1. 引言
甲状腺癌是颈部最常见的恶性肿瘤，近年来发病率在全球范围持续上升，患者多通过甲状腺彩超等筛查得到初步诊断，确诊需要病理学检查。甲状腺乳头状癌(PTC)在甲状腺癌中占比90%以上，因此对甲状腺乳头状癌的研究有重要意义，寻找甲状腺乳头状癌简单易行的病理分子诊断指标尤为重要。
2. 资料与方法
2.1. 一般资料
采用随机对照研究的方法，选取2021年3月至2022年8月在青岛大学附属医院住院，经手术切除的甲状腺乳头状癌病例69例，结节性甲状腺肿40例，共109例患者。癌旁组织距肿瘤边缘 ≥ 1cm，<3 cm，病理证实癌旁组织未见癌细胞。研究经医院伦理委员会批准(伦理批件号：QYFY WZLL 28339)。纳入标准：1) 病历资料完整，病理诊断明确；2) 首次手术治疗，入组前无其它恶性肿瘤病史；3) 患者及其家属知情同意；甲状腺乳头状癌组男性26例，女性43例，年龄21~70岁，中位数年龄42岁，<55岁54例，≥55岁15例；≤1 cm的47例，>1 cm的22例；伴淋巴结转移22例，不伴淋巴结转移47例；单灶43例，多灶16例；Ⅰ + Ⅱ期66例，Ⅲ + Ⅳ期3例(见表2)。
2.2. 免疫组化试剂厂家及RRID (Research Resource Identifier，研究资源标识符)
江苏亲科生物研究中心有限公司的兔抗人MCM7单克隆抗体，RRID：AB-2838238，货号DF6272；兔抗人TACSTD2单克隆抗体，RRID：AB-2835463，货号DF3080。
2.3. 主要仪器型号、厂家
达科为(深圳)医疗设备有限公司的轮转式切片机，型号MT1。广州维格斯生物科技有限公司的漂片机和烤片机，型号分别是FL220、DR230。德国莱卡公司的封片机，型号CV5030。
2.4. 实验方法
所有标本均4 um厚连续切片，石蜡切片脱蜡、水化，采用MaxVision法进行MCM7和TACSTD2免疫标记，具体操作步骤按试剂说明书进行，抗原修复采用高压锅高温修复，DAB (3，3-二氨基联苯胺)显色，苏木素对比染色，中性树胶封片，镜下观察，用PBS缓冲溶液代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作为参考来对照实验切片染色情况。
2.5. 判断标准
采用双盲法对切片结果进行独立评估，对MCM7和TACSDT2阳性信号进行半定量评估。通过根据着色强度和染色细胞百分比进行综合判断，将结果分为阴性(−)、弱阳性(+)、中等阳性(++)、强阳性(+++)。综合评分的方法可更准确地评估切片结果，为后续研究提供重要参考。
2.6. 统计学处理
采用SPSS 24进行统计学分析。用多个率卡方检验分别计算出MCM7和TACSTD2在三组不同甲状腺组织阳性表达率的卡方检验结果，P < 0.05为差异有统计学意义。用多个率的卡方检验的多重比较Bonferroni方法再进行两两比较，多重比较结果发现甲状腺乳头状癌组、结节性甲状腺肿组和癌旁甲状腺组织组下方计数的下标字母分别为a、b、c，说明在检验水准a = 0.05的条件下三组两两之间有统计学差异。相关性分析发现MCM7和TACSTD2在三组不同甲状腺组织阳性表达率存在相关性，P < 0.01为差异有统计学意义。有序多分类logistic回归分析发现肿瘤直径与TACSTD2在甲状腺乳头状癌组中阳性表达呈正相关。平行线检验P = 0.255，>0.05，证明因变量TACSTD2在甲状腺乳头状癌中阳性表达分级(弱阳性、阳性、强阳性)是等差的，参数估算值是准确、有效的。肿瘤直径P = 0.016，<0.05提示TACSTD2在甲状腺乳头状癌中表达阳性程度与肿瘤直径有统计学意义。
3. 结果(见表1)
3.1. MCM7表达情况(见图1)
阳性信号为细胞核内出现棕黄色颗粒，69例甲状腺乳头状癌标本中67例呈阳性表达，阳性表达率为97.10%；其中强阳性表达(+++) 2例，阳性表达(++) 28例，弱阳性表达(+) 37例。40例结节性甲状腺肿标本中26例呈阳性表达，阳性表达率为65%，阳性表达、弱阳性表达分别为10例、16例，无强阳性表达。69例癌旁组织组弱阳性表达11例，阴性表达58例，阳性表达率15.94%。
3.2. TACSTD2表达情况(见图2)
阳性信号为细胞膜内出现棕黄色颗粒，69例甲状腺乳头状癌标本中68例呈阳性表达，阳性表达率为98.55%；其中强阳性表达(+++) 13例，阳性表达(++) 39例，弱阳性表达(+) 16例。40例结节性甲状腺肿标本中24例呈阳性表达，阳性表达率为60%，其中阳性表达9例，弱阳性表达15例，无强阳性表达。69例癌旁组织中12例呈弱阳性表达，阴性表达57例，阳性表达率17.39%。
Figure 1. Positive expression of MCM7 in different thyroid tissues En Vision, ×200
图1. MCM7 在不同甲状腺组织的表达(En Vision, ×200)
Figure 2. Positive expression of TACSTD2 in different thyroid tissues En Vision, ×200
图2. TACSTD2在不同甲状腺组织的表达(En Vision, ×200)
Table 1. MCM7 and TACSTD2 expression in different thyroid tissues
表1. MCM7和TACSTD2在不同甲状腺组织中的表达
| 组别 |
例数 |
MCM7 |
阳性率(%) |
TACSTD2 |
阳性率(%) |
| - |
+ |
++ |
+++ |
|
— |
+ |
++ |
+++ |
|
| 甲状腺乳头状癌组 |
69 |
2 |
37 |
28 |
2 |
97.1 |
1 |
16 |
39 |
13 |
98.6 |
| 结节性甲状腺肿组 |
40 |
14 |
16 |
10 |
0 |
65.0 |
16 |
15 |
9 |
0 |
60.0 |
| 癌旁甲状腺组织组 |
69 |
58 |
11 |
0 |
0 |
15.9 |
57 |
12 |
0 |
0 |
17.4 |
Table 2. Expression and clinical features of MCM7 and TACSTD2 in papillary thyroid carcinoma tissues
表2. MCM7和TACSTD2在甲状腺乳头状癌组织中的表达及临床特征
| 病例特征 |
例数 |
MCM7 |
TACSTD2 |
| 阳性 |
阴性 |
阳性率(%) |
阳性 |
阴性 |
阳性率(%) |
| 性别 |
|
|
|
|
|
|
|
| 男 |
26 |
25 |
1 |
96.2 |
26 |
0 |
100 |
| 女 |
43 |
42 |
1 |
97.7 |
42 |
1 |
97.7 |
| 年龄(岁) |
|
|
|
|
|
|
|
| ≥55 |
16 |
16 |
0 |
100 |
15 |
1 |
93.8 |
| <55 |
53 |
51 |
2 |
96.2 |
53 |
0 |
100 |
| 肿瘤直径(cm) |
|
|
|
|
|
|
|
| >1 |
23 |
23 |
0 |
100 |
22 |
1 |
96.0 |
| ≤1 |
46 |
44 |
2 |
95.7 |
46 |
0 |
100 |
| 侵及被膜否 |
|
|
|
|
|
|
|
| 侵及 |
41 |
40 |
1 |
97.6 |
40 |
1 |
97.6 |
| 未侵及 |
28 |
27 |
1 |
96.4 |
28 |
0 |
100 |
| 淋巴结转移 |
|
|
|
|
|
|
|
| 有 |
22 |
21 |
1 |
95.5 |
21 |
1 |
95.5 |
| 无 |
47 |
46 |
1 |
97.9 |
47 |
0 |
100 |
| 灶数 |
|
|
|
|
|
|
|
| 单灶 |
42 |
40 |
2 |
95.2 |
41 |
1 |
97.6 |
| 多灶 |
27 |
27 |
0 |
100 |
27 |
0 |
100 |
| 分期 |
|
|
|
|
|
|
|
| Ⅰ + Ⅱ |
66 |
64 |
2 |
97.0 |
65 |
1 |
98.5 |
| Ⅲ + Ⅳ |
3 |
3 |
0 |
100 |
3 |
0 |
100 |
Table 3. Chi-square test results of MCM7 in different thyroid tissues (Bonferroni method)
表3. MCM7在不同甲状腺组织卡方检验结果(Bonferroni法)
|
甲状腺乳头状癌组 |
结节性甲状腺肿组 |
癌旁甲状腺组织组 |
c2 |
P |
| 阳性 |
67(97.1%)a |
26(65%)b |
11(15.9%)c |
94.5 |
0.0001 |
| 阴性 |
2(2.9%)a |
14(35%)b |
58(84.1%)c |
|
|
如表3所示，卡方检验结果显示：卡方值 = 94.474，P = 0.0001，P < 0.05，说明MCM7在三组的阳性率表达总体上存在统计学差异，至少两组间存在差异，需要多重比较进行进一步分析。用多个率的卡方检验的多重比较Bonferroni方法进行两两比较，结果发现甲状腺乳头状癌组、结节性甲状腺肿组和癌旁甲状腺组织组下方计数的下标字母分别为a、b、c，说明在检验水准a = 0.05的条件下三组两两之间有统计学差异。
Table 4. Chi-square test results of TACSTD2 in different thyroid tissues (Bonferroni method)
表4. TACSTD2在不同甲状腺组织卡方检验结果(Bonferroni法)
|
甲状腺乳头状癌组 |
结节性甲状腺肿组 |
癌旁甲状腺组织组 |
c2 |
P |
| 阳性 |
68(98.6%)a |
24(60.0%)b |
12(17.4%)c |
93.6 |
0.001 |
| 阴性 |
1(1.4%)a |
16(40.0%)b |
57(82.6%)c |
|
|
如表4所示，卡方检验结果显示：卡方值 = 93.609，P = 0.0001，P < 0.05，说明TACSTD2在三组的阳性率表达总体上存在者统计学差异，至少两组间存在差异，需要多重比较进行进一步分析。再用多个率的卡方检验的多重比较Bonferroni方法进行两两比较，多重比较结果发现甲状腺乳头状癌组、结节性甲状腺肿组和癌旁甲状腺组织组下方计数的下标字母分别为a、b、c，说明在检验水准a = 0.05的条件下三组两两之间有统计学差异。
再进一步研究MCM7和TACSTD2在这三组甲状腺组织中的阳性表达率是否存在相关关系，利用SPSS进行相关性分析，结果如下表5。
Table 5. Correlation analysis of MCM7 and TACSTD2 positive expression in papillary thyroid carcinoma tissues
表5. MCM7与TACSTD2在甲状腺乳头状癌组织中阳性表达的相关性分析
|
MCM7 |
TACSTD2 |
| MCM7 |
1 |
0.383** |
| TACSTD2 |
0.383** |
1 |
注：**表示P < 0.01，*表示P < 0.05
MCM7与TACSTD2的斯皮尔曼相关系数rs为0.383，存在统计学意义，可以得出结论，TACSTD2与MCM7在甲状腺乳头状癌中的阳性表达率存在低度正相关。
进一步研究MCM7与TACSTD2阳性率表达与性别、年龄、肿瘤直径、有无侵及被膜、有无淋巴结转移、灶数以及肿瘤分期有无相关，进行有序logitics回归分析，结果如下表6。
Table 6. Ordinal multinomial logistic regression analysis of the influencing factors of the positive expression of TACSTD2 in papillary thyroid carcinoma
表6. TACSTD2在甲状腺乳头状癌中表达阳性率影响因素的有序多分类logistic回归分析
| 影响因素 |
B |
标准误差 |
瓦尔德自由度P |
95%置信区间 |
| 下限 |
上限 |
| 年龄 |
−0.008 |
0.022 |
0.122 |
1 |
0.727 |
−0.05 |
0.035 |
| 肿瘤直径 |
1.227 |
0.51 |
5.792 |
1 |
0.016 |
0.228 |
2.227 |
| 分期 |
−0.762 |
0.812 |
0.88 |
1 |
0.348 |
−2.354 |
0.83 |
| 性别 |
0.049 |
0.51 |
0.009 |
1 |
0.924 |
−0.951 |
1.049 |
| 有无侵及被膜 |
0.247 |
0.568 |
0.189 |
1 |
0.664 |
−0.867 |
1.361 |
| 有无淋巴结转移 |
−0.394 |
0.652 |
0.366 |
1 |
0.545 |
−1.672 |
0.883 |
| 灶数 |
0.705 |
0.539 |
1.71 |
1 |
0.191 |
−0.352 |
1.762 |
本次有序回归分析TACSTD2在甲状腺乳头状癌中表达阴性的未纳入分析，平行线检验P = 0.255，>0.05，证明因变量TACSTD2在甲状腺乳头状癌中阳性表达分级(弱阳性、阳性、强阳性)是等差的，参数估算值是准确、有效的。肿瘤直径P = 0.016，<0.05提示TACSTD2在甲状腺乳头状癌中表达阳性程度与肿瘤直径有统计学意义。
MCM7在甲状腺乳头状癌中阳性表达影响因素的有序多分类logistic回归分析没有统计学意义。
4. 讨论
甲状腺癌是最常见的颈部肿瘤，约90%为甲状腺乳头状癌，发病率女性偏高，且有逐年增加的趋势。据2018年我国癌症中心网的数据统计结果，甲状腺癌在常见的恶性肿瘤中居第七位，女性常见恶性肿瘤中居第四位[1]。该病一般无明显临床表现，多通过查体发现，现在临床最常用的检查方法是B超和超声引导下细针穿刺活检，有时也难以实现准确诊断。所以有必要寻找一种简单、方便的病理检测方法。在实际工作中，我们也注意到，超声和细针穿刺活检也会有一定误差，导致了假阴性或假阳性的结果。假阳性结果使患者遭受不必要的手术创伤，假阴性结果使患者因没能得到及时治疗而继续发展，致病灶增大侵犯周围神经、压迫气管甚至发生肺部等远处转移，极大影响患者的预后。因此寻找敏感的分子生物学指标，结合甲状腺彩超及超声引导下的细针穿刺活检进行辅助诊断，能够正确判断甲状腺结节的性质，尽早明确诊断，对患者的治疗及预后意义重大[2]。
对可疑甲状腺结节，定期随访也是非常必要的。临床工作中通过长期随访，发现彩超检查最初表现为良性的结节会逐渐恶变，最后经术后病理学检查证实为甲状腺恶性肿瘤，这或许能够解释MCM7和TACSTD2在结节性甲状腺肿组织也有一定的阳性率。张开玲[3]等研究发现CK19、Galectin-3和HBME-1抗体的同时表达作为甲状腺乳头状癌诊断标准，在鉴别甲状腺良恶性病变时的准确性最高。随着研究的不断深入，新的生物学指标不断被发现，肿瘤的发生发展可能经历漫长的过程，因而从细胞周期研究细胞如何演变成为关键环节。细胞周期的调控非常复杂，受到多种细胞因子、激素和细胞外环境的影响。细胞周期的失调可能导致细胞凋亡、异常增殖以及染色体畸变等疾病[4]。因此，对细胞周期的研究对于理解细胞生物学和疾病机制具有重要意义。
细胞周期是指从一次分裂完成到下一次分裂结束的整个过程，分为两个阶段：间期和分裂期(M期) [5]。间期又分为三个阶段，G1期(前期)、S期(复制期)、G2期(后期)。DNA在细胞分裂过程中的复制和合成是一个复杂而关键的过程，需要特定的复制启动点来进行。MCM7作为一个重要的蛋白质，在不同的细胞周期阶段扮演着不同的角色，调控DNA的复制和合成过程，如在G0期(G0期指细胞周期之外的静止期)表达量会减少，在S期与染色质解离并达到峰值，在M期MCM7会成为游离的微染色体，在细胞分化和凋亡过程中表达量也会减少[6]。MCM7的表达水平在细胞周期中呈现波动变化，这说明其在细胞生长和增殖中起着重要作用。通过对MCM7的研究发现，表明MCM7的表达水平对细胞的DNA复制能力有着重要的影响。高水平的MCM7可以提高DNA的复制速度，从而增加细胞的增殖速度和生长能力。因此，探究MCM7在细胞生长中的作用机制，有助于深入了解细胞周期调控以及疾病发展的机制。
本研究发现，MCM7在甲状腺乳头状癌的阳性表达显著高于对照组，但与患者性别、年龄、肿瘤大小、有无淋巴结转移、有无被膜侵犯、肿瘤病灶数量、分期无关。
TACSTD2是一种35kD的跨膜糖蛋白，由TACSTD2基因编码而成[7]，在调节肿瘤细胞增殖和迁移方面发挥着重要作用[8]。相关研究表明，TACSTD2在非小细胞肺癌的组织和细胞株中呈现过度表达，并能促进肺癌细胞的增殖和侵袭[9]。此外，过表达的TACSTD2还可促进某些肿瘤细胞(如卵巢癌)的增殖、浸润和侵袭[10]。近年来，越来越多的国内外专家对TACSTD2在甲状腺组织中的表达进行研究。Guan [11]等人对145例甲状腺乳头状癌患者进行了临床病理特征的研究，结果显示TACSTD2的过度表达与淋巴结转移和肿瘤向外扩散相关，被认为是一独立的危险因素。Canan [12]等人对29例滤泡性腺瘤、57例甲状腺乳头状癌和12例滤泡性甲状腺癌进行了TACSTD2的检测，结果显示在甲状腺乳头状癌组织和滤泡性甲状腺癌组织中，TACSTD2的表达阳性率明显高于滤泡性腺瘤组织。国内章萍萍[13]等的研究也发现TACSTD2的表达与甲状腺乳头状癌的淋巴结转移有关。国内外多位研究者发现，TACSTD2在多种肿瘤中过度表达与肿瘤的侵袭、增殖及淋巴结转移相关。而本研究发现，TACSTD2在甲状腺乳头状癌的阳性表达与肿瘤直径的正相关性，说明它与肿瘤的侵袭和增殖相关，而与淋巴结转移等因素无关。
越来越多的研究证明，TACSTD2在人实体肿瘤中表达升高，调控与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和转移相关的生物学过程，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。可作为肿瘤生物标志物和潜在的治疗靶点。本研究发现TACSTD2和MCM7在甲状腺乳头状癌组织中表达明显高于结节性甲状腺肿及癌旁甲状腺组织，而且两者呈低度正相关，说明两者促进甲状腺乳头状癌发生、发展具有协同作用，两种标志物联合检测将进一步提高甲状腺乳头状癌的诊断准确性。将多种临床病理参数进行有序多分类logistic回归，发现在甲状腺乳头状癌组织中，TACSTD2的表达与肿瘤最大直径呈正相关，而与年龄、性别、病灶数、有无被膜侵犯、有无淋巴结转移及肿瘤分期无关。提示TACSTD2表达与甲状腺乳头状癌的增殖关系密切，从而可能影响患者预后。
UALCAN数据库检索得出，MCM7和TACSTD2在甲状腺癌组织的表达均高于癌旁甲状腺组织，P值分别为0.0437、1.6 × 10−12，<0.05，有统计学意义，跟本研究结果一致(图3)。生存曲线(图4)显示，MCM7和TACSTD2在甲状腺癌患者的生存曲线，P值分别为0.66、0.09，>0.05，无统计学意义，说明MCM7和TACSTD2在甲状腺癌组织中的表达程度与患者预后没有明显相关性，这还需后续随访证实。从图1看，MCM7在PTC细胞核内出现棕黄色颗粒及染色细胞数明显高于结节性甲状腺组织，癌旁组织几乎看不到着色颗粒；图2也是类似结果。虽然MCM7和TACSTD2在结节性甲状腺肿组织的阳性表达率也有较高表达率，但阳性表达程度远低于PTC组织。在临床中也观察到，最初影像学检查表现为良性的甲状腺结节经漫长的(10余年)演变过程进展为恶性肿瘤，这或许能够解释MCM7和TACSTD2在结节性甲状腺肿组织也有一定的阳性表达率，阳性表达程度越高越接近恶性肿瘤，表达为阴性恶性可能较低或无。对可疑结节，甲状腺细针穿刺细胞做免疫组化，先将穿刺细胞离心制作成细胞蜡块，用细胞蜡块进行切片做免疫组化。另外，MCM7和TACSTD2在甲状腺癌组织同时表达说明两者存在协同作用，两者同时检测可提高PTC诊断准确率。由此可以得出，MCM7和TACSTD2有望成为诊断甲状腺乳头状癌的潜在标志物，TACSTD2的阳性表达与肿瘤直径呈正相关，可能参与肿瘤的发生发展。
Figure 3. The difference of MCM7 and TACSTD2 expression between thyroid cancer tissues and normal tissues
图3. MCM7和TACSTD2在甲状腺癌组织与正常组织的表达差异
Figure 4. Survival curves of MCM7 and TACSTD2 in thyroid cancer tissues with different
图4. MCM7和TACSTD2在甲状腺癌组织不同表达的生存曲线
NOTES
*通讯作者。