异氰酸酯与偶氮烯烃的[4 + 1]环加成反应：高效合成吡唑-5-甘氨酸衍生物

[4 + 1] Cycloaddition of Isocyanoacetates with in Situ Formed Azoalkenes: Efficient Synthesis of Pyrazole-5-Glycine Derivatives

摘要: 本研究成功开发了异氰酸酯与原位生成的偶氮烯烃在碱促进下的[4 + 1]环加成反应。在温和的反应条件下，该反应提供了高效实用的获得吡唑-5-甘氨酸衍生物的途径，反应具有良好到极好的产率。异氰酸酯在反应中作为C1合子，其氰基碳参与了环加成过程。MTT试验表明，该反应产物具有抑制HeLa癌细胞增殖的活性。

Abstract: A base-promoted [4 + 1] annulation reaction of isocyanoacetates with in situ generated azoalkenes was successfully developed. The reaction provided efficient and practical access to pyrazole-5-glycine derivatives with good to excellent yields under mild reaction conditions. Isocyanoacetates served as C1 synthon and its cyano carbon participated in the annulation in this protocol. The MTT assay shows that the product exhibits the activity of an inhibitory effect on proliferation on HeLa cancer cell line.

1. 引言

5-氨基取代的吡唑是一类重要的生物活性分子骨架，广泛存在于农用化学品和药物中[1]，如氟虫腈[2]、结核分枝杆菌CYP121抑制剂[3]、COX-2抑制剂[4]、PA21A1025 [5]和多拉帕莫德[6] (图1)。鉴于此类分子骨架的重要性和日益增长的需求，近年来越来越多的科学家致力于探索新的合成方法来得到结构多样性的吡唑分子[7]。目前，多取代吡唑的主要合成方法包括肼与1,3-二羰基化合物之间的缩合反应[8]，以及重氮化合物与烯烃或炔烃之间的1,3-偶极环加成反应[9]-[11]。然而，这些经典合成方法普遍存在区域选择性差、底物具有潜在危险性和实际操作不便等问题，在一定程度上限制了这些方法的实际应用。

Figure 1. Representative 5-amino pyrazole-based agrochemicals and pharmaceuticals

图1. 具有代表性的5-氨基吡唑类农用化学品和药品

事实证明，异氰酸酯与碳–碳和碳–杂原子键之间的环加成反应是快速构筑具有生物活性杂环化合物的有效策略。它们已被成功用作三原子合成砌块，参与到与各类2π偶极子(如羰基、亚胺、偶氮二甲酸酯、腈和活化烯/炔)的[3 + 2]环加成反应中[12]-[14] (图2(a))。此外，异氰酸酯还可与具有1,3-偶极结构的氮甲基亚胺、呋喃、烯–炔酮和氮丙啶等三原子合成子发生[3 + 3]环加成反应[11] (图2(b))。另一方面，α-卤代酰腙通常经[4 + 1]环化反应来合成二氢吡唑类化合物。在本研究中，我们通过异氰酸酯与α-卤代酰腙在碱促进下的[4 + 1]环加成/芳构化反应，来合成得到吡唑-5-甘氨酸类化合物，从而进一步推动了异氰酸酯化学的发展。

我们首先选取N-苯甲酰基-α-氯代腙1a和异氰基乙酸甲酯2a作为模板底物，以碳酸钾作为布朗斯特碱，二氯甲烷作为溶剂，在室温下进行反应。反应经过24小时，能够以63%的收率分离得到相应的环加成产物3a (表1，条目1)。接着，除了碳酸钾之外，我们对其他不同的无机碱和有机碱依次进行了反应性能的评估。当使用碳酸银时，没有观察到相应的环加成产物(表1，条目2)。然后，我们尝试了无机碱

Figure 2. Annulation reactions of isocyanoacetates

图2. 异氰基乙酸酯参与的环加成反应

如碳酸钠、碳酸铯、磷酸钾以及有机碱三乙胺和DBU，虽然在这些碱的促进下，反应也能够进行，但产率都不如使用碳酸钾时高(表1，条目3⁓7)，因为我们认为碳酸钾为最优碱。随后，我们对不同类型的反应溶剂进行了筛选，发现三氯甲烷是最佳反应介质，能够得到最高69%的分离收率(表1，条目8)。而当使用其他常用溶剂比如甲苯、1,2-二氯乙烷和四氢呋喃时，则会导致反应产率下降(表1，条目9⁓11)。另外，当反应在强极性溶剂乙酸乙酯或N,N-二甲基甲酰胺中进行时，反应性非常差(表1，条目12和13)，几乎观测不到相应环加成产物的生成。最后，对反应温度的研究表明，当反应在0℃下进行时，产率明显降低，由69%下降至25% (表1，条目14)。相反，当把反应温度由室温升至35℃时，产率明显提高，达到了75% (表1，条目15)。如果继续将反应温度升至55℃，则产率没有进一步改善(表1，条目16)。因此我们认为，该环加成反应的最佳反应条件为：以碳酸钾作为布朗斯特碱，三氯甲烷作为反应溶剂，在35℃下进行反应。

Table 1. Optimization of the reaction conditions^a

表1. 反应条件优化^a

Entry	Base (3 equiv.)	Solvent	T (˚C)	Yield (%)^b
1	K2CO3	CH2Cl2	25	63
2	Ag2CO3	CH2Cl2	25	-
3	Na2CO3	CH2Cl2	25	29
4	Cs2CO3	CH2Cl2	25	48
5	K3PO4	CH2Cl2	25	43
6	Et3N	CH2Cl2	25	33
7	DBU	CH2Cl2	25	21
8	K2CO3	CHCl3	25	69
9	K2CO3	toluene	25	35
10	K2CO3	DCE	25	19
11	K2CO3	THF	25	55
12	K2CO3	EA	25	trass
13	K2CO3	DMF	25	trass
14	K2CO3	CHCl3	0	25
15	K2CO3	CHCl3	35	75
16	K2CO3	CHCl3	55	66

^aReaction conditions: N-benzoyl-α-chloro hydrazone 1a (0.1 mmol), methyl isocyanoacetate 2a (0.2 mmol), base (0.3 mmol), solvent (1.0 mL), 24 h. ^bIsolated yield.

有了最佳反应条件(表1，条目15)，我们接着对该[4 + 1]环加成反应的底物适用范围进行了探究(图3)。首先，我们在N-苯甲酰基-α-氯代腙底物1的苯环的对位、间位和邻位上成功引入了带有不同取代基的R¹基团，包括供电子的甲基、甲氧基和吸电子的氯取代基，得到了相应的多取代的吡唑-5-甘氨酸衍生物(3a-3f)，收率从中等到较高(53%⁓79%)不等。然后，在最佳反应条件下，将R¹取代基由苯甲酰基改为酯基，也并不妨碍反应的发生，可得到相应的产物3g和3h，收率为74%⁓77%。接着，我们又对N-苯甲酰基-α-氯代腙上不同取代的R²基团进行了底物适用范围的探究。我们发现，R²基团中苯环的对位(1i-1m)、间位(1n)上带有取代基，如给电子取代基甲基和吸电子取代基氟、氯、硝基、氰基，反应都能够顺利进行，并以良好到很好的收率(71%⁓87%)生成相应的环加成产物(3i-3n)。双取代底物如2,4-二甲基(1o)苯基取代的N-苯甲酰基-α-氯代腙，也能够进行[4 + 1]环加成反应，能够以66%的分离收率得到相应的环加成产物3o。最后，我们通过单晶X射线衍射分析证实了环加成产物3c (CCDC 2216568)和3o (CCDC 2216671)的结构¹。

Figure 3. Substrate scope for the [4 + 1] cycloaddition reactions

图3. [4 + 1]环加成反应底物拓展

根据目前的实验结果，我们提出了该[4 + 1]环加成反应的可能机理，如图4所示。首先，在碳酸钾的促进作用下，N-苯甲酰基-α-氯代腙1a发生消去反应，即脱去一分子的氯化氢，原位生成偶氮烯烃中间体A；然后，异氰酸酯2a中的氰基碳原子对中间体A中的端烯部位亲核进攻，经共轭加成反应，生成中间体B；随后，中间体B中的酰基氮负离子对氰基碳亲核进攻，通过分子内环加成反应，生成亚胺中间体C，中间体C再经过1,3-质子转移，通过自身芳构化，生成最终的[4 + 1]环加成产物3a。

Figure 4. Proposed reaction mechanism for the [4 + 1] annulation

图4. [4 + 1]环加成反应的可能机理

为了证实环加成产物的实用性，我们筛选了一些吡唑-5-甘氨酸产物，通过MTT实验，对HeLa癌细胞株的细胞毒性活性进行了测试，如表2所示。结果发现，产物3e具有抑制HeLa癌细胞增殖的显著活性，并且随着产物3e浓度的增加，抑制作用随之增强。这表明产物3e具有治疗宫颈癌的潜在能力。

Table 2. Activities of the product 3e against the HeLa cell line

表2. 产物3e对HeLa细胞系的活性

Concentration of 3e (μM)	Cell viability (%)
0	100
1	85.96
2	87.28
4	66.88
8	67.97
16	63.96
32	64.75
64	60.84

最后，我们对该[4 + 1]环化反应进行了克级规模实验。当把底物1a的投料量由0.1 mmol增加至5.0 mmol后，该反应能够以77%的良好收率，1.18克的产量得到相应的环加成产物3a (图5)。

Figure 5. Gram-scale experiment

图5. 克级规模实验

合成吡唑-5-甘氨酸衍生物3的一般操作步骤如下：

35℃下，将N-酰基腙1 (0.10 mmol)、碳酸钾(0.30 mmol，3.0当量)和三氯甲烷(1.0 mL)依次加入到15 mL的反应管中。然后加入异氰酸酯2 (0.20 mmol，2.0当量)。将上述体系于35℃下搅拌24小时，通过TLC监测反应进程，直到起始原料1完全消耗为止。旋转蒸发除去溶剂三氯甲烷，以硅胶作为固定相，通过闪速柱层析(石油醚:乙酸乙酯 = 8:1，V/V)纯化，得到吡唑-5-甘氨酸衍生物3。

克级规模实验的操作步骤如下：

室温下，将N-酰基腙1a (5.0 mmol, 1.22 g)、碳酸钾(15.0 mmol, 2.07 g)和三氯甲烷(50 mL)依次加入到250 mL的反应管中。然后一次性加入异氰酸酯2a (10.0 mmol, 990.9 mg)。将上述体系于35℃下搅拌24小时，通过TLC监测反应进程，直到起始原料1完全消耗为止。旋转蒸发除去溶剂三氯甲烷，以硅胶作为固定相，通过闪速柱层析(石油醚:乙酸乙酯 = 8:1，V/V)纯化，得到吡唑-5-甘氨酸衍生物3a。

MTT实验的操作步骤如下：

取对数期生长的Hela细胞，用胰酶消化得到细胞悬液，计数并调整至适宜的细胞密度。在96孔板中，每孔接种200 μL细胞，于37℃、5% CO₂的孵箱内培养24 h。然后加入不同浓度的化合物3e (化合物3e溶于100% DMSO中，浓度从1 μM到64 μM)。对照组加入相应体积的溶剂(DMSO)。然后置于37℃，5% CO₂的孵箱中继续培养48小时。之后加入终浓度为5 mg/mL的3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑20 μL培养4小时。用Bio-Rad酶标仪检测各孔在490 nm波长下的吸光度值。细胞数(%空白组) = 100 × (化合物处理组吸光度值 − 空白组吸光度值)/(对照组吸光度值 − 空白组吸光度值)，每组实验重复3次，用GraphPad Prism软件作图并计算其IC50值。

2. 结论

在布朗斯特碱碳酸钾的促进下，我们开发了异氰酸酯与原位形成的偶氮烯烃之间的高效[4 + 1]环加成反应，在温和的反应条件下，以良好至极好的产率构筑了一系列的吡唑-5-甘氨酸衍生物。在这一环加成反应中，异氰酸酯通过其亲电氰基碳原子参与反应，充当C1合成子。最后，MTT试验结果表明，吡唑-5-甘氨酸产物对Hela癌细胞具有抗增殖活性，且该反应可实现克级规模制备。

基金项目

国家自然科学基金青年基金项目“手性双臂叔膦催化剂的设计、合成及其在烯烃卤化–不对称环化反应中的应用”：22301265。

NOTES

¹CCDC 2216568 (3c) and CCDC 2216671 (3o) contain the supplementary crystallographic data for this paper.