was significantly lower than that in the experimental group, but the difference was not statistically significant (P > 0.05). Conclusion: In male infertility patients in Shaanxi region, the deletion of the Y chromosome AZFc region is the main genetic factor. Semen routine examination should be improved in advance, and accurate etiological diagnosis can guide clinical physicians to choose the correct assisted reproductive technology.
1. 引言
由于其复杂的机制、病因和不断增长的病例数量，不孕不育已逐渐成为全球生殖健康问题。当前，全球人口问题逐渐引起专家们的关注。通过之前多个研究结果显示，在发现不孕不育症(1年未进行有效避孕)的夫妻中约50%为男性因素[1]。男性方面导致不育的原因有很多方面，例如感染、饮酒、内分泌失调、精索静脉曲张、化疗、遗传因素等。在各种遗传因素中，染色体核型异常(主要是47，XXY)及Y染色体微缺失是导致生精失败的主要影响因素[2]。通过研究所知，无精子因子(azoospermia factor, AZF)是控制精子生成的关键因子，为多基因家族，在Yq11的近端、中端和远端存在三个常被重复删除的非重叠子区域，分别命名为“AZFa”、“AZFb”和“AZFc”，与男性不育存在密切关系[3]。本研究中的Y染色体微缺失主要针对这3个区域的6个标签序列位点进行检测。
本研究筛选了120名来陕西省人民医院就诊的不育男性患者，年龄22岁到43岁不等，症状从无精子症、严重弱精子症、弱精子症到少精子症，通过染色体核型检查以及Y染色体微缺失检测，深入探讨染色体核型异常以及Y染色体微缺失与男性不育的关系，以及检测方案的临床应用分析。
2. 材料与方法
2.1. 研究对象
选取近年来到陕西省人民医院男科门诊就诊的120例男性不育患者(按WHO精液常规分析标准确定为严重少、弱精症和无精症)，年龄为22~48岁，平均年龄为30.64岁，婚后性生活正常，未采取任何避孕措施，但1年以上未孕。同时选取130名健康体检男性作为对照组，年龄为22~59岁，平均年龄30.67岁。
2.2. 仪器与试剂
染色体分析采用德国ZEISS显微镜及染色体图像分析系统。Roche Cobas z480荧光定量PCR仪。外周血淋巴细胞培养基和Chrome G吉姆萨染液分别购自广州市达晖生物技术有限公司和上海乐辰生物科技有限公司。Y染色体微缺失检测试剂盒(上海透景生命科技股份有限公司)。外周血DNA提取试剂盒(江苏康为世纪生物科技有限公司)。
2.3. 方法
2.3.1. 染色体核型分析
1) 标本制备
抽取患者肝素钠抗凝静脉血2 ml，采用广州市达晖生物技术有限公司提供的外周血淋巴细胞培养基进行外周血淋巴细胞培养，按照遗传学常规方法进行染色体标本的制备，后进行吉姆萨染色。
2) 分析
通过G显带技术显微镜下分析核型，每例计数至少20个分散良好的中期分裂相，选择至少5个核型进行分析，异常者增加核型分析数，根据人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2016)对所检染色体进行染色体的核型描述。
2.3.2. Y染色体微缺失检测
1) DNA提取
采取EDTA抗凝血2 ml，采用江苏康为世纪生物科技有限公司提供的外周血DNA提取试剂盒提取人外周血基因组DNA，使用方法见说明书。
2) PCR反应体系
选取上海透景生命科技有限公司AZF检测试剂。根据欧洲男科学协会/欧洲分子遗传实验质控网推荐的方法，我们运用多重PCR分析利用多对引物对所检测位点进行高精度扩增。多重荧光PCR一共进行6个序列标签位点(sequence tag site, STS)的检测：AZFa区(sY84、Sy86)、AZFb区(sY127、Sy134)、AZFc区(sY254、sY255)。除此之外，以男性性别决定基因(SRY)、编码锌指蛋白基(ZFX/ZFY)作为内对照基因进行扩增，同时设立正常男性阳性对照以及空白对照。通过观察扩增曲线来判断是否有位点的缺失。
3) PCR扩增条件
采用Roche Cobas z480荧光定量PCR仪进行扩增，反应条件为第一阶段：预变性50℃ 2 min，95℃ 5 min，第二阶段：95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，38个循环，72℃延伸5 min，在每个循环的60℃时收集FAM/VIC/ROX/Cy5信号。第三阶段：72℃ 5 min，1个循环。
2.4. 统计学分析
所有数据结果使用SPSS26.O软件分析，实验组与对照组检出率采取率的比较X2检验(同质性检验)，单一检测异常率和联合检测异常率也采用X2检验(独立性检验)，P < 0.05差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 染色体核型异常
120名受检不育患者的染色体核型检测结果为：检出5例核型异常，检出率4.2% (5/120)，均为性染色体异常(3例为47，XXY，1例为46，XX，1例47，XXY [20]/46，XY [10])。130名健康男性检出染色体核型异常1例(47，XXY)，检出率为0.8% (1/130)，低于不育患者的染色体核型异常检出率，但通过X2检验可得差异无统计学意义(X2 = 3.075, P > 0.05)。
3.2. Y染色体AZF微缺失
受检的120名不育患者中Y染色体微缺失共11例，缺失率为9.2% (11/120)，11例患者中AZFc区缺失10例，AZFabc区缺失1例，该患者核型为46，XX，内参SRY基因为阳性。在130名正常生育史男性中查出Y染色体微缺乏1例，为AZFc区缺乏，缺失率0.8% (1/130)，显著低于不育患者Y染色体微缺失的发生率，差异有统计学意义(X2 = 9.629, P < 0.05)。
3.3. 缺失情况
120名不育男性患者中所有异常染色体核型及Y染色体微缺失患者情况，见表1。
Table 1. 16 Cases of abnormal chromosomal karyotypes and Y-chromosome microdeletions detected
表1. 所检出16例异常染色体核型及Y染色体微缺失病人情况
染色体核型 |
Y染色体微缺失 |
临床表现 |
未见明显异常 |
AZFc区缺失 |
少精症 |
未见明显异常 |
AZFc区缺失 |
少精症(婚后10年未育) |
未见明显异常 |
AZFc区缺失 |
少精症 |
未见明显异常 |
AZFc区缺失 |
无精症 |
未见明显异常 |
AZFc区缺失 |
严重少弱精症 |
未见明显异常 |
AZFc区缺失 |
无精症 |
未见明显异常 |
AZFc区缺失 |
严重弱精症 |
未见明显异常 |
AZFc区缺失 |
无精症 |
未见明显异常 |
AZFc区缺失 |
少精症 |
未见明显异常 |
AZFc区缺失 |
无精症 |
46，XX |
AZFa、AZFb、AZFc区缺失 |
无精症 |
47，XXY [20]/46，XY [10] |
6个STS均存在 |
无精症 |
47，XXY |
6个STS均存在 |
无精症 |
47，XXY |
6个STS均存在 |
无精症 |
47，XXY |
6个STS均存在 |
无精症，先天性睾丸发育不良 |
47，XXY |
6个STS均存在 |
正常(未做精液常规) |
4. 讨论
近些年来，对不育患者的基因学研究已日渐成熟，临床医生通过正确诊断男性不育的病因，从而能够针对病因对患者进行有效的治疗。染色体异常包括结构异常及数目异常，可能会导致男性出现不育症状(弱精症、少精症、无精症等)，一项汇总7876名不育男性的研究中，得出男性染色体异常的发生率为5.1%，其中性染色体异常约为3.8%，性染色体异常中最常见的为Klinefelter综合征(47，XXY) [4]。本次研究，我们通过对120名无精症、少精症等不育患者以及130名健康体检的男性进行细胞遗传学分析，发现120名不育患者中有4.2%存在染色体核型异常(均为性染色体异常)其中2.5% (3/120)为47，XXY，与E. Van Assche等的研究结果相近。虽然130名健康对照组中检出染色体核型异常1例，检出率为0.8% (1/130)，可能的原因是其在做染色体核型检查前未进行精液常规检查，临床未被诊断无精症或少精症，也有可能染色体异常在健康人群中有一定的发生率，表明染色体异常患者在孕育后代前，对生活并没有很大影响，因此不育等致病风险可经常被临床医生忽视。为进一步评估染色体核型异常与不育症的关系，我们可以加大样本量，提升结论的科学性及准确性。除此之外在常规健康查体中，尽量完善精液常规，以减少该原因带来的差异问题。
经多项研究发现，在Klinefelter综合征(47，XXY)之后，Y染色体微缺失逐渐成为男性不育的第二大遗传因素，并随着时间的推移，Y染色体微缺失在不育患者中的发生频率逐年增加[5]，已成为男性不育症检查的一个重要指标。在一般人群中Y染色体微缺失的发生率约为1:4000，但在不育的男性中发生概率约为1:12 [6]。因样本地区及检测方法不同，Y染色体微缺失的概率从0.7%~55%不等[7]，在本研究中，对陕西地区120名来就诊不育患者进行研究，结果显示有9.2% (11/120)存在Y染色体微缺失，其中AZFc区缺乏为8.3% (10/120)，仅有1名来就诊的不育患者同时存在染色体核型异常及Y染色体微缺失。AZFc缺失是导致陕西地区男性不育发生的最主要遗传因素，但本次研究AZFc检出率与我国不同地区Y染色体AZFc位点缺失的检出率有所差异[8]，考虑可能是由于地区差异、种族差异、患者的选择标准、样本量大小及研究方法的不同等[9]。另外在本次研究检出的5名染色体异常的不育患者中，有一名患者染色体核型为46，XX，也称为性反转综合征(Sex reverse syndrome, SRS)，是一种以性腺性与染色体性不一致为特征的人类性别异常发育的遗传性疾病。性反转综合征是一种罕见的染色体疾病，通常发病率约1/20,000~1/100,000 [10]。46，XX男性患者的临床和内分泌特征与47，XXY (Klinefelter综合征)相似，智力与社会中的大多数人没有很大区别，但46，XX男性的身高正常甚至低，发育也受到影响，通常体毛较稀疏[11]。研究表明，性别决定区域Y (SRY)基因对SRS的发病机制具有重要意义，可用以产前诊断以及指导治疗。
在我们的研究中，Y染色体微缺失及性染色体异常是主要的影响男性生育能力的遗传学因素。国内外大量研究结果表明，面对不育患者，针对各种不育病因，可针对性地提供相应的遗传咨询以及选择合适的辅助生殖技术(ART) [12]。在临床上，辅助生殖技术已日渐成熟，为许多不育患者解决了生育难题，已成为治疗男性不育的主要手段。目前主要的辅助生殖技术有体外受精/胞质内单精子注射(IVF/ICSI)、植入前遗传学诊断(PDG)、睾丸组织切除术(TESE)等[13]。染色体异常患者中最常见的是克氏综合征(47，XXY)，克氏综合征患者可分为嵌合型和非嵌合型，研究结果示嵌合型患者睾丸中可见成熟精子，无需行ART治疗。对于非嵌合型患者，通过睾丸组织切除术治疗后超50%患者可获得临床妊娠[13]，再以ICSI作为辅助，可提高患者临床妊娠概率，通过合理治疗，大部分非嵌合型患者都可生下健康的后代。针对Y染色体微缺失的患者，通常通过ISCI治疗后可获得后代[14]，但越来越多的研究结果证明，AZF微缺失基因可能会通过ART遗传给子代，引起不育等临床表现，随着ICSI的广泛应用，该项技术的安全性应引起广泛重视，在进行治疗前应进行合理的风险评估，并严格进行术后随访，收集足量数据用于该领域研究以提升该项技术的安全性[15]。
综上所述，本研究通过研究陕西地区120名男性不育患者与Y染色体微缺失和染色体核型异常的关系，明确陕西地区男性不育患者的主要病因。作为临床医生，对于男性不育患者进行染色体核型及Y染色体微缺失的检测是很有必要的，目的为明确病因，为患者进行后续治疗及遗传学生育指导提供依据。
致 谢
感谢本次科研及论文创作过程中导师的指导、帮助和大力支持。
基金项目
陕西省人民医院科技人才支持计划2022BJ-03。
NOTES
*通讯作者。