1. 引言
急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke, AIS)又名脑梗死，指的是因急性发作的脑部血液循环障碍，导致局部脑组织缺血性软化或坏死，使得相应脑组织神经功能障碍[1]。据调查，AIS约占所有脑卒中患者的69.6%~70.8%，以肢体运动和语言功能障碍为主要临床表现，全球疾病负担研究(GBD)数据显示，我国AIS发病率由2010年的129/10万上升至2019年的145/10万，其患病率由2010年的1100/10万上升至2019年的1256/10万，严重威胁着国民的健康[2]。
中医学认为，AIS属中风的范畴，病位为脑，与肝、脾、肾密切相关[3]。从《太平惠民和剂局方》将只此两味药组成治疗产后中风的“芎归汤”，到如今临床上用于治疗AIS的舒脑欣滴丸，川芎、当归药一直是治疗中风的高频用药，且是核心药对[4]。川芎味辛，性温，归肝、胆、心包经，具有活血行气、祛风止痛的功效，能“上行头目”，“主治中风入脑，头痛”，现代研究其在抗氧化、神经保护、调节血管稳态、抗炎等药理作用上效果显著[5]；当归味甘、辛、苦，性温，归肝、心、脾经，具有补血活血的功效，可使气血各有所归，为内科补血之佳品，现已证实其可以调节血液循环、缺血后损伤保护、保护脑和神经[6]。两药配伍，具有互补作用，发挥生血、活血、行气的协同作用，当归可以制约川芎燥性；而川芎又能防止当归的滋腻[7]。但其对治疗AIS的机制需要更进一步的探索，故本研究利用网络药理学探索川芎–当归药对与AIS的相关性，预测作用靶点，分析其作用机制，并利用分子对接技术验证主要活性成分与核心靶点间的结合性，以期为川芎–当归药对治疗AIS提供理论依据，并为后续治疗AIS中成药的研究与开发拓宽思路。
2. 资料与方法
2.1. 川芎、当归活性成分及作用靶点筛选
通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP) (https://tcmsp-e.com/index.php)检索“川芎、当归”的主要活性成分，并以口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%和类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18为条件筛选出其对应的作用靶点，将所得的作用靶点信息在UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)中的“Homo sapiens”靶点数据相匹配，利用UniportKB功能，进一步将所有蛋白名称进行标准化，并进行校正、去重。
2.2. AIS疾病靶点的获取
以“Acute Ischemic Stroke”为检索词，在Genecards (https://www.genecards.org/)、DrugBank (https://go.drugbank.com/)、OMIM (https://www.omim.org)、DisGeNET (https://www.disgenet.org/)疾病数据库中，将获得的AIS疾病靶点并删除重复项。
2.3. 获取川芎–当归作用靶点与AIS疾病靶点的交集
将得到的药物作用靶点与AIS疾病靶点利用Venn工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集。
2.4. “活性成分–疾病靶点”网络构建
将当归–川芎活性成分及AIS疾病靶点录入Cytoscape3.9.1软件，生成“活性成分–疾病靶点”网络图，再通过Network Analyzer方式，以Degree值筛选出当归–川芎药对作用于AIS疾病靶点的核心有效成分。
2.5. 蛋白质相互作用(PPI)网络构建
通过STRING数据库(https://cn.string-db.org/)中“Homo sapiens”设置信度 > 0.4，隐藏网络中的孤立节点，获得共同靶点的PPI网络，然后采用Cytoscape3.9.1软件进行网络拓扑分析，根据度值(即连接节点的数量)筛选出核心靶点。
2.6. GO功能与KEGG通路富集分析
将川芎–当归药对与AIS疾病的共同靶点导入DAVID数据库(hps:/davidncifcrtov/)，以Select Identifier进行生物学过程(BP)，Genelist与Background以“Homo sapiens”进行细胞组分(CC)、分子功能(MF)，及KEGG通路富集分析，在微生信网站(http://www.bioinformatics.comcn/)得出相应的富集分析气泡图。
2.7. 分子对接技术验证
基于“2.5”项下所述PPI网络筛选出平均度值排名前5位的核心靶点，从RCSB PDB数据库(http://wwwl.rcsb.org/)下载相应的蛋白分子结构PDB格式文件。在TCMSP中下载当归–川芎药对核心有效成分分子结构的mol2格式文件。利用PyMol软件将核心靶点的蛋白分子去水，采用AutoDockTools-1.5.7软件将处理过的核心靶点的蛋白分子和当归–川芎药对核心有效成分分子加全氢，并保存为pdbqt格式文件。使用AutoDockTools-1.5.7软件将处理好的配体与受体进行分子对接，通过分子对接结果分析当归–川芎药对活性成分与核心靶点之间的结合活性，由对接结果的结合能评估受体和配体的对接情况。最后用PyMol软件将结合性最好的对接结果进行分析，并输出对接图，从数值中评价受体和配体的对接情况。
3. 结果
3.1. 川芎–当归活性成分含量测定
通过TCMSP数据库，以OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18为筛选条件，筛选出川芎7个活性成分，当归2个活性成分，具体详见表1。并检索得到9个活性成分对应靶点111个：β-谷甾醇对应靶点38个，豆甾醇对应靶点30个，谷甾醇对应靶点3个，富马酸对应靶点3个，十八碳二烯对应靶点3个，杨梅酮对应靶点25个，黑麦碱对应靶点4个，川芎萘呋内酯对应靶点4个，洋川芎醌没有对应靶点。经过去重和删除无效靶点，共获取川芎–当归药对的作用靶点69个。
Table 1. Chuanxiong angelica active ingredient
表1. 川芎–当归活性成分
| 中药 |
分子编号 |
分子名称 |
口服利用度 |
类药性 |
| 英文名称 |
中文名称 |
(OB) |
(DL) |
| 川芎 |
MOL001494 |
Mandenol |
十八碳二烯 |
42.00% |
0.19 |
|
MOL002135 |
Myricanone |
杨梅酮 |
40.60% |
0.51 |
|
MOL002140 |
Perlolyrine |
黑麦碱 |
65.95% |
0.27 |
|
MOL002151 |
Senkyunone |
洋川芎醌 |
47.66% |
0.24 |
|
MOL002157 |
Wallichilide |
川芎萘呋内酯 |
42.31% |
0.71 |
|
MOL000359 |
Sitosterol |
谷甾醇 |
36.91% |
0.75 |
|
MOL000433 |
FA |
富马酸 |
68.96% |
0.71 |
| 当归 |
MOL000358 |
Beta-sitosterol |
β-谷甾醇 |
36.91% |
0.75 |
|
MOL000449 |
Stigmasterol |
豆甾醇 |
43.83% |
0.76 |
3.2. AIS相关靶点检索
通过Gene Cards数据库检索，得到AIS疾病相关靶点3371个。
3.3. 川芎–当归与AIS的共同靶点
将3371个AIS疾病靶点与69个当归–川芎药对作用靶点取交集，共得到53个共同靶点，见图1。
Figure 1. Chuanxiong and Angelica sinensis for the treatment of AIS target
图1. 川芎–当归治疗AIS靶点韦恩图
3.4. “活性成分–疾病靶点”网络构建
将川芎–当归作用靶点与AIS疾病的共同靶点录入Cytoscape3.9.1软件，生产出“活性成分–疾病靶点”网络图，具体信息详见图2。图2中，圆形部分为共同靶点，三角形部分为川芎–当归药对作用于AIS的活性成分。用连线表达其关联性，使用Network Analyzer方式得到有效成分的Degree值，数值越高的有效成分相关联靶点越多越重要。结果显示，有3个有效成分的Degree值大于10，其中杨梅酮(Myricanone)对应22个靶点，β-谷甾醇(Beta-sitosterol)对应20个靶点，豆甾醇(Stigmasterol)对应10个靶点，谷甾醇(Sitosterol)、川芎萘呋内酯(Wallichilide)和黑麦碱(Perlolyrine)各对应2个靶点。因此认为杨梅酮、β-谷甾醇和豆甾醇为川芎–当归药对治疗AIS疾病的关键活性成分。
Figure 2. Chuanxiong and Angelica sinensis active ingredient disease target network
图2. 川芎、当归“活性成分–疾病靶点”网络
3.5. PPI网络图及核心靶点分析
将53个共同靶点录入STRING数据库，通过Cytoscape3.9.1软件，产生232条相互作用关系，平均度值(Degree)为8.75。建立PPI网络(图3)。再用“cytoHubba”获取前5的核心靶为JUN、ESR1、CASP3、PTGS2、NR3C1。以Degree值由大至小排序，生成可视化网络图(图4)。
Figure 3. PPI network of potential targets for treating ais with Chuanxiong and Angelica sinensis
图3. 川芎–当归治疗AIS潜在靶点的PPI网络
Figure 4. The core target of Chuanxiong and Angelica sinensis for the treatment of AIS
图4. 川芎–当归治疗AIS的核心靶点
3.6. GO功能富集分析
将53个共同靶点录进DAVID数据库，富集分析GO功能，并采用P值排序，选择前10条目GO功能，制作富集气泡图。结果显示：细胞组分(CC)主要位于膜筏、膜微域、突触前膜等；分子功能(MF)主要表达在发挥蛋白质结合、蛋白激酶结合、转录因子结合、类固醇结合、蛋白酶结合和细胞因子受体结合等分子功能；生物学过程(BP)主要涉及有机环状化合物的反应、对激素的反应、对刺激的反应、细胞凋亡和血液循环系统过程等生物学过程，从而起到治疗AIS的作用，见图5。
3.7. KEGG通路富集分析
将53个共同靶点录入Metascape数据库进行KEGG通路富集分析得到72条通路，选取P值由大至小排序居前20位的通路，涉及癌症的信号通路、钙信号通路、PI3K-AKT信号通路等通路，见图6。将其导入Cytoscape3.9.1软件，生成“活性成分–疾病靶点–信号通路”网络图(图7)。图7中，三角形节点代表药物活性成分，圆形节点代表信号通路，长方形节点代表作用靶点。
(a)
(b)
(c)
Figure 5. GO functional enrichment analysis bubble diagram. (a) GO-CC; (b) GO-MF; (c) GO-BP
图5. GO功能富集分析气泡图。(a) GO-细胞组分；(b) GO-分子功能；(c) GO-生物学过程
Figure 6. Bubble diagram of KEGG pathway
图6. KEGG通路富集气泡图
Figure 7. “Components-targets-pathways” network of Chuanxiong-angelica
图7. 川芎–当归“成分–靶点–通路”网络
3.8. 分子对接技术验证
根据“2.4”，通过“活性成分–疾病靶点”网络可知杨梅酮(Myricanone)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)和豆甾醇(Stigmasterol)为川芎–当归药对治疗AIS疾病的核心活性成分，具体信息见表2。由“2.5”的PPI网络图，可知川芎–当归药对治疗AIS疾病的核心靶点有JUN、ESR1、CASP3、PTGS2等。使用AutoDock软件，将川芎–当归药对核心活性成分与各自的核心靶点进行分子对接，并根据其结合能来评价对接效果。通常，如果结合能<−17.79 kJ/mol，则表明该配体对受体具有一定的结合活性，如果<−20.93 kJ/mol，则表明该配体对受体具有较好的结合活性，如果<−29.30 kJ/mol，则表明该配体对受体具有较强的结合活性(引用)。从表3可以看出，β-谷甾醇(beta-sitosterol)与CASP3的结合性最好，杨梅酮(Myricanone)与ESR1的结合性也较强，借助PyMol软件来显示结合能(≤−20.93 kJ/mol)的对接结果，如图8所示。
Table 2. Comparison table of core components
表2. 核心成分对照表
| 成分名称 |
MOL ID |
成分来源 |
| Beta-sitosterol |
MOL000358 |
当归 |
| Stigmasterol |
MOL000449 |
当归 |
| Myricanone |
MOL002135 |
川芎 |
| Stigmasterol |
MOL000359 |
川芎 |
Table 3. Docking results of core components and target molecules
表3. 核心成分与重要靶点分子对接结果表
| 成分 |
靶蛋白 |
PDB ID |
结合能/(KJ/mol) |
| 杨梅酮(Myricanone) |
ESR1 |
1SJ0 |
−32.46784 |
|
PTGS2 |
5IKR |
−24.09984 |
| β-谷甾醇(beta-sitosterol) |
CASP3 |
1QX3 |
−35.02008 |
|
JUN |
6Y3V |
−25.98264 |
| 豆甾醇(stigmasterol) |
JUN |
6Y3V |
−29.79008 |
|
PTGS2 |
5IKR |
−27.90728 |
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Figure 8. Schematic diagram of molecular docking. (a): Myricanone-ESR1; (b): Myricanone-PTGS2; (c): Beta-sitosterol-CASP3; (d): Beta-sitosterol-JUN; (e): Stigmasterol-JUN; (f): Stigmasterol-PTGS2
图8. 分子对接示意图。(a)：杨梅酮- ESR1；(b)：杨梅酮-PTGS2；(c)：β-谷甾醇-CASP3；(d)：β-谷甾醇-JUN；(e)：豆甾醇-JUN；(f)：豆甾醇-PTGS2
4. 小结
AIS容易致残甚至致死，且会反复发作，现代医学认为其机制较为复杂，主要涉及兴奋性氨基酸、钙离子、自由基失调，引发炎性反应，使得神经细胞凋亡及自噬等生理病理过程[8]。
本研究发现当归、川芎药对治疗AIS的关键活性成分是杨梅酮、β-谷甾醇、豆甾醇。β-谷甾醇可以通过作用于细胞的相关信号通路来调节生长与凋亡、抗氧化性[9]。β-谷甾醇能减少TNF、IL-1β和IL-6的释放，从而抑制炎症反应[10]。杨梅酮具有抗氧化和保护神经的作用，从而改善AIS患者的症状[11]。豆甾醇具有免疫调节作用，提升AIS患者抗炎因子IL-10水平，抑制炎性因子IL-1β和TNF-α的分泌，能减轻大脑缺血再灌注后的炎症反应对神经的损害，从而改善预后[12]。
根据“活性成分–疾病靶点”的网络构建与分析，核心靶点是JUN、ESR1、CASP3、PTGS2。这些靶点主要涉及免疫炎症反应、细胞自噬凋亡等生物学过程。JUN可以调节免疫反应和细胞凋亡相关靶点表达，可能参与大脑炎症反应的调控[13]。ESR1可以参与细胞炎性因子表达和调节免疫反应[14]。CASP3是细胞凋亡中起关键作用的酶，可以调控AIS脑组织的细胞凋亡[15]。PTGS2为前列腺素的类过氧化物酶，能催化花生四烯酸转化，是重要的炎性介质，可以参与脑损伤后的炎性反应，其过量表达可以破坏大脑稳态，并促使脑梗死面积的扩大[16]。
在KEGG通路富集解析中，靶点主要表达的信号通路为钙信号通路、PI3K-AKT信号通路。PI3K/AKT信号通路是一种细胞内信号转录途径，接收细胞外信号因子，通过下游丝氨酸及苏氨酸的磷酸化，发挥调控细胞凋亡和细胞自噬，促进血管生成的作用[17]。其在AIS中扮演着重要的角色[18]，PI3K磷酸化激活AKT形成p-AKT，调节下游mTOR蛋白表达，同时p-AKT还能够促进一氧化氮的合成，抑制凋亡因子半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9等的表达，进而降低转录因子核因子-κB的活性，减少炎症反应的发生，从而抑制细胞凋亡[19]。同时PI3K/AKT信号通路也是调控细胞自噬的经典信号通路。细胞自噬是细胞自我保护的代谢途径之一，在AIS早期，PI3K/AKT/mTOR的激活能够调控细胞自噬及合成蛋白质，具有维持细胞稳态的作用，能够促进细胞存活和血管新生，但过度自噬也会造成细胞死亡[20]。程永杰等[21]发现当归可以激活PI3K/AKT通路，促进血管生成，抑制炎症反应，减少脑缺血再灌注引起的脑梗死体积及改善血–脑屏障通透性。杜旌畅等[22]发现川芎可以激活PI3K-Akt信号通路，上调PI3K p85与p-Akt的表达，减轻大脑缺血半暗带的水肿。可知，当归、川芎可以通过激活PI3K-AKT信号通路，抑制AIS后脑组织细胞凋亡与细胞自噬，减少脑水肿及脑梗死体积，促进血管新生，改善血–脑屏障通透性。
综上所述，本研究基于网络药理学和分子对接方法，分析当归、川芎药对的活性成分、关键靶点和分子通路机制，发现当归、川芎药对中多种有效成分协助作用于多靶点、多通路，通过减少炎性因子表达，抑制细胞凋亡等方式改善AIS的临床表现，为治疗AIS提供了一定思路，为其临床应用提供更多的可行性。
NOTES
*通讯作者。