摘要: 目的：探讨雷公藤红素对肥大细胞IgE及IL-1
β、IL-10的抑制作用，旨在为雷公藤红素抑制肥大细胞的作用提供实验室依据。方法：选用18只雄性SD大鼠，并将其分为对照组、模型组以及给药组。模型组通过MCDP刺激诱导肥大细胞脱颗粒；给药组在MCDP刺激后加入雷公藤红素进行处理。通过ELISA法对各组样本的血清IgE进行检测；采用Q-PCR对各组样本的IL-1
β、IL-10的mRNA表达水平进行分析。结果：ELISA结果显示，相比对照组，模型组的血清IgE含量有明显上升，而药物组的血清IgE含量明显低于模型组。Q-PCR结果显示，模型组的IL-1
β、IL-10的基因表达量分别为(3.83 ± 0.92)、(3.98 ± 0.46)，与对照组的基因表达量相比均明显增加；而药物组的基因表达量则显著低于模型组(P < 0.05)。结论：雷公藤红素能够抑制肥大细胞释放IgE并且抑制IL-1
β和IL-10的mRNA表达，提示其具有抑制肥大细胞的作用。
Abstract: Objective: To investigate the inhibitory effect of tripterine on mast cells IgE, IL-1β and IL-10, and to provide laboratory evidence for the inhibitory effect of tripterine on mast cells. Methods: 18 male SD rats were selected and divided into control group, model group and drug administration group. In the model group, mast cell degranulation was induced by MCDP stimulation. The treatment group was treated with tripterine after MCDP stimulation. Serum IgE was detected by ELISA. The mRNA expression levels of IL-1β and IL-10 were analyzed by Q-PCR. Results: ELISA results showed that compared with the control group, the serum IgE content in the model group was significantly increased, while the serum IgE content in the drug group was significantly lower than that in the model group. Q-PCR results showed that the gene expression levels of IL-1β and IL-10 in the model group were (3.83 ± 0.92) and (3.98 ± 0.46), respectively, which were significantly increased compared with the control group. The gene expression in drug group was significantly lower than that in model group (P < 0.05). Conclusion: Tripterine can inhibit the release of IgE from mast cells and the expression of IL-1β and IL-10 mRNA, suggesting that tripterine can inhibit mast cells.
1. 引言
过敏反应又称变态反应，其发病率逐年增加[1] [2]。过敏反应的常见症状有打喷嚏、瘙痒、鼻塞、流鼻涕等。过敏反应的发生与IgE-肥大细胞介导的超敏反应，可分为两个阶段，肥大细胞在其中起关键作用。肥大细胞被IgE激活，然后重新释放炎症因子，如组胺、蛋白酶、IL-1β、IL-6、TNF-α、胸腺基质淋巴细胞生长因子和花生四烯酸。肥大细胞释放的趋化因子可以促进B细胞产生IgE，从而促进Th2淋巴细胞的产生，释放趋化因子和粘附分子[3]。分泌的趋化因子MIP-2和粘附分子ICAM-1介导嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞和Th2淋巴细胞浸润炎症部位，并在第二阶段与新产生的介质一起继续激活肥大细胞[4]。在过往研究中，已经发现许多自然界或者人工合成的化合物中都能够诱导肥大细胞的活化，类似于P物质，蜂毒等[5]。其中，肥大细胞脱颗粒肽(Mast cell degranulating peptide, MCDP)在诱导肥大细胞脱颗粒的作用十分显著，已经被应用于构造肥大细胞脱颗粒模型中。由于过敏性疾病已成为一个重大的健康问题，因此迫切需要找到一种新的、安全的过敏性疾病治疗方法。人们普遍认为中药安全有效，中药治疗对许多疾病的吸引力越来越大。
雷公藤(Triptergium wilfordi Hook)作为我国的道地药材，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌以及调整机体免疫等多种药理作用。雷公藤红素(Tripterine)作为雷公藤主要的有效成分之一，是具有多种生物活性的天然产物。Tripterine具有很强的抗氧化、抗癌血管生成和抗类风湿作用[6] [7]，可用于类风湿疾病的雷公藤片剂和雷公藤多糖苷片剂。Tripterine可能通过在体外影响内皮细胞中ICAM-1的排泄来抑制血管生成。Tripterine对狼疮性肾炎肾小球硬化有明显的保护作用；它可能通过增加MMP-2的表达和抑制小鼠肾组织中TGF-β1和TIMP-2的表达来减少I型和IV型胶原在肾脏中的沉积。除此之外，Tripterine还具有抑制皮肤炎症的作用[8] [9]。由此可Tripterine在抗炎方面具有较好疗效，但在抗过敏方面，少有相关报道，因此，本研究旨在探讨Tripterine对过敏炎症反应的抑制作用。从而为Tripterine在临床中的抗炎及抗过敏性疾病提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
选用雄性SD大鼠的体重在220~300 ｇ之间，在上海斯莱克实验动物有限责任公司进行购买。自然光线饲养于实验动物房中，保持室温为22~26℃、湿度为40%~60%。买回后先饲养五天以适应环境，保持足量的水和食物供其自主饮食。本实验整个过程中严格遵守《实验动物管理条例》。
2.2. 实验方法
2.2.1. 分组与建模
大鼠自由饮食的第六天，按照体重随机分为对照组、模型组和给药组，每组均6只。
2.2.2. 处理
大鼠腹腔肥大细胞的获取利用乙醚给大鼠施行麻醉，腹腔注射给予10 mL Hermes-Tyrode缓冲液(137.0 mmol/L氯化钠，5.6 mmol/Ｌ葡萄糖，12.0 mmol/L碳酸氢钠，2.7 mmol/L氯化钾，0.3 mmol/Ｌ磷酸二氢钠，1.0 g/Ｌ明胶)，轻微按摩腹部90 s后收集腹腔灌洗液。采用Hachisuka方法将收集好的肥大细胞进行纯化，并以1 × 106个/mL计数后接种于Hermes-Tyrode重悬缓冲液中。
2.3. 总IgE水平的测定
采用IgE ELISA试剂盒检测样品总IgE浓度，依据使用说明进行测定。
2.4. Q-PCR检测
按Takara公司说明书提取各组细胞总RNA，并进行纯度验证。引物购于上海生工公司，按照反转录试剂盒说明书反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应。反应体系为20 μL：5xPrimeScript Buffer (for Real Time) 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix l 1 μL，Oligo dT Primer (50 M)1 μL，Random 6 mers (100 M) 1 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free dH20 12 μL。反应条件为：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃。IL-1β、TNF-α、IL-10引物由福州尚亚生物技术有限公司合成，以GAPDH作为内参基因，根据2-ΔΔCt法计算IL-1β mRNA、IL-10 mRNA的相对表达水平。
2.5. 统计学分析
实验结果均通过均数 ± 标准差(Mean ± SD)来表示。符合正态分布的数据在比较两组独立样本之间的统计学差异用t检验。采用GraphPad Prism 8.02进行分析，以P < 0.05表示差异具有统计学意义。
3. 结果
Table 1. Comparison of serum IgE levels in each group
表1. 各组血清IgE含量比较
| 实验分组 |
样本数量 |
总IgE含量 |
| 对照组 |
6 |
35.5 ± 4.28 |
| 模型组 |
6 |
96.6 ± 5.56* |
| 药物组 |
6 |
42.8 ± 4.83# |
注：*表示模型组与对照组比较，差异具有统计学意义(P < 0.05)，#表示药物组与模型组比较，差异具有统计学意义(P < 0.05)。
Figure 1. Comparison of serum IgE levels in mast cells of each group
图1. 各组肥大细胞血清IgE含量比较
实验结果表明(表1，图1)，对照组血清IgE含量为(35.5 ± 4.28)相比，而模型组中血清IgE含量为(96.6 ± 5.56) ng/mL，明显高于对照组，相比模型组，药物组含量为(42.8 ± 4.83) ng/mL，差异具有统计学意义(P < 0.05)。
Table 2. Comparison of mRNA gene expression levels of IL-1β and IL-10 in mast cells of each group
表2. 各组肥大细胞IL-1β、IL-10的mRNA基因表达水平比较
| 组别 |
IL-1β mRNA |
IL-10 mRNA |
| 对照组 |
1.98 ± 0.35 |
1.58 ± 0.83 |
| 模型组 |
3.83 ± 0.92* |
3.98 ± 0.46* |
| 药物组 |
2.47 ± 0.59# |
2.05 ± 0.66# |
注：*表示模型组与对照组比较，差异具有统计学意义(P < 0.05)，#表示药物组与模型组比较，差异具有统计学意义(P < 0.05)。
Figure 2. Comparison of IL-1β and IL-10 mRNA gene expression levels in mast cells of each group
图2. 各组肥大细胞IL-1β、IL-10的mRNA基因表达水平比较
将各组的IL-1β、IL-10的mRNA基因表达水平分别进行比较。结果表明(表2，图2)，对照组的基因表达量为(1.98 ± 0.35)、(1.58 ± 0.83)，而模型组中肥大细胞的mRNA基因表达水平为(3.83 ± 0.92)、(3.98 ± 0.46)，模型组的基因表达水平相比对照组均有明显升高(P < 0.05)。药物组的IL-1β、IL-10的mRNA基因表达水平为(2.47 ± 0.59)、(2.05 ± 0.66)，相比模型组均有明显下降，差异具有统计学意义(P < 0.05)。
4. 讨论
为了研究Tripterine对MCDP诱导的肥大细胞炎症反应的影响，课题组在SD大鼠中建立了模型。将18只大鼠随机分为3组(n = 6)，分别是对照组、模型组和药物组。首先，使用ELISA检测技术，对各组的样本进行检测，观察各组样本血清中总IgE的含量变化。结果显示，与对照组相比较，模型组样本中的IgE含量明显提高，而药物组与模型组相比，药物组中IgE的含量显著降低，差异具有统计学意义(P < 0.05)。实验结果表明，Tripterine能够降低大鼠的血清IgE含量。随后，本课题组进行了Q-PCR实验进行进一步的验证，结果显示，与对照组相比较，模型组样本中的IL-1β、IL-10 mRNA表达量明显上升，而药物组与模型组相比，药物组中IL-1β、IL-10 mRNA表达量明显降低，差异具有统计学意义(P < 0.05)。结果表明，Tripterine能够降低大鼠IL-1β、IL-10的mRNA表达量，进而起到抑制炎症的作用。
在过敏性反应中，肥大细胞扮演着重要的作用。有相关文献报道，肥大细胞能够被MCDP诱导活化，并释放许多炎性介质，这些介质在过敏反应中起关键作用。Tripterine具有调节自身免疫、抗炎、抑制肿瘤细胞增殖等多种药理学作用。通过对这些炎症介质的变化进行监测，揭示了Tripterine具体的抗炎功效。其可能的作用机制与抑制活性氧/NLR家族含吡啶结构域3/核转录因子-κB (ROS-NF-κB-NLRP3)，活性氧(ROS)是一种由有氧细胞代谢生成的活性氧簇，当细胞内ROS含量较高时，会对细胞造成严重损害。ROS可通过激活下游的一系列信号通路，诱导细胞凋亡[10]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3 (PI3K/Akt/GSK-3)等信号通路有关。PI3K/Akt信号通路的激活与炎症进展密切相关。PI3K通过诱导细胞膜产生磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，进而激活下游蛋白激酶B (Akt)磷酸化，继而诱发炎症反应[11]。
肥大细胞在过敏反应分泌组胺，蛋白酶，细胞因子和生长因子。在炎症反应中，脱颗粒肥大细胞分泌的肥大细胞特异性蛋白酶诱导上皮细胞分泌IL 8、ICAM-1和IL-1β。此外，IL-1β、IL-6、TSLP和TNF-α等促炎因子在过敏原刺激后短时间内即可分泌[12]。用化合物48/80，MCDP或IgE刺激肥大细胞会触发信号通路的激活，从而导致脱颗粒。化合物48/80可以通过扰乱脂质膜的稳定性来增加脂质双层的通透性，这表明肥大细胞膜通透性的增加是释放各种介质的关键因素。有研究发现，Tripterine可以显著抑制MCDP诱导的组胺释放和全身过敏，并且预测Tripterine可以作用于脂质双层，抑制MCDP诱导的过敏反应，并通过稳定膜流动性来调节肥大细胞的脱颗粒。肥大细胞上的多变量抗原可以结合IgE和FcεRIs，诱导活性介质的释放。活化的肥大细胞释放炎症介质，如组胺、血清素、白三烯和各种细胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α。研究表明，肥大细胞在自身免疫性疾病和炎症环境中发挥作用。Tripterine可以缓解自身免疫性疾病小鼠的临床症状，降低了小鼠的IL-1β、IL-6、TSLP和TNF-α水平。因此，Tripterine可以预防和治疗炎症性疾病引起的自身免疫性疾病。
中医有许多有益的方面。在过去的几十年里，许多研究人员试图用中药研究过敏性疾病的治疗。然而，用中药预防和治疗过敏性疾病的方法很少，本研究结果表明，Tripterine具有理想的抗过敏反应的效果。但实验的作用剂量与在人体内的剂量之间存在一定的相关性。我们计划根据体重在灵长类动物水平上探索安全剂量，并在未来逐步评估该药物对人类的疗效。Tripterine的水溶性差，且生物利用率低，这些方面的缺陷阻碍了Tripterine在临床层面的应用。近年来随着对于纳米载药系统研究的深入，发现纳米载药系统可显著增加药物的溶解性，并且提高药物的生物利用率[13]-[15]。有研究表明，细胞穿透肽修饰的纳米颗粒能够将Tripterine的相对口服生物利用度提高到488.75%。然而，非肽修饰的纳米颗粒为149.91%。纳米颗粒对十二指肠、空肠、回肠和结肠的Tripterine的有效渗透率可以显著提高2.1倍、2.7倍、1.1倍和1.2倍。由于相变温度高，“软”脂质(如磷脂和液体油)在渗透性增强方面优于“硬”脂质(如单茶酸甘油酯或混合硬脂酸甘油酯)。后者通常用于制备固体脂质纳米颗粒。在纳米载体的情况下，通常在口服给药后遵循载体介导的转运(流入)到上皮细胞。Tripterine与脂质材料的精细混溶性和紧密组装的结构使其具有良好的肠前细胞稳定性。生物相容性脂质成分有效增加了跨膜内流以及非特异性小窝介导的内吞作用。肠细胞后淋巴转运进一步提高了口腔生物利用度。
本研究主要通过ELISA试剂盒对样本总IgE进行检测，但是在肥大细胞脱颗粒的过程中还有些物质将会被释放，如：组胺，P物质等，故在后续的实验中同样会建立模型对组胺等物质进行检测，以更加深入的探讨Tripterine对于肥大细胞的作用评价，并且通过免疫蛋白印迹实验(Westernblot, WB)的方法对Tripterine作用肥大细胞的机制进行探讨。由于Tripterine的水溶性等问题，为增加其药物效果，在未来的实验中希望能够通过合成Tripterine纳米复合物进行进一步的验证，同时也为临床应用奠定基础。
基金项目
福建省中青年教师教育科研项目(编号：JAT210201)。
NOTES
*通讯作者。