基于网络药理学探讨李氏接骨散对骨折的作用机制

Exploring the Mechanism of Li’s Jiegu San on Fracture Healing Based on Network Pharmacology

摘要: 目的：基于网络药理学方法预测李氏接骨散治疗骨折的作用机制，并通过动物实验进行验证。方法：通过中药系统药理学数据库分析平台(TCMSP)、文献报道以及Swiss Target Prediction筛选李氏接骨散主要活性成分及靶点，利用GeneCards数据库收集骨折靶点，再使用String数据库和Cystoscope 3.7.2软件构建蛋白相互作用(PPI)网络，同时筛选核心靶点，建立“李氏接骨散–活性成分–骨折–靶点”网络，并对潜在核心靶点进行基因本体(geneontology, GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析。最后通过动物实验对李氏接骨散治疗骨折进行疗效分析，对部分靶点进行验证。结果：共筛选获得李氏接骨散活性成分20个及其相应靶点514个，骨折靶点5264个，两者交集靶点306个。李氏接骨散治疗骨折潜在核心靶点包括肿瘤蛋白p53 (TP53)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT (AKT1)、激活蛋白1 (JUN)、白介素6 (IL6)、表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤坏死因子(TNF)等。通路富集分析中与李氏接骨散治疗骨折密切相关的通路主要涉及癌症中的通路(Pathways in cancer)、血脂与动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、化学致癌作用－受体活化(Chemical carcinogenesis-receptor activation)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、小细胞肺癌(Small cell lung cancer)。结论：该研究以网络药理学分析李氏接骨散治疗骨折的作用机制，为李氏接骨散在临床治疗骨折研究提供了初步依据。

Abstract: Objective: This study explores the mechanism of Li’s Jiegu San in treating fractures using network pharmacology validated by animal experiments. Methods: The research identified the main active components and targets of Li’s Jiegu San through the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), literature reports, and Swiss Target Prediction. Fracture-related targets were collected from the GeneCards database. Using the String database and Cytoscape 3.7.2 software, we constructed a protein-protein interaction (PPI) network and identified core targets. The study then established a “Li’s Jiegu San-Active Components-Fracture-Targets” network, performing Gene Ontology (GO) functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis on the potential core targets. Animal experiments further assessed the therapeutic effects of Li’s Jiegu San on fractures with validation of specific targets. Results: The study identified 20 active components of Li’s Jiegu San and 514 corresponding targets. Additionally, 5264 fracture-related targets were collected, with 306 overlapping targets. The core targets for Li’s Jiegu San in treating fractures include tumor protein p53 (TP53), serine/threonine protein kinase AKT (AKT1), activator protein 1 (JUN), interleukin 6 (IL6), epidermal growth factor receptor (EGFR), and tumor necrosis factor (TNF). Pathway enrichment analysis highlighted pathways in cancer, lipid and atherosclerosis, chemical carcinogenesis-receptor activation, AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications, MAPK signaling pathway, and small cell lung cancer as closely related to the therapeutic effects of Li’s Jiegu San on fractures. Conclusion: This study provides a preliminary basis for understanding the mechanism of Li’s Jiegu San in treating fractures through network pharmacology analysis offering valuable insights for its clinical application.

1. 引言

骨折是指由于多种原因导致骨的完整性或连续性遭到破坏的一种疾病，临床上主要表现为局部疼痛、肿胀、发热、出血等症状，特有体征包括畸形、活动障碍等。目前临床上治疗骨折主要采取手术治疗或保守治疗，但骨折的愈合时间比较长，尤其是特定部位的骨折还会导致患者长时间卧床，容易出现压疮和血栓等并发症，给患者造成更大的痛苦[1]。因此探究有效地促进骨折愈合，减少骨折并发症的手段具有重要意义。中医药治疗骨折有着悠久的历史，并且发挥着巨大的作用。李氏接骨散是呼和浩特市名老中医李波教授祖传经验方，由乳香、没药、自然铜、续断、骨碎补、鹿茸、红花等中药组成。经过近百年临床应用，对骨折及损伤类疾病疗效确切，很受当地老百姓信任，但其从现代医学的角度促进骨折愈合的机制尚未明确。因此，本研究首先基于网络药理学，对李氏接骨散治疗骨折进行初步的网络验证，为下一步实验提供参考。

2. 资料与方法

2.1. 李氏接骨散化学成分及靶点收集

李氏接骨散由乳香、没药、续断、骨碎补、鹿茸、红花、自然铜等药物组成。采用TCMSP (https://tcmsp-e.com/tcmspsearch.php)数据库[2]检索以上中药的活性组成成分，因鹿茸和自然铜等动物和矿物类中药未被TCMSP数据库收录，因此通过BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)数据库[3]进行检索，并通过文献查漏补缺后，将鹿茸和自然铜的中药活性成分输入TCMSP数据库中进行再次检索，最后以口服生物利用度(Oral bioavailability, OB) ≥ 30%以及类药性(Drug-likeness, DL) ≥ 0.18为限定条件对所有活性成分进行筛选[4] [5]，并将获得的成分靶点分别导入Uniport数据库[6] (https://www.uniprot.org/)，对靶点名称进行标准化处理。

2.2. 骨折靶点的获取

疾病靶点：骨折疾病靶点的预测来自GeneCards (https://www.genecards.org/)数据库[7]、DisGeNET (https://www.disgenet.org/)数据库[8]、OMIM (https://www.omim.org/)数据库[9]和NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库[10]等。以“fracture”为关键词进行检索，检索日截至2022.12.25。以GeneCards数据库的疾病靶点为主，其余数据库进行相关靶点的补充，并使用将结果取交集获得与骨折疾病相关的最终靶点。

2.3. 李氏接骨散–骨折交集靶点

将所获得的李氏接骨散的药物靶点和骨折的疾病靶点导入Venny 2.1.0网站(https://bioinfogpcnb.csic.es/tools/venny/Index.html)进行匹配获得交集，并绘成韦恩(Venn)图，此交集部分为李氏接骨散治疗骨折的相关靶点。

2.4. 蛋白相互作用网络(PPI)的构建

将李氏接骨散治疗骨折的靶点基因导入String (http://string-db.org/)数据库[11]，在String的选项设置中分别选择“Homo sapiens”和“high confidence (>0.700)”，并将游离节点隐藏后得到初步PPI网络；将靶点间互作的网络关系信息导出为“TSV”文件，然后导入Cytoscape 3.9.1 (http://www.cytoscape.org)计算网络拓扑参数，根据degree、betweenness、closeness和平均最短路径筛选核心靶点。将核心靶点导入Cytoscape 3.9.1软件中，根据Degree值对靶点图形大小以及颜色深浅进行美化调节，图形越大颜色越深代表该靶点重要程度越大。

2.5. 李氏接骨散–活性成分–靶点–疾病网络的构建

将上述步骤获得的中药有效成分以及关联靶点整理成“Network”和“Type”两个EXCEL文件，并将数据导入Cytoscape 3.9.1，建立“李氏接骨散–活性成分–靶点–疾病”可视化网络[12] [13]。

2.6. GO功能富集和KEGG通路富集分析

将李氏接骨散治疗骨折的相关靶点输入Metascape (https://metascape.org)数据库[14]进行基因本体(Gene Ontology, GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路分析。设定物种为“Homo sapiens”，以P < 0.05为筛选条件，得到李氏接骨散治疗骨折的GO功能注释以及KEGG通路分析的结果，并将其结果进行可视化处理。

3. 结果

3.1. 李氏接骨散药物相关靶点的筛选

将乳香、没药、续断、骨碎补、红花、鹿茸、自然铜分别引入TCMSP数据库，筛选后乳香共有8个活性成分，没药共有45个活性成分，续断共有8个活性成分，骨碎补共有18个活性成分，红花共有22个活性成分。鹿茸、自然铜运用BATMAN-TCM结合文献检索后，鹿茸共有20个活性成分，自然铜有1个活性成分。通过Uniprot数据库将靶点蛋白进行基因标准化处理后，去掉重复值共得到514个李氏接骨散作用靶点。

3.2. 李氏接骨散–骨折共同靶基因网络分析

应用 GeneCard等数据库，共获得骨折疾病的相关基因靶点5264个(Score GDA ≥ 0.95)。将李氏接骨散作用靶点514个和骨折疾病相关靶点5264个导入Venny 2.1.0中，取两者交集共得到李氏接骨散治疗骨折的关键靶点306个，见图1。

Figure 1. Diagram of Li’s Jiegu San drug targets and fracture targets

图1. 李氏接骨散药物靶点与骨折靶点Venny图

3.3. PPI网络分析

于String数据库中输入306个李氏接骨散–骨折共同靶基因，构建PPI网络，设置筛选条件并且删除孤立节点后获得279个节点，线2173条，代表122个活性成分治疗疾病的靶点和306个蛋白互作关系。将结果导入Cytoscape 3.9.1软件中，利用Cyto NCA插件计算各节点的度值和介数的中位数，以≥度值中位数对靶点进行多次筛选，共获得关键靶基因44个：肿瘤蛋白p53 (TP53)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT (AKT1)、激活蛋白1 (JUN)、白介素6 (IL6)、表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤坏死因子(TNF)等。将核心靶点导入Cytoscape 3.9.1软件中，根据Degree值对靶点图形大小以及颜色深浅进行美化调节，图形越大颜色越深代表该靶点重要程度越大，见图2。

Figure 2. Li’s Jiegu San-fracture common targets PPI network diagram

图2. 李氏接骨散–骨折共靶点PPI图

3.4. 李氏接骨散–活性成分–靶点–疾病网络分析

通过Excel对照李氏接骨散各味中药的有效活性成分，发现“没药和骨碎补”共有成分3个，“没药和红花”共有成分3个，“没药和续断”共有成分1个，“骨碎补和红花”共有成分4个，“骨碎补和续断”共有成分1个，“没药、骨碎补、红花”共有成分2个，没药、红花、续断、骨碎补共有成分1个，按权重排序前五依次为槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、山柰酚(Kaempferol)、豆甾醇(Stigmasterol)，见表1。依据所收集的李氏接骨散对应的靶点，绘制“李氏接骨散–活性成分–靶点–疾病”网络分析，并用不同颜色区分不同中药的活性成分，见图3。

Table 1. Top 5 effective active ingredients in Li’s Jiegu San (Ranked by weight)

表1. 李氏接骨散中药共有有效活性成分前5 (按权重排)

编号	药物	编码	活性成分	OB (%)	DL
C1	没药、红花	MOL000098	quercetin	46.43	0.28
E1	骨碎补、红花	MOL000006	luteolin	36.16	0.25
D1	没药、红花、续断、骨碎补	MOL000358	β-sitosterol	36.91	0.75
E2	骨碎补、红花	MOL000422	kaempferol	41.88	0.24
B1	没药、骨碎补、红花	MOL000449	Stigmasterol	43.83	0.76

注：图中菱形代表靶点，正六边形代表活性成分，圆形代表单味中药；图标的大小与颜色的深浅代表该成分的重要程度。图标越大颜色越深表示该成分权重越重，反之越小。B1代表活性成分豆甾醇，C1代表活性成分槲皮素，D1代表活性成分β-谷甾醇，E1代表活性成分木犀草素、E2代表活性成分山柰酚。

Figure 3. Li’s Jiegu San-active ingredients-targets-diseases network diagram

图3. 李氏接骨散–活性成分–靶点–疾病网络图

3.5. GO富集分析

应用Metascape数据库将306个交集靶基因进行GO功能富集，共得到生物过程(biological process, BP) 1126个、分子功能(molecular function, MF) 227个及细胞组分(cellular component, CC) 134个，其中BP主要涉及应激素反应(response to hormone)、应外源刺激反应(response to xenobiotic stimulus)、细胞对脂质反应(cellular response to lipid)等，见图4(a)；MF主要涉及DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、信核受体活性(nuclear receptor activity)、氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)等，见图4(b)；CC主要涉及细胞膜上的膜筏(membrane raft)、转录调节复合体(transcription regulator complex)、受体复合物(receptor complex)等，见图4(c)。

(a)

(b)

(c)

(d)

注：使用按照P值排序将排名前20的富集分析结果绘制出柱状图，颜色对应P值大小。(a)为GO BP富集图，(b)为GO MF富集图，(c)为GO CC富集图，(d)为KEGG信号通路富集图。

Figure 4. Enriched pathway diagram

图4. 富集通路图

3.6. KEGG信号通路富集分析

将306个交集靶基因通过Metascape数据库进行KEGG富集分析，共获200条信号通路。富集结果显示排名较前的通路包括癌症中的通路(Pathways in cancer)、血脂与动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、化学致癌作用–受体活化(Chemical carcinogenesis-receptor activation)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、小细胞肺癌(Small cell lung cancer)等，见图4(d)。

4. 讨论

李氏接骨散是呼和浩特市名老中医李波教授祖传经验方，由乳香、没药、自然铜、续断、骨碎补、鹿茸、红花等中药组成。经过近百年临床应用，对骨折及损伤类疾病疗效确切，很受当地老百姓信任。方中红花、乳香、没药重在活血化瘀，行气止痛，对骨折早期愈合具有很好的疗效；自然铜、续断、骨碎补具有接骨续筋作用，促进骨折中期愈合；骨折后期肝肾亏损，方中鹿茸具有补肾作用，肾主骨生髓，补益先天。方中诸药合用共凑活血化瘀、接骨续筋，补益肝肾之功，从骨折愈合的三个不同时期共同促进骨折愈合[15]。

在药物活性成分方面，在组成李氏接骨散的组成中药中，各自交集的活性成分槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇等在李氏接骨散众多有效成分中占据重要地位，并可能是在治疗骨折疾病中的主要成分，将作为日后关注的重点。

研究表明，槲皮素能调控骨髓间充质干细胞和抑制破骨细胞数量，促进与骨形成、抑制骨吸收相关的信号通路，以及雌激素信号途径来改善骨质疏松[16]。β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、调节胆固醇和类雌激素效应等多种功效[17] [18]，能够上调β-catenin信号通路，增强成骨分化，促进机体骨形成[19]。木犀草素的药理活性较多，能够抗炎、抗氧化和抗癌等功效，可调控骨保护素，通过激活PI3K/Akt信号通路来增强骨折断端的血管新生和骨修复功能[20] [21]。山柰酚的药理作用包括抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、保护心脏、神经保护、抗糖尿病雌激素/抗雌激素、抗焦虑、镇痛和抗过敏等，能通过Wnt/β-catenin信号通路增加小鼠原成骨细胞的活力、增殖，起到促进成骨作用[16]。豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗癌等多种药理作用，是通过多途径、多靶点作用于人体。但由于相关研究还处于起步阶段，其具体作用机制尚未明确[22]。

通过网络药理学我们对李氏接骨散的作用机理有了初步的认识，KEGG富集结果中与癌症相关的富集结果占据了主要部分，AGE-RAGE、MAPK等多数信号通路与炎症的发生发展以及治疗密切相关，进一步验证了骨折愈合是一个非常复杂的过程，涉及多分子、多通路。TGF-β1/Smad信号通路虽然排名稍后但其和骨痂的形成、骨骼的修复与发育等过程密不可分，是骨折愈合中的经典信号通路，在骨折愈合中起到非常重要的作用。因此，我们选择了和骨折愈合相关性较强的经典信号通路TGF-β1/Smads信号通路，并进行后续的研究。

NOTES

^*通讯作者。