1. 引言
青枯病、黑胫病是我国烟草生产上较为常见的土传细菌性根茎类病害之一[1] [2]。据文献，除东三省外，其他烟区均有青枯病、黑胫病的发生，西南烟区更是普遍、频繁、严重发生[3] [4]，在烟草感染其他病害烟株根系抗性弱时，青枯病发病率则可增至75% [5]。目前，对于青枯病、黑胫病等土传病害的防治，有作物轮作、高抗病烤烟品种选育、土壤酸碱度调控、化学药剂防治、生物菌剂防治等防治手段，在一定程度上起到了一定的防治效果，降低了病害发病率，但同时带来了有毒化学农药的残留、病原微生物抗药性的增强、土壤水体污染等影响生态和人体健康的副作用[6]-[8]。因此，对环境友好且符合现代农业可持续发展战略理念的生物防治方法已成为当今研究和开发的热点[9]。近年来，诱导抗性因具有广谱性，持久性和安全性等方面优点受到许多植保研究者的关注[10]-[12]。本研究旨在验证生物拮抗菌剂和抗性诱导剂在烟草青枯病和黑胫病方面的作用，为烤烟生产绿色防控和可持续发展提供技术支持。
2. 材料与方法
2.1. 供试材料
试验于温室进行，采用云烟87品种，供试土壤为烟田土壤与育苗基质(m:m = 7:3)混合后的土壤，烟田土壤取自中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地。供试青枯病和黑胫病菌株由中国农业科学院烟草研究所植保保护研究中心提供。供试微生物菌剂：棘孢木霉·枯草芽孢杆菌菌剂，菌卫农功能型复合微生物菌剂，稼碧乐生物菌剂，阵地-5亿/mL多粘类芽孢杆菌KN-03液体，烟草腺毛二萜提取物10%微乳剂(抗性诱抗剂)。
2.2. 不同微生物菌剂对青枯菌和黑胫病的抑菌试验方法
将5种微生物菌剂分别稀释100倍，T1：棘孢木霉·枯草芽孢杆菌菌剂；T2：菌卫农功能型复合微生物菌剂；T3：稼碧乐生物菌剂；T4：阵地-5亿/mL多粘类芽孢杆菌KN-03液体；T5：烟草腺毛二萜提取物10%微乳剂，对照(CK)为无菌水。
2.2.1. 不同微生物菌剂对青枯菌的抑菌试验——打孔法
将活化后并确定有致病能力的青枯病菌接种在NB培养基中于28℃培养箱中培养48 h后，用接菌环挑取单一菌落接种于NA液体培养基中，在28℃条件下，180 rpm摇床中震荡培养48 h，用无菌水稀释至3 × l08 cfu/mL。用移液枪吸取100 μL配制好的青枯病菌悬液加入NB培养基中，用一次性无菌涂布棒涂抹均匀。将平板均匀分成3份，用直径为5 mm的打孔器均匀打取3个孔，每孔加入20 μL稀释好的微生物菌剂，置于28℃恒温培养箱中，静置培养2 d，每处理3次重复。
2.2.2. 不同微生物菌剂对黑胫病菌的抑菌试验——打孔法
将活化后并确定有致病能力的黒胫病菌接种在燕麦培养基上，于28℃培养箱中培养6 d备用。将燕麦培养基于背面划线均匀分成3等份，用直径为5 mm的打孔器均匀打取3个孔，每孔加入20 μL稀释好的微生物菌剂，于培养皿中央接入生长一致的直径5 mm的黑胫病菌，将培养皿倒扣，置于28℃恒温培养箱中，静置培养6 d，每处理3次重复。
2.3. 不同微生物菌剂对青枯病和黑胫病的防效盆栽试验
烟苗培育到4~5片叶时，移栽到直径为15 cm的花盆中，定植2周后，微生物菌剂灌根处理。共设置6个处理，每个处理20株烟苗，重复3次。对照CK，清水，100 mL灌根；T1：棘孢木霉•枯草芽孢杆菌菌剂，500倍，100 mL灌根；T2：菌卫农功能型复合微生物菌剂，300倍，100 mL灌根；T3：稼碧乐生物菌剂稀释250倍，100 mL灌根；T4：阵地-5亿/mL多粘类芽孢杆菌KN-03液体，125倍，100 mL灌根，T5：烟草腺毛二萜提取物10%微乳剂，稀释600倍，100 mL灌根。灌根处理后次日接种青枯菌(3 × 108 cfu/mL) 10盆，每盆15 mL；接种黑胫病菌菌丝(2.5 mg/mL)，10盆，每盆10 mL。盆栽试验在室内进行，每天8 h光照。每14 d灌根处理一次，共灌根3次。接种后每天观察烟苗发病情况，直至对照处理青枯病发病率达到80%以上，黑胫病发病率达到70%以上，参照《烟草病虫害分级及调查方法》进行病害分级，分别调查青枯病和黑胫病的发病率，计算病情指数。在移栽后30 d和45 d，调查烟株主要农艺性状，包括株高、叶数、最大叶长和最大叶宽。
发病率 = (发病株/调查总株数) × 100%。
病情指数 = [ ∑ (各级病株 × 该病级值)/(调查总株数 × 最高级值)] × 100。
2.4. 不同微生物菌剂对青枯病和黑胫病的防效大田试验方法
田间试验位于云南省文山州丘北县，采用随机区组小区试验；试验品种为云烟87。试验设5个处理，1个对照。T1.棘孢木霉·枯草芽孢杆菌菌剂(有效活菌数 ≥ 100亿活菌数/克，粉剂)，移栽时和移栽后10~20天，以灌根的形式分别接种菌剂1次，稀释500倍液灌根，每株用药液100毫升；烟叶打顶后菌剂稀释400倍液进行烟叶正反面均匀喷雾，每亩次用量约100克。T2.菌卫农功能型复合微生物菌剂(总有效活菌数 ≥ 200亿cfu/ml)，移栽时500倍稀释液灌根，菌剂每亩用量为300 mL；掏苗后封土前，500倍稀释液灌根，菌剂每亩用量不少于200 mL；团棵期至旺长期稀释400倍喷淋茎基部或灌根，每株用药量至少200 mL。T3.稼碧乐生物菌剂，移栽、掏苗后封土前、团棵期、旺长期施用；兑水稀释800倍灌根。T4.阵地(5亿/mL多粘类芽孢杆菌KN-03)，移栽、掏苗后封土前、团棵期、旺长期施用；稀释800~1000倍灌根。T5.烟草腺毛二萜提取物5%微乳剂，烟草大田移栽时、掏苗后封土前、团棵期施用，烟草腺毛二萜提取物，稀释350倍灌根。CK:清水。
田间烤烟移栽行株距120 cm × 50 cm，每个重复6行，每行20棵烤烟。试验田不再施用其他防治根茎类病害的农药。小区烤烟成熟后，单独采收，挂牌标记烘烤；烤后单独分级、称重，计算每个小区的烤烟经济性状；每个小区留代表性烟叶样品，检测其常规化学成分。
2.5. 数据处理
利用DPS 19.50统计分析软件进行数据统计分析，多重比较采用DUNCAN新复极差法。
3. 结果与分析
3.1. 不同菌剂对青枯菌和黑胫病的抑菌效果
3.1.1. 不同菌剂对青枯菌的抑菌效果
由图1可以看出T3和T5对青枯病均有抑菌效果；T3稼碧乐对青枯菌有较强的抑制作用，T5抑菌效果次之，T1、T2和T4未表现出抑菌效果。
Figure 1. Antibacterial effect of different microbial agents on pseudomonas aeruginosa
图1. 不同微生物菌剂对青枯菌的抑菌效果
3.1.2. 不同菌剂对黒胫病菌的抑菌效果，见图2
Figure 2. Antibacterial effect of different bacterial agents on black shank pathogen
图2. 不同菌剂对黒胫病菌的抑菌效果
3.2. 不同菌剂对青枯病和黑胫病的盆栽防效试验
由表1可以看出，不同微生物菌剂处理对烟草青枯病、黑胫病的发病率和病情指数均有明显影响。青枯病，与对照相比T1、T2、T3、T4、T5的发病率都有下降，T2与CK相比有显著差异。从病情指数来看，T2、T3与CK差异显著，T1、T4、T5与CK差异未达到显著。总体来看，T1处理效果较差，防效最低；T2为最优，防效最好，其次为T5，T3、T4防效相当。
Table 1. Control effect of different bacterial agents on tobacco bacterial wilt and black shank disease
表1. 不同菌剂处理对烟草青枯病和黑胫病的防治效果
| 时期Period |
处理Treatments |
株高Plant height |
最大叶长Maximum leaf length |
最大叶宽Maximum leaf width |
叶数Number of leaves |
| 移栽后30 d |
CK |
17.50 ± 1.98b, A |
35.50 ± 1.58a, A |
14.75 ± 1.15a, A |
10.50 ± 0.96a, A |
| T1 |
18.83 ± 2.03ab, A |
34.17 ± 3.67a, A |
13.00 ± 1.00a, A |
9.50 ± 0.76a, A |
| T2 |
21.67 ± 2.13a, A |
37.33 ± 2.69a, A |
14.42 ± 0.84a, A |
10.17 ± 1.34a, A |
| T3 |
21.50 ± 3.25a, A |
36.67 ± 3.64a, A |
13.83 ± 0.75a, A |
11.00 ± 0.58a, A |
| T4 |
18.67 ± 2.81ab, A |
35.75 ± 2.45a, A |
15.00 ± 0.65a, A |
9.83 ± 1.77a, A |
| T5 |
17.83 ± 2.73ab, A |
34.17 ± 2.19a, A |
13.58 ± 1.64a, A |
10.00 ± 1.15a, A |
| 移栽后45 d |
CK |
23.50 ± 2.75c, B |
36.50 ± 1.98a, A |
14.83 ± 1.07a, A |
11.83 ± 1.07a, A |
| T1 |
34.17 ± 4.60a, A |
35.67 ± 2.49a, A |
14.50 ± 0.50a, A |
12.83 ± 1.07a, A |
| T2 |
27.83 ± 4.14bc, B |
38.08 ± 3.30a, A |
14.50 ± 0.58a, A |
11.67 ± 1.49a, A |
| T3 |
31.33 ± 6.52b, B |
39.50 ± 2.87a, A |
14.17 ± 0.94a, A |
13.17 ± 1.67a, A |
| T4 |
34.00 ± 6.61a, A |
37.00 ± 1.63a, A |
15.00 ± 0.65a, A |
13.33 ± 1.60a, A |
| T5 |
24.00 ± 3.42c, B |
36.25 ± 2.63a a, A |
14.17 ± 0.85a, A |
11.83 ± 1.34a, A |
注：小写字母表示5%显著差异，大写字母表示1%显著差异。
由表1可以看出，不同微生物菌剂处理对烟草黑胫病的发病率和病情指数均有一定的影响。从发病率看，T2、T3、T4和T5处理烟株青枯病和黑胫病的发病率均显著低于对照，防治效果显著优于对照；从病情指数看，T2、T3处理青枯病病情指数极显著低于对照，T2、T3、T4和T5处理烟株黑胫病病情指数均极显著低于对照；T1处理烟株2种根茎类病害发病率与对照无显著差异。
3.3. 不同菌剂处理对接种病菌后烟株生长发育的影响
3.3.1. 不同菌剂处理对接种青枯病病菌后烟株生长发育的影响
Table 2. Agronomic traits of tobacco plants treated with different bacterial agents after inoculation with bacterial wilt disease
表2. 接种青枯病后不同菌剂处理烟株的农艺性状
| 时期Period |
处理Treatments |
株高Plant height |
最大叶长Maximum leaf length |
最大叶宽Maximum leaf width |
叶数Number of leaves |
| 移栽后30 d |
CK |
17.50 ± 1.98b, A |
35.50 ± 1.58a, A |
14.75 ± 1.15a, A |
10.50 ± 0.96a, A |
| T1 |
18.83 ± 2.03ab, A |
34.17 ± 3.67a, A |
13.00 ± 1.00a, A |
9.50 ± 0.76a, A |
| T2 |
21.67 ± 2.13a, A |
37.33 ± 2.69a, A |
14.42 ± 0.84a, A |
10.17 ± 1.34a, A |
| T3 |
21.50 ± 3.25a, A |
36.67 ± 3.64a, A |
13.83 ± 0.75a, A |
11.00 ± 0.58a, A |
| T4 |
18.67 ± 2.81ab, A |
35.75 ± 2.45a, A |
15.00 ± 0.65a, A |
9.83 ± 1.77a, A |
| T5 |
17.83 ± 2.73ab, A |
34.17 ± 2.19a, A |
13.58 ± 1.64a, A |
10.00 ± 1.15a, A |
| 移栽后45 d |
CK |
23.50 ± 2.75c, B |
36.50 ± 1.98a, A |
14.83 ± 1.07a, A |
11.83 ± 1.07a, A |
| T1 |
34.17 ± 4.60a, A |
35.67 ± 2.49a, A |
14.50 ± 0.50a, A |
12.83 ± 1.07a, A |
| T2 |
27.83 ± 4.14bc, B |
38.08 ± 3.30a, A |
14.50 ± 0.58a, A |
11.67 ± 1.49a, A |
| T3 |
31.33 ± 6.52b, B |
39.50 ± 2.87a, A |
14.17 ± 0.94a, A |
13.17 ± 1.67a, A |
| T4 |
34.00 ± 6.61a, A |
37.00 ± 1.63a, A |
15.00 ± 0.65a, A |
13.33 ± 1.60a, A |
| T5 |
24.00 ± 3.42c, B |
36.25 ± 2.63a a, A |
14.17 ± 0.85a, A |
11.83 ± 1.34a, A |
注：小写字母表示5%显著差异,大写字母表示1%显著差异。
由表2可以看出，微生物菌剂处理的烟株在移栽30 d后和移栽45 d后,其最大叶长、最大叶宽、叶数上没有显著差异。移栽30 d后，5个处理的株高均高于对照，其中T2、T3处理的株高显著高于对照，其余4个处理与对照没有显著差异。移栽45 d后，株高来看，T1、T3、T4与对照组有显著差异，其余处理差异不显著。
3.3.2. 不同菌剂处理对接种黑胫病病菌后烟株的生长发育的影响
由表3可以看出，移栽30 d后，各处理烟株的生长发育与对照有一定差异。T3、T5的株高大于对照，5个处理的最大叶长、最大叶宽均大于对照，T2、T3、T4、T5处理的叶数均高于对照；其中T3、T4、T5处理的最大叶宽和叶数与对照的差异达到显著水平。
移栽45 d后，T3、T4、T5处理烟株的生长发育优于对照。T3、T4、T5处理烟株的株高、最大叶长、最大叶宽、叶数均高于对照；其中，T5处理的株高与对照差异达到显著水平，所有5个处理烟株的最大叶长均显著高于对照，T2、T3、T4、T5处理烟株的最大叶宽与对照差异均达到显著水平。T1、T2处理差异不明显。
Table 3. Agronomic traits of tobacco plants treated with different bacterial agents after inoculation with black shank disease
表3. 接种黒胫病后不同菌剂处理烟株的农艺性状
| 时期Period |
处理Treatments |
株高Plant height |
最大叶长Maximum leaf length |
最大叶宽Maximum leaf width |
叶数Number of leaves |
| 移栽后30 d |
CK |
16.67 ± 3.25ab, A |
29.33 ± 4.38a, A |
10.75 ± 0.80c, A |
8.83 ± 0.37bc, A |
| T1 |
13.17 ± 3.13b, A |
35.17 ± 1.95a, A |
11.17 ± 1.31c, A |
8.17 ± 0.90c, A |
| T2 |
15.58 ± 2.68b, A |
35.00 ± 2.31a, A |
12.58 ± 1.79bc, A |
9.00 ± 1.00bc, A |
| T3 |
17.17 ± 2.19ab, A |
36.50 ± 1.98a, A |
15.17 ± 0.69a, A |
10.00 ± 1.29ab, A |
| T4 |
16.67 ± 3.09ab, A |
34.67 ± 2.69a, A |
14.50 ± 2.00ab, A |
10.00 ± 0.58ab, A |
| T5 |
20.50 ± 1.260a, A |
29.00 ± 11.72a, A |
14.83 ± 0.75a, A |
10.5. ± 0.76a, A |
| 移栽后45 d |
CK |
21.00 ± 3.94b, A |
29.38 ± 3.11b, A |
11.00 ± 0.71b, A |
11.00 ± 1.87abc, A |
| T1 |
18.75 ± 4.82b, A |
32.75 ± 4.76ba, A |
11.00 ± 0.71b, A |
9.50 ± 1.12c, A |
| T2 |
18.75 ± 3.34b, A |
33.25 ± 4.6ba, A |
13.00 ± 2.12ba, A |
10.50 ± 1.12bc, A |
| T3 |
26.50 ± 6.69ab, A |
39.00 ± 1.00a, A |
15.25 ± 0.83a, A |
13.25 ± 0.43a, A |
| T4 |
23.50 ± 7.89ab, A |
37.25 ± 2.17a, A |
14.88 ± 1.52a, A |
12.00 ± 0.71ab, A |
| T5 |
36.50 ± 9.55a, A |
36.75 ± 2.38a, A |
14.25 ± 0.43a, A |
12.75 ± 1.3ab, A |
注：小写字母表示5%显著差异，大写字母表示1%显著差异。
3.4. 不同菌剂处理对田间试验烤烟经济性状的影响
由表4数据可以看出，田间试验5个菌剂处理中，烟草腺毛二萜提取物对增加烤烟单位面积产量、产值有正向作用。烟草腺毛二萜提取物处理单位面积产量、产值高于对照处理，差异达到5%显著性；T2处理单位面积产量、产值分别增加8.25%、12.81%，T5处理单位面积产量、产值分别增加5.81%、15.85%。T4处理的单位面积产量高于对照处理，差异达到5%显著性。T1、T3处理与对照处理差异不显著。综合认为，烟草腺毛二萜提取物处理对增加烤烟经济性状有较明显的正向作用。
Table 4. Economic characteristics of tobacco treated with different microbial agents in field experiments
表4. 田间试验不同菌剂处理的烤烟经济性状
| 处理Treatments |
产量/kg/hm2Output/kg/hm2 |
产值元/hm2Output value yuan/hm2 |
均价元/kgAverage price yuan/kg |
上等烟比例%Ratio of premium tobacco leaves% |
| T1 |
2127.75 a, A |
64407.00 b, A |
30.27 a, A |
67.60 b, A |
| T2 |
2244.00 a, A |
69092.70 a, A |
30.79 a, A |
71.03 b, A |
| T3 |
2020.95 b, A |
59213.85 b, A |
29.30 a, A |
66.80 b, A |
| T4 |
2199.00 a, A |
65068.35 b, A |
29.59 a, A |
67.60 b, A |
| T5 |
2338.50 a, A |
75650.55 a, A |
32.35 a, A |
74.50 a, A |
| CK |
2073.00 b, A |
65299.50 b, A |
31.50 a, A |
67.20 b, A |
注：小写字母表示5%显著差异，大写字母表示1%显著差异。
3.5. 不同菌剂处理对烤烟常规化学成分的影响
Table 5. Conventional chemical composition of tobacco leaves treated with different methods in field experiments
表5. 田间试验不同处理烟叶常规化学成分
| 处理Treatments |
总植物碱/%Total alkaloids/% |
总糖/%Total sugar/% |
还原糖/%Reducing sugar/% |
总氮/%Total nitrogen/% |
钾/%Potassium/% |
糖碱比Reducing sugar/alkali |
氮碱比Nitrogen/alkaloid |
| T1 |
19.09 |
13.28 |
2.05 |
2.20 |
3.29 |
6.48 |
1.07 |
| T2 |
23.23 |
16.49 |
2.12 |
2.03 |
2.64 |
7.78 |
0.96 |
| T3 |
26.66 |
17.86 |
1.99 |
1.93 |
2.56 |
8.97 |
0.97 |
| T5 |
25.22 |
15.99 |
1.87 |
1.93 |
2.78 |
8.55 |
1.03 |
| CK |
24.49 |
16.21 |
1.91 |
2.14 |
2.92 |
8.49 |
1.12 |
| 适宜范围 |
18~24% |
16~22% |
1.5~3.5% |
1.5~3.5% |
>2% |
— |
— |
表5数据显示，所有处理和对照烟叶的常规化学成分基本处在适宜范围内。其中，T1烟叶的总糖、还原糖含量比对照偏低，糖碱比偏低；T2、T3处理烟叶总糖、还原糖含量高于对照；T3处理所产烟叶化学成分较适宜。
4. 结论
1) 抑菌实验显示，T3和T5对青枯病均有抑菌效果，T3对黑胫病菌有一定的抑菌效果。盆栽接种实验结果显示，T2、T3、T4和T5处理烟株青枯病和黑胫病的发病率均显著低于对照；T2、T3处理青枯病病情指数极显著低于对照，T2、T3、T4和T5处理烟株黑胫病病情指数均极显著低于对照。
2) 接种青枯病病源菌后，T2、T3处理的株高显著高于对照。移栽30 d后，T3、T4、T5处理的最大叶宽和叶数显著高于对照；移栽45 d后，T5处理的株高显著高于对照，5个处理烟株的最大叶长均显著高于对照，T2、T3、T4、T5处理烟株的最大叶宽显著高于对照。
3) 田间试验结果显示，稼碧乐生物菌剂和烟草诱抗剂处理对增加烤烟经济性状有较明显的正向作用；稼碧乐生物菌剂和烟草诱抗剂处理所产烟叶的化学成分指标较优。这可能与稼碧乐生物菌剂显著影响了烟草根际土壤细菌和真菌群落的多样性，并使根际微生物群落朝着更均衡的方向发展。
基金项目
云南省烟草公司文山州公司科技项目[烟草腺毛二酷诱导烤烟青枯病抗性研究与应用20245326003]；上海烟草集团有限责任公司项目[上烟集团文山州根茎类病害综合防治技术研究与推广20223100001-40542]。
NOTES
*通讯作者。