中药方剂葛根芩连汤缓解LPS诱导小鼠回肠炎症作用研究

Study on the Effects of the Chinese Herbal Formula Ge Gen Qin Lian Decoction in Alleviating LPS-Induced Ileal Inflammation in Mice

摘要: 本文拟研究葛根芩连汤(GQD)对脂多糖(LPS)刺激诱导的小鼠回肠炎症的抑制作用与对肠道菌群的调节作用。雄性C57BL/6小鼠经口给予治疗剂量的GQD和抗生素(ABX) 7 d，第8天腹腔注射10 mg/kg的LPS。使用HE染色和AB-PAS染色进行回肠组织学评价；RT-qPCR检测回肠组织炎症因子(IL-1 β、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-17和IL-22)、LPS受体(CD14、TLR4和MyD88) mRNA水平；ELISA测定超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量；对盲肠内容物与粪便进行细菌革兰氏染色计数。GQD显著降低了小鼠回肠组织中由LPS诱导的炎症因子的mRNA水平(IL-1 β、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-22、IL-10)，LPS受体(CD14、MyD88、TLR4)的表达、SOD活性、MDA含量、修复了上皮细胞之间的紧密连接。GQD一定程度上改变了肠道菌群的结构。GQD预处理可以通过改变肠道菌群和肠屏障在一定程度上减轻LPS导致的肠损伤。

Abstract: This paper investigates the inhibitory effects of Ge Gen Qin Lian Decoction (GQD) on LPS-induced intestinal inflammation and dysbiosis. Male C57BL/6 mice were given therapeutic doses of GQD and antibiotics (ABX) orally for 7 days, followed by LPS challenge (10 mg/kg) intraperitoneally on day 8. Histological evaluation was performed using HE and AB-PAS staining; RT-qPCR was performed to detect inflammatory factors (IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-10, IL-17 and IL-22), LPS receptors (CD14, TLR4 and MyD88) at mRNA levels; Superoxide Dismutase (SOD) activity and Malonic dialdehyde (MDA) content were determined using ELISA; Cecum and fecal bacterial Gram staining and 16S rDNA-Seq were used to analyze the changes of intestinal flora. GQD significantly reduced LPS-induced inflammatory factors (IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-17, IL-22, and IL-10), expression of LPS receptors (CD14, TLR4) and MyD88. GQD decreased SOD activity and MDA content, and repaired tight junctions between epithelial cells in mouse ileal tissues. GQD somewhat altered the structure. Pretreatment with GQD can change the intestinal flora and the intestinal barrier, and reduce the intestinal injury caused by LPS.

1. 引言

在感染性疾病的进展中，肠屏障和肠微生物的状态起着关键作用[1]-[3]。感染性疾病最危急的状况是发生脓毒症，宿主对感染失控，机体出现全身炎症反应、神经内分泌变化等异常反应并出现危及生命的多器官功能障碍[4] [5]。机体免疫功能紊乱、细菌内毒素和炎症介质大量释放，与脓毒症的发生密切相关。当发生肠外感染和严重创伤时，感染相关因子如革兰阴性菌，感染时脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)进入血循环达到肠部位以及导致的应激反应，均可使肠功能失调、肠屏障损伤；同时，肠道中的细菌、内毒素以及其他病原相关分子模式即可激发肠炎，使肠道免疫细胞过度激活、免疫介质过度释放以及使肠道细菌移位，最终可发展成为脓毒症[5]-[7]。因此，感染过程中，预防感染因素导致肠屏障损伤、肠炎的发生和肠道免疫介质的释放是预防感染进展成重症的重要防治手段。

近年来的研究表明，肠道菌群的组成结构及其代谢产物是影响肠道功能、肠屏障功能和肠免疫应答状态的重要因素[8] [9]。因此，发生感染性疾病时，调节肠道菌群的组成是预防肠功能失常和肠屏障损伤、发生肠炎和肠道免疫介质的释放、发生全身性炎症和多器官衰竭重症的重要环节。

中药及其方剂对肠微生态具有强大调节作用[10] [11]，既有抑菌和杀菌作用，也有促进益生菌生长以及抗氧化、抑制炎症、调节胃肠道功能的成分[12]-[15]。合理的配方可通过多靶点作用，可能实现对肠微生态进行有利于特定疾病状态的偏向性调节[16] [17]。葛根芩连汤(GQD)是著名的中药方剂，最早记载于张仲景的《伤寒论》[18]，在中国已超过2000年的临床应用历史。GQD由四种中草药组成：葛根、黄芩、黄连和甘草，具有解表清里的功效[19]。已有研究证实，GQD可通过改变肠道菌群组成影响肠–肺轴而减轻肺部炎症[20] [21]。也有研究指出，GQD可通过肠道菌群影响2型糖尿病、结肠炎、腹泻等疾病[22]。GQD用于感染性疾病的方剂对感染后肠道炎症的发生和对肠微生物的调节作用及机理的研究较少。

因此，为研究中医治疗感染性疾病的治疗机理，研究选用了GQD，并与具有清除肠道菌群效应的抗生素混合物形成对照，研究这些药物预处理对肠道菌群组成的影响，以及药物预处理后，对感染相关因子LPS激发的回肠屏障组织损伤和肠炎发生的作用，并分析中药预处理对肠道细菌结构的调节作用与预防回肠屏障组织损伤和肠炎发生的关联性。本研究为理解中医药治疗感染性疾病的治疗机理并进一步探索中药调节肠微生物的机制、方法和开发提供基础。

2. 材料与方法

2.1. 材料

根据中药煎煮标准方法制备葛根芩连汤(GQD)。药材粉葛(40 g)加入1 L水中浸泡60 min，煮沸后转小火熬制30 min。加入其他药材，包括酒黄芩(15 g)、酒黄连(15 g)、甘草(10 g)和葛根一起煮沸30 min获得第一个汤剂。加入1 L水一起煮沸30 min重复2次获得煎剂。最后，将3次汤剂混合，过滤后并浓缩为100 mL药液冰箱保存备用。GQD定量为100 mL/剂，于−20℃冰箱备用。

2.2. 方法

2.2.1. 动物模型建立

24只C57BL/6雄性小鼠(20~25 g)，将所有小鼠置于恒定条件下(温度(23℃ ± 1℃)，湿度(55% ± 10%)，12 h光/暗循环)，随意喂食标准饮食和水。所有小鼠在水和食物充足的条件下适应2周。根据多次预实验，组内测定值差异小且各组间具有统计学差异，确定每组动物数量为6只。将雄性C57BL/6小鼠随机分为4组(n = 6)：对照(CON)组、LPS组、抗生素(ABX) (氨苄青霉素100 mg/kg、甲硝唑100 mg/kg、新霉素100 mg/kg、万古霉素50 mg/kg)治疗组和GQD治疗组。根据临床患者(70 kg)一日一剂的中药剂量，换算为小鼠剂量。体表面积换算系数为0.0026，由此GQD给药剂量为10.4 g/kg。除对照组和LPS组外，其余三组给予7 d的药物预处理，每天2次，对照组小鼠给予等体积蒸馏水；于第8天，给予药物后1 h，除对照组外，其余3组腹腔注射LPS (10 mg/kg)，造模12 h后实施安乐死。所有涉及动物的实验治疗均经过重庆医科大学动物管理和使用委员会仔细审查和批准(IACUC-CQMU-2022-0010)，并尽一切努力将动物痛苦降至最低。详细的实验设计，如图1所示。

2.2.2. HE、AB-PAS染色

收集小鼠小肠组织并固定在新鲜制备的4%多聚甲醛中。每个组织用于制备至少5张载玻片。脱水、包埋、制成5 µm的石蜡切片，脱蜡、HE染色和AB-PAS染色，于光镜下观察组织学变化。病理评分包括炎性细胞浸润、上皮改变、黏膜结构，评分标准参照文献[23]。杯状细胞计数为选择10个不同视野数出细胞数量，所得结果为单个视野下平均数量，整个计数与评分过程由两人共同完成。

Figure 1. Experimental design

图1. 实验设计

2.2.3. 革兰染色与计数

造模前一天收集小鼠粪便及麻醉小鼠后收集盲肠内容物液氮急冻后−80℃保存。称取1 mg盲肠内容物或粪便加入5 µL 0.9%无菌生理盐水，稀释5倍。吸取同一体积稀释后的菌液涂于载玻片表面，火焰固定，涂至无流动菌液。计数公式如下：

$B_N=\frac{A\times S_1}{S_2\times v\times G}$

$B_N$ ：每克内容物或粪便中所含的细菌数；$A$ ：视野中细菌的平均数；$S_1$ ：菌液涂的面积；$S_2$ ：显微镜的视野面积；$v$ ：菌液的体积；$G$ ：粪便或内容物的质量。

2.2.4. RNA提取和RT-qPCR

肠组织RNA提取使用TRIzol试剂从组织样本中提取总RNA。互补DNA (cDNA)由RNA通过Perfect Real Time Prime Script RT Master Mix生成。使用TB green Premix Ex Taq 2在CFX Connect实时系统上进行定量RT-qPCR。靶基因的特异性引物由生工生物合成。使用CFX Connect实时系统进行40个循环的扩增：PCR反应过程如下：95℃ 2 min，95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，然后65℃和95℃ 5 s。使用比较Ct(2^−∆∆Ct)方法计算mRNA的相对量将数据标准化为GADPH mRNA水平，靶基因的引物序列如表1所示。

Table 1. Target gene primer sequences

表1. 靶基因引物序列

基因	Forward (5’-3’)	Reverse (5’-3’)
IL-1 β	GAAATGCCACCTTTTGACAGTG	TGGATGCTCTCATCAGGACAG
IL-6	CTGCAAGAGACTTCCATCCAG	AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
TNF-α	CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA	TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC
IL-17	CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC	GGGTCTTCAGCGGTGG
IL-22	TCGCCTTGATCTCTCCACTC	GCTCAGCTCCTGTCACATCA
IL-10	CTGGACAACATACTGCTAACC	GGGCATCACTTCTACCAGGTA
ZO-1	TTCAAAGTCTGCAGAGACAATAGC	TCACATTGCTTAGTCCAGTTCC
CD14	ACATCTTGAACCTCCGCAAC	AGGGTTCCTATCCAGCCTGT
MyD88	TGGTGGTGGTTGTTTCTGAC	GTCCTTCTTCATCGCCTTGT
TLR4	CACAGAAGAGGCAAGGCGACAG	GAATGACCCTGACTGGCACTAACC
GADPH	TGGCCTTCCGTGTTCCTAC	GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA

2.2.5. 酶联免疫吸附试验测定SOD活性、MDA含量

准确称取1 mg回肠组织加入9 µL 0.9%生理盐水中，冰水浴条件下，制备为10%的匀浆液，2500~3000 r/min，离心时间为10 min，取上清液进行测定。根据试剂盒说明书，测定回肠组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)水平的变化。

2.3. 统计学分析

所有数据统计由SPSS23.0完成，图表由GraphPad 8.0、Origin Pro 2021完成，图片处理由Image J完成。实验数据表示为均数 ± 标准误(mean ± SEM)。定量数据通过单因素方差分析(One-way ANOVA)评估组之间的比较，事后检验选择Bonferroni法。定性数据通过秩和检验作比较。相关性分析使用Spearman相关性分析。统计显著性定义为P < 0.05。

3. 实验结果

3.1. GQD预处理对脂多糖诱导的小鼠回肠屏障损伤具有保护作用

GQD预处理对脂多糖诱导的小鼠回肠屏障损伤的保护作用见图2。基于HE染色的组织学检查显示(图2(A)、图2(B))，正常对照组中小鼠回肠肠腺组织完整，绒毛无损伤。LPS处理改变了回肠组织正常形态，即肠组织上皮结构破坏，绒毛变短塌陷，炎性细胞浸润，杯状细胞破坏。与LPS组相比，ABX组、GQD组的图像显示肠组织破坏程度显著改善。其中ABX组几乎无异常，与对照组小鼠绒毛高度、隐窝深度和上皮厚度较接近。(图2(C)、图2(D))显示阿利新蓝染色可见LPS组中图像与对照组相比杯状细胞数量减少。而与LPS组相比，ABX组、GQD组的图像显示在回肠中杯状细胞数量有明显增加。结果表明，ABX、GQD预处理能稳定小鼠回肠组织中杯状细胞的数量，维持肠道屏障，预防LPS引起的损伤。

A：回肠组织HE染色，标尺50 μm；B：回肠组织病理损伤评分；C：AB-PAS染色，标尺50 μm；D：回肠组织杯状细胞计数；E：回肠组织中MDA (丙二醛)含量；F：SOD(超氧化物歧化酶)活性的检测结果；G：回肠组织紧密蛋白ZO-1的表达；*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，ns：P > 0.05。

Figure 2. Protective effect of GQD pretreatment on the intestinal barrier of mouse ileum

图2. GQD预处理对小鼠回肠肠屏障的保护作用

氧化应激与各种炎症性疾病的组织损伤有关，结果如图所示(图2(E)、图2(F))。与正常对照组相比，LPS组中的MDA含量和SOD活性显著增加(MDA P = 0.005; SOD P = 0.02)。与LPS组相比，ABX、GQD逆转了由LPS诱导的MDA含量增加(ABX P = 0.025; GQD P = 0.017)；ABX降低了LPS引起的SOD活性增加(P = 0.01)，但GQD降低SOD活性的作用不显著。此外，肠道黏膜屏障破坏是肠道炎症性疾病的基础。通过PCR检测回肠组织的mRNA表达发现(图2(G))，与正常对照组相比，LPS组小鼠回肠组织中ZO-1表达降低(P = 0.007)。然而，GQD组小鼠回肠中ZO-1水平较LPS组显著增加(P = 0.0018)，ABX组ZO-1表达水平也有升高趋势。以上结果提示，ABX、GQD预处理对脂多糖诱导的小鼠回肠屏障组织损伤都具有明显的保护作用，但中药组与ABX组相比，具有更高的SOD活性和ZO-1表达水平，提示可能中药组有更好的组织修复状态。

3.2. GQD预处理抑制了脂多糖诱导的小鼠回肠炎性相关因子和CD14-TLR4-MyD88信号通路因子的表达

qRT-PCR结果表明(图3(A)~(F))，LPS刺激显著增加了小鼠回肠组织中炎症因子IL-1 β、IL-6、TNF-α、IL-17 A、IL-22和IL-10的表达水平。与LPS组相比，ABX组IL-1 β (P = 0.003)、TNF-α (P = 0.004)、IL-22 (P = 0.005)和IL-6 (P = 0.023)、IL-10 (P = 0.015)的表达水平降低。GQD预处理显著降低了LPS刺激导致的IL-1 β (P = 0.009)和IL-22 (P = 0.021)、TNF-α (P = 0.031)的炎症因子水平，但其对IL-6、IL-10、IL-17 A没有显著性作用。以上结果显示，对LPS刺激的回肠炎性因子释放的抑制，ABX和GQD均具有显著的效果，且ABX效果优于GQD。

图3(G)~(I)的结果显示与LPS组相比，ABX组(CD14 P = 0.045; TLR4 P = 0.012; MyD88 P = 0.006)的mRNA水平显著降低；GQD组仅降低了MyD88的表达(P = 0.001)。结果提示，2种预处理方式减轻LPS刺激诱发的回肠炎症可能都与抑制MyD88的表达有关；而ABX抑制MyD88的表达可能与抑制固有免疫细胞的CD14与TLR4表达有关。

A~F：左至右为IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-22、IL-10 mRNA水平的检测结果；G~I：左至右CD14、TLR4、MyD88 mRNA的检测结果；*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，ns：P > 0.05。

Figure 3. Effects of GQD pretreatment on the expression of inflammatory factors and inflammation-related pathway molecules in mouse ileal tissue

图3. GQD预处理对小鼠回肠组织炎症因子及炎症相关通路分子表达的影响

3.3. GQD预处理对小鼠盲肠和粪便中细菌数量和革兰染色分类的影响及抑制LPS激发的回肠炎症的关联

从2种预处理方式对肠道细菌总数量来看(图4(A))，ABX预处理使盲肠和粪便中细菌数量分别降低至对照的10.25% (P = 0.01)与14.5% (P = 0.004)；GQD预处理使粪便中细菌总数量有了明显降低(P = 0.002)。肠道细菌计数结果显示，正常小鼠盲肠和粪便细菌均主要为革兰阴性菌；ABX的预处理使盲肠和粪便中的革兰染色阳性杆菌、阳性球菌及革兰阴性球菌都几乎消失，其主要构成以革兰染色阴性杆菌为主。与正常对照相比，GQD预处理使盲肠中革兰阳性杆菌显著增加了82.2%和革兰阴性球菌增加了41%，粪便中的革兰阴性杆菌减少了41.8%。

A：不同实验组的小鼠盲肠内容物和粪便革兰染色图像；B：小鼠盲肠内容物细菌总数、革兰阳性杆菌、 革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌、革兰阴性球菌计数结果；C：小鼠粪便细菌总数、革兰阳性杆菌、革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌、革兰阴性球菌计数结果；*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001。

Figure 4. Effect of GQD on bacterial counts and bacterial types in cecum contents and feces

图4. GQD对盲肠内容物及粪便中细菌数量和细菌类型的作用

以上研究结果提示，盲肠菌群与粪便菌群的变化具有一致性，GQD使粪便中的革兰阴性杆菌有显著降低。由于革兰阴性杆菌胞壁是LPS的来源，鉴于其在炎症的诱发中的重要作用，中药处理方式对回肠炎症的发生的保护作用可能与此有关。

研究发现，粪便中细菌总数与SOD呈显著正相关(R = 1, P < 0.05)，与IL-1、IL-6、IL-10、IL-22、TLR4强正相关(R = 0.8)；其中革兰阳性杆菌、革兰阳性球菌与SOD正相关(R = 0.8)，革兰阴性杆菌与CD14、IL-17 A、TNF-α呈显著正相关(R = 1, P < 0.05)，与IL-1、IL-6、IL-10、IL-22、MDA、TLR4也有强正相关性(R = 0.8)，革兰阴性球菌与MDA正相关(R = 0.8) (图5)。

Figure 5. Spearman correlation analysis of intestinal bacteria in feces with LPS induced inflammation indicators in ileal of mice

图5. 粪便中细菌与各病理损伤指标Spearman相关性分析结果

结果显示，GQD除了革兰阴性杆菌的有益作用还有革兰阴性球菌起到保护肠屏障的作用。关联性分析提示，ABX可能通过清除肠道细菌，GQD可能主要通过减少菌的数量和抑制革兰阴性杆菌进而抑制LPS激发的回肠炎症中起作用。

4. 讨论

感染发生时，病理因素波及肠，使肠屏障受到损伤，此时肠道内细菌可以突破肠屏障通过激活肠免疫细胞和发生细菌移位，继而促使肠炎的发生，并可能迅速激活机体的免疫系统，造成细胞因子风暴、脓毒血症等严重全身炎症反应[1] [6]。肠屏障损伤时，肠道菌群通过过度激活肠免疫系统发生细菌移位，成为导致机体炎症加重的重要环节。此研究中，GQD的干预均显著降低了粪便中的革兰阴性杆菌的数量，GQD是否对肠道有协同作用还需进一步研究。有研究提示，在肠屏障损伤病理状态下，肠道菌群状态是影响肠道炎症和系统性炎症水平的重要因素[24]。不仅对感染性疾病，肠屏障损伤病理和机体炎症水平对其他很多疾病，如糖尿病、代谢综合征、心血管疾病等的发生进展也有密切联系[15] [22] [25] [26]。相关性分析发现抗生素干预极大程度清除了肠道细菌，说明肠道细菌的存在与LPS激发的肠屏障受损和肠道炎症发生有密切联系；有研究发现，在一些疾病模型(帕金森、阿尔兹海默症等)或使用无菌动物的模型中，抗生素的作用使疾病的严重程度是明显减轻的[27] [28]，中药机理也可能与此相似。因此，对肠道菌群状态恰当的改变可能对多种疾病的病理状态产生有益的作用。

越来越多现代研究把GQD治疗机制与对肠道菌群的调节作用联系起来，如对2型糖尿病、溃疡性结肠炎、结直肠癌、流感导致的肺炎、对肿瘤PD-1治疗的增效作用等[10] [19] [22] [29]-[31]。本研究也提示了，GQD对促炎因素LPS诱发的肠屏障损伤和肠炎发生有良好的抑制作用。因此，这些看似极不同的疾病，可能有因肠屏障受到损伤而促进系统性炎症发生的共同的病理机制，而GQD则可能通过改变肠道细菌型别抑制了系统性炎症发生，从而对不同疾病发挥了治疗作用。有研究发现GQD主要通过黄连素产生的抑菌作用，抑制了肠道的有害促炎菌[32] [33]；与抗生素不同，GQD促进了抗炎有益菌富集[34]和肠屏障损伤的修复[35]；这些菌可以粘附在肠上皮细胞上，并在体外增强肠上皮单层细胞的完整性，增强受损肠道的屏障功能[36]。GQD使粪便细菌总数量有一定抑制作用，对正常菌群物种多样性有一定程度的减少，肠道菌群结构也有一定变化；当慢性病如2型糖尿病、代谢综合征等，可能长期用药，GQD的长期用药可能导致菌群结构的长期改变，这种长期改变会产生什么样的肠微生态和免疫等方面的干扰后果，还需要研究。

本研究LPS小鼠腹腔注射可激发强烈的肠屏障损伤和肠炎症的发生，GQD预灌胃可明显抑制这种肠屏障损伤和肠炎症的发生；这种抑制作用可能与预灌胃处理导致的肠道细菌结构变化相关联。GQD对肠道细菌结构的干扰作用较抗生素小。方剂处理可能清除了一些致病物种，同时富集了一些可能有益的物种，可能形成对一定肠病理起治疗作用的菌群结构类型。但是正常的肠道菌群是经过长期进化与机体最相适应的，在营养、消化、免疫等多方面维护机体的正常生理功能。这些药物干预显著改变了肠道菌群结构，在疾病康复过程中，后续会产生什么样的生理病理效应，其恢复到正常菌群的难易程度，方剂是否可长期使用，是需要考虑的因素，后续需进一步研究。

基金项目

重庆市科卫联合中医药技术创新与应用发展项目(NO. 2020ZY023699)，项目负责人：重庆市中医骨科医院唐勇；重庆医科大学大学生科学研究与创新实验资助项目(NO. 202210)。

NOTES

^*通讯作者。