1. 松材线虫的检疫鉴定现状
1.1. 松材线虫病
松材线虫病是国际重大检疫性病害，是我国目前最为严重的林业灾害之一。最早于1929年在美国德克萨斯州的长叶松中被分离获得[1]，1972年证实其引起松树萎蔫病[2]。松材线虫Bursaphelenchus xylophilu属线虫门(Nematoda)，侧尾腺纲(Secernentea)，小杆目(Rhabditida)，滑刃总科(Aphelenchoidoidea)，寄生滑刃科(Parasitaphelenchidae)，伞滑刃亚科(Bursaphelenchinae)，伞滑刃属(Bursaphelenchus) [3]。松材线虫雄虫拥有大弓状的交合刺，长20~30 μm。雌虫拥有长阴门盖，长7~11 μm，尾部圆柱形且末端宽圆，多数无尾尖突，部分群体内的个别雌虫有不超过2 μm的微小尾尖突，实验室常依据此特征对松材线虫进行鉴定[4]。
松材线虫源于北美洲，通过国际贸易和人员往来逐渐扩散至全球[5] [6]。亚洲是松材线虫病流行比较严重的地区，东亚地区松材线虫病被认为是重大的外来危险性有害生物。日本、中国、韩国均有松材线虫病的大规模流行[7]。松材线虫病的适生区主要集中在我国的华东和华南地区，1982年，江苏省南京市中山陵后的黑松被发现有松材线虫侵袭的迹象，导致大批树木死亡，且感染范围不断扩大[8]。目前我国多个省市均出现松材线虫病。生态安全、生物安全、林业经济发展等受到极大威胁，需引起高度重视[9]。松材线虫病具有危害性极强、发病部位较隐蔽、传播速度快、准确监测难度较大等特征，近几年在我国的发生形势极为严峻，据统计，仅2021年1~8月，我国就从来自美国的进口松木中检出松材线虫414批[10]。根据申报，这些松木在出口前都进行了去皮或熏蒸处理，但检出松材线虫等检疫性有害生物的情况仍频频发生。
自松材线虫入侵我国后，寄主适应性和环境适应性不断增强，寄主种类分布区域也在不断扩大。松材线虫在被人为携带至新的地区后，可以迅速适应当地环境而生存繁殖扩张[11]。松材线虫自身活动范围较小，无法进行大面积、远距离的传播和蔓延。传播途径主要是通过昆虫媒介传播和人为传播，在我国的主要传播媒介为松墨天牛[12]，人为传播主要是通过运输携带松材线虫病的松木、包装物等，人为造成松材线虫远距离、跳跃式、大面积的扩散[13]。松材线虫入侵我国早期，主要感染南方分布较多的日本黑松、思茅松、黄山松等，之后逐渐蔓延至西南和西北地区蔓延侵染云南松、油松等。2017年后，在辽宁省发现大面积红松感病[14]-[16]。2021年7月，国家林业和草原局印发了《全国松材线虫病疫情防控五年攻坚行动计划(2021~2025)》，指出在“十四五”期间，组织开展松材线虫病防控工作5年攻坚行动，遏制松材线虫病快速扩散蔓延的势头，保障生态环境安全[17]。2021年12月海关总署发布2021年第110号公告《关于进口松材线虫发生国家松木植物检疫要求的公告》，进一步加严口岸针对松材线虫的检疫要求，对口岸检疫工作提出更高要求。
1.2. 松材线虫检疫
口岸现场检验首先应肉眼观察应施检疫物观察材质是否干燥，木质部有否蓝变，有无媒介昆虫栖居的痕迹，如侵入孔、蛀道、蛹室等；从中选取材质干燥无松脂香味、有蓝变、有媒介昆虫栖居痕迹的松木或其加工制品进一步检验，若无明显特征时则随机抽样。将所抽的样木锯成5 cm左右的木段，或用木工钻多点钻取木屑(不少于10 g/份)，标号后即送样至实验室检验，必要时将样木整件带回实验室检验做详细检验。
1.2.1. 松材线虫的分离
实验室检验松材线虫分布在被感染寄主的树体组织中，利用其在水中的活动性和密度大于水的特性，可以将寄主组织破碎后浸泡在水中，使松材线虫从寄主组织中游离到水中，从而分离和获得松材线虫。利用甘油置换松材线虫体内的水，松材线虫标本能保存较长时间，从而方便进一步鉴定。分离松材线虫。在检疫过程中应用较为广泛的有贝尔曼漏斗法、浅盘法和改良贝尔曼漏斗法[18]。
贝尔曼漏斗法是将大小适宜(直径10~15 cm)的漏斗末端接段长约10 cm乳胶管置于漏斗架上，在乳胶管上装上止水夹，将处理好的木屑或木条样品(10 g)用大小适当的纱布包好，放在漏斗中注入清水，注入清水后要注意使水充满漏斗和下面的乳胶管，不要产生空隙，由于趋水性和地球引力的作用，线虫就渐渐游离分离样品进入水中，最后沉降到漏斗末端的乳胶管中，24小时打开止水夹，用培养皿或表面皿接取线虫分离液5~15 mL，用于镜检。
浅盘分离装置主要由两只不锈钢浅盘组成，其中口径略小的一只底部为粗网筛，放在另一只浅盘上面。将两层纱布打湿铺于筛盘上，把制好的样品置于筛盘的纱布上，慢慢注入清水，使水浸没样品。分离结束后，移开筛盘，把大盘内的分离液倒于小烧杯内。小烧杯内的线虫分离液可通过自然沉降或离心机(1500 r/min)浓缩到适宜的量，以便镜检[19]。
改进贝尔曼漏斗法分离松材线虫，同时结合了浅盘法和漏斗法的优点。改进型漏斗法分离装置，由1只较大并类似于贝尔曼漏斗的玻璃或有机玻璃作为外壳，上部装置则与浅盘法装置相似。将线虫滤纸或1层~2层卫生纸平放在筛盘筛网上，用水淋湿滤纸边缘与筛盘结合部分；将待分离线虫的木屑或薄木片(2 mm左右)放置其上；从筛盘下部的空隙中将水注人分离器中，以淹没供分离的材料为止；在15℃~25℃下放置1 d~2 d后，打开弹簧夹，用离心管接取约5 mL的水样；静置20 min左右或1500 r/min离心3 min，吸去离心管内上层清液后，即获得浓度较高的线虫水悬浮液。
1.2.2. 松材线虫的鉴定
松材线虫的鉴定主要依据是形态学特征，依据松材线虫成虫头部、食道的形态特征、雌虫的阴门、尾端和雄虫交合刺、交合伞形状等稳定遗传的形态特征以及体长、体长/体宽比值等测计值。实验室在体视显微镜下观察钟面皿中收集的线虫分离液，发现线虫后用挑针挑取或用50 μL微量移液器吸取线虫并制成临时水玻片，在显微镜下观察。但近年来随着松材线虫寄主、生存环境的变化，形态也逐渐显示出差别，鉴定准确性也不能保证。并且松材线虫大多以幼虫形式存在，缺乏种的形态鉴定特征，其成虫培养时间长，检测效率不理想，且需要依赖于经验丰富的技术人员才可完成[20]，同时制备可供镜检的松材线虫样本的步骤繁杂，时间较长[21]，难以满足当下通关时效的要求。
近年来，基于DNA的检测技术发展迅猛，目前应用较为广泛的分子检测方法主要有：1) DNA核酸分子杂交技术，特异性强、灵敏度高、可检测到1 pg的DNA，可检测大量样品[20]，探针制备以及杂交过程操作较为复杂，并且探针价格昂贵；2) SCAR标记技术，引物特异性较强，检测结果易于判读，时间较短(不超过2.5 h)。但检测结果的假阳性概率较高(大于40%)，判定不够准确；3) 实时荧光PCR (GB/T35342-2017松材线虫分子检测鉴定技术规程)，具有灵敏度高，简便高效的优点[22]，但探针成本较高，不易在一线推广，且随着松材线虫近似种的不断增加，其可靠性有待证实；4) 交叉引物恒温扩增技术(GB/T35342-2017松材线虫分子检测鉴定技术规程)，该方法是核酸恒温扩增技术的创新[23]。方法操作简便快捷，但反应体系较为复杂，稳定性较差。
1.3. 松材线虫与拟松材线虫
拟松材线虫是系统侵染寄主茎干部分的内寄生线虫，松墨天牛为拟松材线虫的媒介昆虫，可随着染虫材料和传媒昆虫传播扩散，常在进境检疫中被截获。20世纪80年代起，我国陆续发现由拟松材线虫引起的松树萎蔫，且能造成一定的危害，松材线虫主要分布于上海、江苏、江西、浙江、安徽辽宁、山东、湖南、广东、四川、贵州、广西、云南等省(区、市) [24]。我国拟拟松材线虫比松材线虫有更广泛的分布范围，接种拟松材线虫发生病害症状或死亡的松树，其症状表现与接种松材线虫的松树相似，相对松材线虫而言拟松材线虫具有较弱的致病能力。
拟松材线虫与松材线虫同属伞滑刃属，在寄主植物、形态、生理生化等方面都极为相似，常常难以区分。形态学上，拟松材线虫与松材线虫的主要区别在于雌虫的尾部形态特征，拟松材线虫的尾部形态为圆锥形，有一长的尾尖突。松材线虫无尾尖突﹑或有短的尾尖突(小于2 μm)，尾圆柱形；拟松材线虫有尾尖突(大于2.5 μm)，通常偏向腹侧，尾圆椎形或指状[25]。
1.4. 同类产品研究现状
我国一直以来都高度重视松材线虫病疫情防控工作，采取积极的防控对策，严格口岸松材线虫检疫是防止松材线虫在我国大规模传播扩散的重要手段。目前各口岸普遍需要依照总署要求，对进境松木及其制品开展严格的采样和松材线虫检测。目前口岸从木包装检疫出来的线虫是休眠状态的幼虫，将休眠状态的幼虫转变为可供鉴定的成虫需要较长的时间[26]，这大大降低了口岸木材与木质包装的检疫通关效率，容易造成疫情扩散；而处于休眠状态的松材线虫可能会因环境状态如水分、温度、时间的不同而难以将深度休眠的松材线虫从中分离，待条件合适后，可能会造成松材线虫的再次繁殖侵染。
在当前通关时限要求不断提高的背景下，实现松材线虫的口岸现场快速检测已成为一种“刚需”。目前市场上的松材线虫分子检测系统一般分为检测试剂检测仪器两个部分，主要是基于传统qPCR的方法，该方法需要温度升降且反复循环，依赖温度精度较高的仪器。近两年也陆续出现了一些基于等温扩增的技术的检测方法，如LAMP法，RPA方法等[27]-[29]。但由于仪器普遍体积较大，便携性差，不适用于口岸一线现场或初筛实验室使用；并且操作流程较为复杂，需专业技术人员才可使用，与当前口岸一线技术能力不匹配。近年来，分子生物学和生物技术迅速发展，为松材线虫的检测提供了一条新途径，目前市场上也出现了部分松材线虫快速分离装置，或者快速检测松材线虫的试剂以及小型化的核酸检测仪器。2009年，日本科学家Taisei Kikuchi等人基于LAMP技术，通过荧光或胶体金试纸条检测松材线虫，达到较高检测灵敏度(10拷贝质粒/反应)，检测时间为60~90分钟[30]。2020年，韩国科学家Hyerim Han等利用RPA技术进行松材线虫的检测[31]。研究人员利用商业化的RPA冻干粉剂，加入对应的引物探针，实现了松材线虫的快速检测，但操作流程仍然十分复杂，不利于在现场检测松材线虫的应用与推广。
目前市场上现有的松材线虫监测仪器，体积普遍较大，便携性差，并且操作流程较为复杂，需专业技术人员才可使用，与当前口岸一线技术能力不匹配。已发表的松材线虫核酸检测都集中于扩增与检测方法学开发，针对基层实际应用需求的产品研究较少，且没有研发出便携(≤10 Kg)的系统，能够在没有外接电源的前提下，快速(≤40分钟)检测出松材线虫虫液或含松材线虫的木屑样本。因此，基于目前市面上松材线虫检测设备的情况，对已有的松材线虫诊断技术设备进行改进与完善，开发操作简单，灵敏度高，便于携带的松材线虫快检设备就显得极为必要。
2. 材料和方法
2.1. 试验流程
使用松材线虫便携式分子检测仪以及配套试剂盒，按照说明书对一批木屑样品和松材线虫样品进行检测测试，提取木屑样本DNA，每次提取进行两次复孔测试，并与改良漏斗法及形态学方法进行比对。
2.2. 试验设备
苏州晶瑞生物科技有限公司研发的松材线虫便携式分子检测仪主机1台，掌上混匀仪1台，掌上金属浴1台，配套木屑(松材线虫)核酸提取试剂盒3盒，松材线虫荧光恒温扩增检测试剂盒3盒。
2.3. 试验材料
宁波海关提供的松材木屑测试样品共计3份，3批次。液浸线虫2份，2批次。
2.4. 木屑样本测试方法
使用松材线虫便携式分子检测仪以及配套试剂盒，按照说明书对试验材料的木屑样本进行DNA提取和DNA检测。打开样本处理及核酸快检试剂盒，将待测线虫样品挑入裂解液管，95℃加热10分钟获得DNA模板，吸取10微升DNA模版或对照加入至酶干粉管并盖上激活液套管，放入混匀仪运行“混匀”模式2分钟，放入荧光检测仪，经过15分钟后即可得到检测结果。每次DNA提取进行两次复孔测试，并与改良漏斗法进行比对。检测结果见表1。
3. 结果与讨论
据试验过程用时统计，松材线虫分离及DNA提取时长约10分钟；松材线虫DNA检测及分析时长约20分钟。而传统的松材线虫检测方法用时较长，通常都需要24 h以上。使用该方法仅需要30分钟即可得到结果，大大节约了时间成本。
Table 1. Summary of pine wood chip testing results
表1. 松材木屑检测结果汇总
| 批次编号 |
原始编号 |
结果判定 |
备注 |
| 1 |
木屑A |
阴性 |
常规漏斗法检测无松材线虫 |
| 2 |
木屑A1 |
阳性 |
常规漏斗法检测松材线虫含量10条/50g |
| 3 |
木屑C1 |
阳性 |
常规漏斗法检测松材线虫含量100条/50g |
| 4 |
线虫A |
阳性 |
形态学鉴定为松材线虫 |
| 5 |
线虫B |
阴性 |
形态学鉴定为拟松材线虫 |
被测试木屑样品共计3份，3批次(如表1)。其中，运用常规分离方法在木屑A1和木屑C1中经过分离和形态学鉴定检测到2批松材线虫，木屑A利用常规漏斗法检测无松材线虫，其木屑A1的松材线虫含量分别为10条/50g，木屑C1的松材线虫含量为100条/50g。使用便携式松材线虫分子检测系统仅需要30 min即可完成对3批木屑样本的检测，且检测结果符合率为100%，与形态学鉴定相比，准确率显著提高。
随着我国《“十二五”绿色建筑和绿色生态城区发展规划》的执行及国家经贸稳步发展，我国对木材的需求量一直呈上升趋势，已成为世界上最大的原木进口国[32]。来源广泛、价格低廉的木质包装在国际贸易中被大量使用，然而原木和木质包装极易携带昆虫、线虫等有害生物，是检疫风险极高、备受关注的敏感货物[33]。随着进口木材及木质包装数量增加，对口岸通关速度提出进一步要求。要提高口岸检验检疫效率，要求开发出操作便捷、便于携带、结果快速准确，便于口岸一线使用的松材线虫快检设备。很长一段时间以来，形态学观察法是口岸最常用的方法，采用100 μL移液枪吸取离心管底部线虫悬浮液滴至载玻片，在体视解剖镜下用10 μL移液枪分别挑取线虫雌、雄成虫各1头以上，将其置于酒精灯火焰上方加热3~5 s，线虫热杀死后加盖玻片，制成临时玻片，在显微镜下观察线虫形态特征并进行鉴定。未见线虫成虫虫态的用10 μL移液枪挑取线虫幼虫100头接种到灰葡萄孢菌培养基上，25℃培养箱培养5~10 d，待灰葡萄孢菌丝被取食完毕，用蒸馏水将线虫洗出获得线虫成虫；部分木样充分吸水后于30℃恒温培养72 h [34]。但该方法最主要的缺点是分离所需时间较长，并且分离获得线虫之后，制片、拍照、鉴定也需要较高的技术操作能力，对操作人员的技术要求较高，不适用于口岸一线的快速检测。近年来，分子检测技术迅速发展，特异性强、灵敏度高，相对于形态学方法大大提高了检测结果准确性。但成本较高，操作流程较为复杂，难以做到即时检测。
经对比检测，此便携式松材线虫快检设备结果稳定，灵敏度显著优于常规线虫鉴定方法，对于单条线虫也可迅速准确检出。大大缩短了检测时间，提高了检测效率；简化操作流程，降低了操作难度，方便一线使用。同时，此套设备灵敏度高、方便便携，适合用于口岸对原木和木质包装中松材线虫的初筛以及分离得到线虫后的快速鉴定。
基金项目
海科中心自立科研课题(2023HZ02)。
NOTES
*通讯作者。