摘要: 目的：基于网络药理学探讨玉屏风散增强免疫力的活性化合物及作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)检索玉屏风散组方中黄芪、防风、白术的化学成分，设置筛选条件得到有效活性化合物及对应靶点，通过UniProt数据库对靶点进行标准化处理；通过GeneCards数据库和在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)检索与免疫相关的靶点并进行相应筛选；使用Venny2.1软件将药物靶点和与免疫相关的靶点导入，绘制韦恩图以获得交集靶点，使用Cytoscape3.9.1绘制“药物–疾病–活性化合物–靶点”交互关系网络图；将交集靶点导入String数据库，绘制蛋白相互作用(PPI)网络，并在Cytoscape3.9.1中对PPI网络进行优化处理以筛选出核心靶点；使用Metascape数据库对核心靶点进行GO功能和KEGG通路的富集分析，并在Bioinformatics平台上对分析结果进行可视化处理。结果：得到了44种玉屏风散的活性化合物和215种经统一标准化命名的靶点，免疫相关靶点7220个，交集靶点184个，核心靶点38个；GO分子功能(MF)有63个条目，GO生物学过程(BP)有1059个条目，GO细胞组分(CC)有34个条目。此外，KEGG Pathway富集分析确定了171条通路。结论：玉屏风散可能通过介导氧化应激反应、炎症反应，RNA聚合酶II转录调节，DNA结合转录因子结合等作用于IL-17、AGE-RAGE、PI3K-Akt信号通路，调控AKT1、TNF、IL6等靶点，发挥增强免疫力的作用。
Abstract: Objective: Based on network pharmacology, this study aims to explore the active compounds and mechanisms of Yu Ping Feng San in enhancing immune function. Methods: The chemical components of Huang Qi, Fang Feng, and Bai Zhu in the formula of Yu Ping Feng San were retrieved from the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). Filtering criteria were set to obtain effective active compounds and their corresponding targets. The targets were standardized using the UniProt database. Immune-related targets were retrieved from the Gene Cards database and the Online Mendelian Inheritance in Man database (OMIM), and corresponding screening was performed. The drug targets and immune-related targets were imported into Venny2.1 software to obtain the intersection targets, and the “drug-disease-active compound-target” interaction network was visualized using Cytoscape3.9.1. The intersection targets were imported into the STRING database to construct a protein-protein interaction (PPI) network, and the PPI network was optimized using Cytoscape3.9.1 to screen for core targets. The core targets were subjected to enrichment analysis of Gene Ontology (GO) functions and KEGG pathways using the Metascape database, and the analysis results were visualized using the Bioinformatics platform. Results: A total of 44 active compounds of Yu Ping Feng San and 215 targets with standardized names were obtained. Among them, there were 7220 immune-related targets, 184 intersection targets, and 38 core targets. GO analysis showed 63 entries for molecular function (MF), 1059 entries for biological process (BP), and 34 entries for cellular component (CC). In addition, KEGG pathway enrichment analysis identified 171 pathways. Conclusion: Yu Ping Feng San may enhance immune function by mediating oxidative stress response, inflammatory response, RNA polymerase II transcription regulation, DNA binding transcription factor binding, and acting on IL-17, AGE-RAGE, and PI3K-Akt signaling pathways, and regulating targets such as AKT1, TNF, and IL6.
1. 引言
近年来，免疫力低下已成为全球范围内的一个重要问题。免疫力低下的人群相较于健康人群患各种疾病的风险会大大提升，如临床常见的荨麻疹、湿疹、过敏性紫癜、带状疱疹等皮肤疾病[1]，感冒、上呼吸道感染[2]、消化道感染、泌尿道感染等感染性疾病，结缔组织疾病，传染性疾病，肿瘤性疾病等[3]，这些疾病的发生发展均与免疫力低下有相应联系，会对人们的日常生活产生极大影响。目前，人们对于提高免疫力的方法和药物的研究变得越来越重要[4]-[7]。在这其中，中药作为一种传统的治疗方法，被广泛应用于提高免疫力的领域。《黄帝内经》曰：“正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚”，免疫力与中医“正气”的概念有异曲同工之妙，而玉屏分散作为益气固表的代表方剂，其药物组成黄芪、防风、白术在现代药理作用研究中均在免疫调节方面发挥作用[8]-[11]，因此玉屏风散在提高免疫力方面具有潜在的作用。本研究旨在通过网络药理学的方法，利用网络药理学多靶点、多通道、多途径、结果可视化等的特点，探究玉屏风散增强免疫力的作用机制。
2. 资料与方法
2.1. 玉屏风散有效活性化合物及靶点的搜集
通过中药系统药理学数据库与分析平台检索玉屏风散组方中黄芪、防风、白术的化学成分，设定筛选条件为药物口服生物利用度(Oral bioavailability, OB) ≥ 30%，药物相似性(Drug-likeness, DL) ≥ 0.18，得到有效活性化合物。通过TCMSP中靶点预测功能得到有效活性化合物对应的靶点，靶点来源于DrugBank，并使用UniProt数据库对靶点进行统一标准化命名。
2.2. 免疫相关的靶点的获取
通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM, http://omim.org)进行免疫相关靶点的检索，检索词分别为“immunity”、“hy.poimmunity”、“develop immunity from disease”，设定筛选条件为Relevance score ≥ 10.11，把所有符合筛选条件的靶点进行整合处理并去掉重复值保留唯一。
2.3. 玉屏风散增强免疫力的潜在靶点的获取和蛋白质相互作用(PPI)网络构建
将符合条件的玉屏风散靶点与免疫相关靶点导入Venny2.1软件绘制韦恩图，从而得到玉屏风散与免疫相关靶点的交集，此交集靶点便是玉屏风散增强免疫力的潜在靶点。使用Cytoscape3.9.1绘制“药物–疾病–活性化合物–靶点”交互关系网络图。利用String数据库(http://string-db.org)，选择Multiple proteins，将物种设置为“Homo sapiens”，设置中等置信度“medium confidence = 0.4”，得到蛋白质相互作用的PPI网络，并使用Cytoscape3.9.1对PPI网络进行优化分析，分别以Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality为参考依据，筛选条件为其Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality值 ≥ 平均值，筛选出交集靶点中的核心靶点。
2.4. 核心靶点富集通路分析
将核心靶点导入Metascape数据库，物种设置为“Homo sapiens”，选择CustomAnylysis，分别进行GO分子功能、GO生物学过程、GO细胞组分、KEGG Pathway富集分析，对富集分析的结果在Bioinformatics平台中进行可视化处理，得到相应气泡图。
3. 结果
3.1. 玉屏风散主要活性化合物及靶点
在TCMSP数据库中检索玉屏风散组方得到的符合筛选条件的活性化合物共45种，其中黄芪20种、防风18种、白术7种，对得到的结果进行删除重复值处理，得到有效活性化合物共44种(白术与黄芪有一种相同的活性化合物) (见图1)。通过TCMSP中靶点预测功能得到44种有效活性化合物对应的靶点共226种，在Uniport数据库中经统一标准化命名的靶点共215种。
Figure 1. Drug composition and corresponding active compounds of Yupingfeng powder
图1. 玉屏风散药物组成及对应活性化合物
3.2. 免疫相关靶点预测
通过核心词汇检索，在GeneCard数据库中检索到符合筛选条件的免疫相关靶点6838个，在OMIM数据库中检索到符合筛选条件的免疫相关靶点532个。将所有靶点汇总后去除重复值，共得到7220个符合筛选条件的免疫相关靶点。
3.3. 玉屏风散增强免疫力的“药物–疾病–活性化合物–靶点”网络图构建
将玉屏风散药物组成的靶点与免疫相关靶点共同导入Venny2.1软件绘制韦恩图(见图2)，得到184个交集靶点，即玉屏风散提升免疫力的潜在靶点。利用Cytoscape3.9.1绘制“药物–疾病–活性化合物–靶点”网络图(见图3)，图中蓝色节点为活性化合物对应的MOLID，浅褐色、深褐色节点代表药物活性靶点，连线越密集代表相互作用关系越强，联系越多。图中活性化合物为7-O-甲基异微凸剑叶莎醇(7-O-methylisomucronulatol)、槲皮素(quercetin)、异鼠李素(isorhamnetin)所拥有的活性靶点最多，且与免疫相关的活性化合物靶点占绝大多数，更加表明玉屏风散在提升免疫力方面发挥巨大作用。
Figure 2. Venn diagram of Yupingfeng powder targets and immune related targets
图2. 玉屏风散靶点与免疫相关靶点韦恩图
Figure 3. “Drug Disease Active Compound Target” diagram
图3. “药物–疾病–活性化合物–靶点”图
3.4. PPI网络构建与核心靶点的获取
将184个潜在靶点导入String数据库构建PPI网络(见图4)，其中一个靶点与其余靶点均无联系，该网络共有184个点，3783条边，平均节度值41.3，通过Cytoscape3.9.1对该PPI网络进行优化处理(见图5)，在软件中设置靶点的Degree值和靶点的颜色深度成正比，颜色越深表明该靶点在整个网络中发挥的作用越大。运行CytoNCA，计算出各靶点Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality值，均大于(包括等于)该三个值的潜在靶点共38个，即为玉屏风散提高免疫力的核心靶点(见图6)。
Figure 4. Core target PPI network
图4. 核心靶点PPI网络
Figure 5. Visualization analysis of core target PPI network
图5. 核心靶点PPI网络可视化分析
Figure 6. Results after core target screening
图6. 核心靶点筛选后结果
3.5. 核心靶点GO功能分析和KEGG富集分析
将PPI网络中的38个核心靶点导入Metascape数据库，分别进行GO MF、GO BP、GO CC、KEGG Pathway富集分析，得到63个MF条目、1059个BP条目和34个CC条目，根据log P值各筛选出前20个条目进行可视化分析，得到相应气泡图，其中节点大小代表基因数量的多少，颜色深浅代表P值的大小。结果显示，分子功能(见图7)主要包括DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合(RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding)、转录共调节因子结合(transcription coregulator binding)、转录因子结合(transcription factor binding)等；生物学过程(见图8)主要包括对激素的反应(response to hormone)、对氧化应激的反应(response to decreased oxygen levels)、miRNA代谢过程的正调控(positive regulation of miRNA metabolic process)、miRNA转录的正调控(positive regulation of miRNA transcription)等；细胞组分(见图9)主要包括常染色质(euchromatin)、RNA聚合酶II转录调节复合体(RNA polymerase II transcription regulator complex)、转录调节复合体(transcription regulator complex)、细胞质囊泡腔(cytoplasmic vesicle lumen)、等离子体膜筏(plasma membrane raft)等。KEGG通路分析共得到171条信号网络通路，根据log P值筛选出前20通路进行可视化分析(见图10)，玉屏风散提升免疫力与多种疾病、信号、代谢通路相关，包括癌症通路(Pathways in cancer)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、内分泌抵抗(Endocrine resistance)、乙型肝炎(Hepatitis B)、化学致癌–受体激活(Chemical carcinogenesis-receptor activation)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)等。在Cytoscape3.9.1中绘制“药物–疾病–活性化合物–靶点–通路”图(见图11)。
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Figure 7. Bubble diagram of GO molecular function (abscissa represents enrichment)
图7. GO分子功能气泡图(横坐标代表enrichment)
Figure 8. Bubble diagram of GO biological process (abscissa reports enrichment)
图8. GO生物学过程气泡图(横坐标代表enrichment)
Figure 9. Bubble plot of GO cell components (abscissa represents enrichment)
图9. GO细胞组分气泡图(横坐标代表enrichment)
Figure 10. KEGG bubble chart (abscissa represents enrichment)
图10. KEGG气泡图(横坐标代表enrichment)
4. 总结与讨论
网络药理学在中药药效物理研究、中药药理学作用机制、中药复方新药的开发等方面具有极其广阔的前景。通过对玉屏风散进行网络药理学分析，得到了玉屏风散组方中各中药的活性化合物与相应的靶点蛋白，构建了玉屏风撒与免疫相关的PPI网络，这些结果也是中药成分复杂，靶点丰富，作用广泛，治疗途径多样的体现。富集分析得到了玉屏风散提高免疫力的核心靶点的GO分子功能、GO生物学过程、GO细胞组分、KEGG通路的所有条目。
Figure 11. “Drug Disease Active Compound Target Pathway” diagram
图11. “药物–疾病–活性化合物–靶点–通路”图
免疫力下降并不是一种单一疾病，它是一些疾病发生发展的潜在条件，现在提升免疫力的方法众多，如细胞因子、生物制剂等[5]-[7]，而中药组方在这些方法中也扮演着重要角色，最常用的便是玉屏风散[12]。张静等[13]选取80例符合诊断标准的反复呼吸道感染复感儿随机分为两组，两组都给予对症基础治疗，在此基础上，对照组给口服芙露饮口服液，治疗组给予口服玉屏风散合异功散进行治疗。通过对两组患儿CD3+、CD4+、IgA、IgG、IgM水平的比较，论证了口服玉屏风散合异功散可以提高复感儿的免疫力。李晓琳[14]以哈尔滨体育学院单板U型场地滑雪运动员为研究对象，运用临床试验法，以玉屏风散为干预手段，测试相关指标，论证了玉屏风散对于运动员免疫力具有一定增强作用。李雪嫣等[15]比较复方玉屏风散口服液和复芪止汗颗粒在提高免疫抑制小鼠细胞免疫功能方面的差异。先制备模型，分别以生理盐水、玉屏风散口服液和复芪止汗颗粒灌胃，测定其胸腺和脾脏指数、T淋巴细胞增殖指数，T淋巴细胞亚群、INF-γ水平及腹腔巨噬细胞吞噬指数。结果表明玉屏风散口服液提高免疫抑制小鼠的细胞免疫功能效果优于复芪止汗颗粒。
网络药理学分析核心靶点中排名前十的靶点AKT1、TNF、IL6、TP53、IL1B、JUN、ESR1、PTGS2、MMP9、BCL2与槲皮素(quercetin)、汉黄芩素(wogonin)、山奈酚(kaempferol)均有相应联系，说明这三种化合物在免疫调控中发挥重要作用。田瑞雪等[16]探讨槲皮素对免疫低下小鼠免疫功能的影响，将C57BL/6小鼠分为正常对照组、环磷酰胺组(CTX)、槲皮素组(Que)，每组10只，连续灌胃20天，通过计算小鼠外周血白细胞、小鼠免疫器官指数、T、B淋巴细胞增殖、巨噬细胞吞噬、脾细胞CD4比例和CD4/CD8比值及细胞凋亡率，探讨槲皮素对小鼠免疫功能的影响，结果显示，与CTX组相比，Que组的外周血白细胞计数、脾指数、T淋巴细胞增殖率均升高，CD4比例及CD4/CD8比值升高，淋巴细胞凋亡比率降低；与正常对照组相比，淋巴细胞凋亡比率升高，其余无统计学意义，两组结果表明槲皮素可以显著增强环磷酰胺造成的免疫低下小鼠的免疫功能。刘晟文等[17]对槲皮素药理作用研究进展进行综述，表明槲皮素通过抑制淋巴细胞活化和增殖来发挥免疫调节。肖炜明等[18]对汉黄芩素抗肿瘤和免疫调节作用的研究进展进行综述，通过汉黄芩素的抗肿瘤活性以及对巨噬细胞、T细胞、树突状细胞、NK细胞四个方面的作用，表明汉黄芩素对肿瘤细胞的杀伤作用有独特的作用机制，同时又具有调节免疫功能的作用。吴绮丽等[19]通过探讨汉黄芩素在刀豆蛋白A诱导免疫性肝损伤中的保护作用，设计相关实验表明汉黄岑素通过诱导中性粒细胞凋亡，减少肝脏中性粒细胞浸润，从而减轻免疫性肝损伤。这一结果提示汉黄芩素对治疗免疫性肝损伤具有潜在的临床应用价值，而这则体现了汉黄芩素对人体免疫力的增强作用。肖炜明[20]通过研究汉黄芩素对胃癌生长及细胞免疫功能的影响，肿瘤组织中CD3+T、CD4+T、NK细胞的浸润下降，且其活化标志的表达也下降，提示汉黄芩素与常用化疗药物具有的免疫抑制效应不同，其可通过增强机体的免疫功能而发挥抗胃癌作用。慕静静等[21]研究山奈酚对小鼠T细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响，并对其免疫调节作用进行初步探讨。通过对T细胞的细胞周期的测定，表明山奈酚可抑制T淋巴细胞进入细胞分裂期，可有效地控制对机体有害的免疫应答。因为T淋巴细胞的过度活化和增殖可导致自身免疫病和器官移植排斥反应的发生。
GO功能富集分析表明玉屏风散可能通过氧化应激反应、炎症反应、DNA结合转录因子结合、miRNA转录的正调控、RNA聚合酶II转录调节、细胞质囊泡腔、等离子体膜筏等提升免疫力。
免疫信号通路是调节免疫系统功能的关键。玉屏风散可能通过调控免疫信号通路的激活或抑制，影响免疫力的提高[22] [23]。根据KEGG通路富集分析结果可知，玉屏风散对免疫力的调节主要与AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路有直接联系。而其他通路如癌症通路、乙型肝炎通路、内分泌抵抗通路、化学致癌-受体激活通路等则说明玉屏风散可能对病毒感染类疾病、癌症、内分泌调节等有一定作用，且这些健康问题与免疫力异常均有相应联系，更加证明玉屏风散在调节免疫力方面扮演重要角色。
PPI网络分析结果发现，AKT1、TNF、IL6、TP53、IL1B、JUN、ESR1、PTGS2、MMP9、BCL2、MYC、HIF1A、FOS、PPARGTGFB1、PTEN、CCND1、EGF、FN1、IL10、IFNG等38个靶点是PPI网络的关键靶蛋白，玉屏风散提升免疫力则可能是通过上述信号通路这些关键靶蛋白作用的结果。AKT1作为度中心性值、中介中心性值、接近中心性值最高的基因靶点值得我们关注并探讨，且之前对此靶点的探讨并不常见。AKT1 [24]作为一种重要的信号分子，在细胞周期、生长、存活、代谢以及免疫反应中发挥着不可或缺的作用。AKT1 [25] [26]激活能够促使免疫细胞的生存和增殖，从而增强免疫细胞的数量和功能；能够促进免疫细胞的分化成熟，增强其功能，如促进T细胞的分化成为效应性T细胞，增强其攻击病原体的能力，此外，AKT1 [27]还能够调控免疫细胞的信号转导通路，影响免疫细胞的活化和功能发挥；AKT1激活能够促进免疫细胞的信号转导，增强免疫细胞对病原体的识别和攻击能力。K Ai等[24]使用尼罗罗非鱼模型，研究了AKT1在硬骨鱼适应性免疫中的调节作用。结果表明，AKT1参与了尼罗罗非鱼的初级适应性免疫反应，且脾淋巴细胞被T细胞特异性有丝分裂原PHA或淋巴细胞激动剂PMA激活后，其AKT1转录物或磷酸化显著增强。其次，特异性抑制剂对AKT1的抑制作用，影响了脾淋巴细胞中T细胞激活，通过对CD44、IFN-γ和CD122的测定，表明AKT1在调节尼罗罗非鱼淋巴细胞增殖中发挥关键作用。此研究说明AKT1通过相应信号通路促进淋巴细胞活化和增殖，从而调节尼罗罗非鱼的适应性免疫反应，为适应性免疫系统的进化提供了新的见解，也为该基因靶点的应用打开了新思路。
总之玉屏风散的组成成分中含有一些被认为具有提高免疫力的中草药[8]-[10]，这可能是其增强免疫力的潜在机制之一。其次，玉屏风散与免疫相关基因的互作网络分析显示，玉屏风散可能通过调节免疫相关基因的表达，影响免疫系统的功能。此外，玉屏风散还可能通过[12]调节免疫细胞的增殖、分泌细胞因子和免疫活性等方面的影响，增强免疫力。最后，玉屏风散可能通过调控免疫信号通路的激活或抑制，影响免疫力的提高。综上所述，基于网络药理学的研究方法，我们初步探究了玉屏风散增强免疫力的作用机制。然而，仍然有许多未知的因素需要进一步研究，如玉屏风散的剂量和用药时间对免疫力的影响，以及其与其他药物的相互作用等。未来的研究可以通过动物实验和临床试验来验证这些结果，并进一步深入探究玉屏风散的免疫调节机制。此外，基于网络药理学的方法也可以应用于其他中药的研究，以进一步推动中药在提高免疫力方面的应用和发展。
基金项目
国家自然科学基金面上项目(81873312)；黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2022H077)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。