摘要: 采用高效液相色谱法测定四种植物多糖的单糖组成。用超声辅助提取大豆、香菇、木耳、枸杞多糖，通过三氟乙酸水解后，用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生–液相色谱法检测，并选用专属性，精密度，灵敏度，线性范围和加标回收率对此方法进行验证，最后对大豆、香菇、木耳、枸杞多糖中单糖的组成进行分析。结果表明，待测定的各单糖组分在1.03~550 μg/mL范围内呈良好的线性关系，且各组分分离度大于1.5，检出限大于2.01 μg/mL，定量限大于6.43 μg/mL，精密度与稳定性的相对标准偏差均小于4%，加标回收率在98.0%~101.4%之间，验证结果显示该方法简单快速、准确可靠。通过应用此方法测定大豆、香菇、木耳、枸杞多糖的单糖组成，结果显示大豆多糖属于以半乳糖为主的杂多糖，且半乳糖含量为53.40%；香菇和枸杞多糖属于以葡萄糖为主的杂多糖，所含的葡萄糖含量分别为45.74%和21.07%；木耳多糖属于以D-甘露糖为主的杂多糖，且D-甘露糖含量为18.64%。
Abstract: The monosaccharide compositions of four plant polysaccharides were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Polysaccharides from soybeans, shiitake mushrooms, black fungi, and wolfberries were extracted by ultrasonic assistance. After hydrolysis with trifluoroacetic acid, the samples were detected by pre-column derivatization with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) and HPLC. The method was validated using specificity, precision, sensitivity, linear range, and standard addition recovery rate. Finally, the monosaccharide compositions in polysaccharides from soybeans, shiitake mushrooms, black fungi, and wolfberries were analyzed. The results showed that the monosaccharide components to be determined showed a good linear relationship in the range of 1.03~550 μg/mL, and the resolution of each component was greater than 1.5, the detection limit was greater than 2.01 μg/mL, and the limit of quantification was greater than 6.43 μg/mL. The relative standard deviation of precision and stability was less than 4%, and the recovery of standard addition was between 98.0%~101.4%. The verification results show that the method is simple, rapid, accurate and reliable. The monosaccharide composition of soybean, shiitake mushroom, fungus and medlar polysaccharide was determined by applying this method. The results showed that soybean polysaccharide belongs to galactose-based heteropolysaccharide and the galactose content was 53.40%. The heteropolysaccharide contained 45.74% and 21.07%, respectively; the fungus polysaccharide belonged to D-mannose-based heteropolysaccharide, and the D-mannose content was 18.64%.
1. 引言
多糖(Polysaccharide)是由超过10个的单糖以糖苷键结合的糖链组成的高分子碳水化合物，可用通式(C6H10O5)n表示。多糖具有免疫调节、抗肿瘤及降血糖、降血脂、抗菌抗病毒、保护肝脏等药理作用，在医药领域具有潜在的应用价值[1]-[4]。根据来源可分为植物多糖、细菌多糖、真菌多糖和动物多糖。植物多糖参与细胞的各种生理活动，且具有多种药理作用及生物学功能，随着分子生物学、细胞生物学等相关学科及仪器技术的发展，国内外对植物多糖的复合物及化合物的研究也日渐深入[5]。植物多糖在医药领域可用于制备人工血液、药物缓释剂、人工皮肤或医用透析膜；可开发出保健食品、饮料口服液、营养强化剂等；另外也可作为果蔬的涂漠剂以及可食剂的包装材料，工业上的润滑剂和水滞留剂[6]-[8]。
多糖的单糖组成分析是控制多糖质量和分析多糖结构的重要环节。因为多糖分析具有其自身的特点，单纯的化学方法比如苯酚硫酸法、蒽酮法只能测总糖的含量，而不能对多糖中的单糖进行定量和定性分析[9]。色谱法的优点是分离效率高，可以在同一色谱柱上分离数十种甚至数百种性质类似的化合物，能用于复杂样品分析，并且分析速度快，一般而言，复杂的样品分析可在几分钟到几十分钟内完成[10]；检测灵敏度高，随着信号处理和检测器制作技术的进步，可以直接检测纳米级微量物质而无需预浓缩；样品用量少，一次分析通常只需数微升的溶液样品；选择性良好，通过选择合适的分离模式和检测方法，可以只分离或检测感兴趣的部分目标物质[9]。近年来，糖组分分析方法主要以薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、高效毛细管电泳法(HPCE) [11]、凝胶色谱法(GPC)和离子交换色谱法(IEC) [12]为主。其中，TLC操作快捷且成本低，多用于多糖的初步研究。GC所用的样品量少，分辨率高，但GC分离测定的为热稳定的挥发性化合物，需要高柱温，测定时影响的因素较多，结果的重现性相对较差。GPC和IEC设备简便、操作快捷，不需要有机溶剂，对多糖具有高分离效果，通常用于大分子多糖的分析，广泛用于多糖的分离和纯化。HPCE法是20世纪80年代发展起来的一种新型的分离分析技术，它以其快速、高效和灵敏度高、所需样品要求低和抗污染能力强等优点被广泛用于各个领域，主要集中在单糖和低聚糖的分离检测上[11]。
HPLC分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化，适用范围广，可以对70%以上的有机化合物进行分离纯化、组分分析、定量分析等。糖类物质一般由于缺少紫外或荧光生色基团，用HPLC测定糖类物质时，一般都需要进行柱前衍生化[13] [14]。适于液相色谱的衍生化方法较多，其中应用最为普遍的是1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)的衍生化方法，该方法在碱性条件下进行，对几乎所有类型的单糖都适用，并且PMP和单糖形成的衍生物带上紫外基团的同时，极性变小，便于分析[15]。HPLC分析糖类物质不存在挥发性限制的问题，同时HPLC的多种分离模式可满足大多数不同性质糖的分离分析，已成为目前糖类物质分析最重要的方法[16]。
本研究拟建立一种测定植物多糖中单糖组分的方法，以大豆、香菇、木耳和枸杞为原料，通过对其提取、水解以及衍生化处理，进行HPLC分析，并选用专属性、线性关系、灵敏度、精密度、稳定性以及加标回收率验证该方法的适用性。最后对处理好的大豆、香菇、木耳、枸杞多糖样品溶液进行测定并计算含量。
2. 材料与方法
2.1. 仪器、原料与试剂
2.1.1. 实验材料
豆渣、香菇、木耳、枸杞购于陕西商洛当地。
2.1.2. 实验试剂
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，D-核糖，D-甘露糖，D-木糖，D-无水葡萄糖，鼠李糖，半乳糖，阿拉伯糖(上海源叶生物科技有限公司)；三氟乙酸，盐酸，氢氧化钠，三氯甲烷，95%乙醇，磷酸二氢钾(均为分析纯，天津科密欧试剂有限公司)，乙腈(天津赛孚瑞科技有限公司)。
2.1.3. 仪器与设备
高效液相色谱仪(LC-20A)，超声波清洗机(KH-500TDB)，旋转蒸发仪(RE-52)，鼓风干燥箱(DHG-9146A)，电子分析天平(SI-2002)，粉碎机(YB-7008)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 多糖的提取
称取15 g烘干粉碎的豆渣、香菇、木耳、枸杞粉末于烧杯中，按料液比1:20加入0.3 mol/L的盐酸，提取温度60℃，超声处理30 min，调节pH至中性，抽滤弃去残渣，将滤液蒸发浓缩，加入四倍体积的95%乙醇，于4℃冰箱里过夜沉淀多糖，将沉淀冷冻干燥即得粗多糖。
2.2.2. 多糖的水解
称取各粗多糖100 mg分别置于10 mL具塞试管中，加入2 mol/L的三氟乙酸4 mL于97℃水浴水解5 h，水解液用4 mol/L的NaOH溶液中和至中性，离心，取上清液，即得多糖水解溶液。
2.2.3. 多糖的衍生化
取多糖样品的水解液或单糖标准溶液500 μL于试管中，加入0.3 mol/L NaOH溶液500 μL，混合后加入0.5 mol/L PMP-甲醇溶液500 μL，混匀后70℃水浴60 min，冷却后加入0.3 mol/L HCl溶液500 μL中和NaOH，纯水至4 mL。加4 mL的三氯甲烷萃取、振荡，离心后吸弃三氯甲烷层，继续重复萃取2次以除去多余的PMP，加水定容至4 mL。
2.2.4. 色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-SP C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流动相：磷酸盐缓冲溶液(pH 6.8，用磷酸二氢钾配制)；乙腈 = (83:17, V/V)；柱温：35℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：254 nm。
3. 结果与分析
3.1. 方法学验证结果
3.1.1. 专属性结果
设计空白试验，以相同的条件处理并测定空白样品和单糖混合标准品，单糖混合标准品的色谱图如图1，各单糖组分之间分离度计算结果如表1。
Figure 1. HPLC chromatograms of six monosaccharides
图1. 六种单糖HPLC色谱图
Table 1. Separation results of six monosaccharides
表1. 六种单糖分离度结果
| 单糖种类 |
保留时间 |
分离度R |
| D-核糖 |
34.621 |
2.53 |
| 鼠李糖 |
38.056 |
9.22 |
| D-无水葡萄糖 |
53.588 |
3.15 |
| 半乳糖 |
60.189 |
2.41 |
| D-木糖 |
65.440 |
2.46 |
| 阿拉伯糖 |
66.177 |
— |
由图1可见，在当前条件下D-核糖、鼠李糖、D-无水葡萄糖、半乳糖、D-木糖、阿拉伯糖等峰形良好。由图1及表1分离度结果可见，各个组分之间分离度R均大于1.5，表明所有的峰均完全分离，没有重叠，分离效果较好。
3.1.2. 线性关系及灵敏度结果
取经衍生化处理的浓度分别为1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL的单糖混合标准液，按照2.2.4中的条件进样测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，6种单糖的线性范围结果如表2。
Table 2. Standard curve of monosaccharides
表2. 单糖标准曲线方程
| 单糖 |
线性回归方程 |
R2 |
线性范围(μg/mL) |
| D-核糖 |
y = 5,000,000x + 506,722 |
0.9894 |
1.06~531 |
| 鼠李糖 |
y = 3,000,000x + 332,917 |
0.9872 |
1.03~514 |
| D-木糖 |
y = 7,000,000x + 923,598 |
0.9537 |
1.03~523 |
| D-无水葡萄糖 |
y = 2,000,000x + 228,774 |
0.9888 |
1.05~527 |
| 半乳糖 |
y = 4,000,000x + 405,909 |
0.9924 |
1.04~519 |
| 阿拉伯糖 |
y = 4,000,000x + 465,156 |
0.9942 |
1.03~514 |
由表2可以看出，6种单糖在1.03~514 μg/mL之间有较好的线性关系，相关性R2都达到了0.95以上，并且半乳糖和阿拉伯糖达到了0.99以上，说明在此条件下测得的各种单糖的相关性较好，该方法较理想。
检出限和定量限通过分析一系列含有微量混合标品的溶液进行测定，记录各单糖的信噪比，确定各单糖的检出限和定量限，结果如表3。
Table 3. LOD and LOQ results of six monosaccharides
表3. 6种单糖的检出限和定量限结果
| 单糖 |
LOD (μg/mL) |
LOQ (μg/mL) |
| D-核糖 |
1.22 |
3.66 |
| 鼠李糖 |
0.85 |
2.72 |
| D-木糖 |
0.59 |
2.42 |
| D-无水葡萄糖 |
1.14 |
4.10 |
| 半乳糖 |
2.01 |
6.43 |
| 阿拉伯糖 |
0.96 |
3.65 |
由表3可知，六种单糖的检出限大于2.01 μg/mL，定量限大于6.43 μg/mL。
3.1.3. 精密度测定结果
取经衍生化处理的单糖混合标准液，取10 μL重复进样6次，记录各单糖的保留时间和峰面积并计算6次分析下的RSD，精密度实验结果如表4。
Table 4. Results of precision experiments
表4. 精密度试验结果
| 单糖种类 |
平均保留时间(n = 6) |
保留时间RSD (%) |
平均峰面积(n = 6) |
峰面积RSD (%) |
| D-核糖 |
35.145 |
1.85 |
647,436 |
3.03 |
| 鼠李糖 |
38.574 |
1.63 |
431,781 |
3.83 |
| D-无水葡萄糖 |
54.537 |
2.11 |
290,173 |
3.05 |
| 半乳糖 |
61.230 |
2.15 |
510,791 |
2.42 |
| D-木糖 |
65.102 |
1.11 |
1,529,760 |
3.54 |
| 阿拉伯糖 |
67.430 |
2.36 |
591,773 |
2.39 |
由表4可知，各单糖的保留时间的RSD分别为0.97%、1.85%、1.63%、2.11%、2.15%、1.11%、2.36%，峰面积的RSD分别为3.03%、3.83%、3.05%、2.42%、3.54%、2.39%，表明此方法具有良好的精密度。
3.1.4. 稳定性测定结果
取经衍生化处理的四种植物多糖溶液，在0 h、2 h、4 h、6 h、10 h、24 h分别进样，分别记录四种样品各单糖保留时间及峰面积并计算RSD，结果见表5~8。
Table 5. Stability results of soybean polysaccharide
表5. 大豆多糖的稳定性结果
| 单糖种类 |
平均保留时间(n = 6) |
保留时间RSD (%) |
平均峰面积(n = 6) |
峰面积RSD (%) |
| D-核糖 |
34.114 |
3.30 |
375,897 |
3.02 |
| 鼠李糖 |
37.638 |
0.74 |
465,268 |
2.34 |
| D-无水葡萄糖 |
53.774 |
0.86 |
146,417 |
3.21 |
| 半乳糖 |
59.211 |
0.65 |
21,109,022 |
2.87 |
| D-木糖 |
62.740 |
1.01 |
2,783,870 |
1.24 |
| 阿拉伯糖 |
65.576 |
1.40 |
10,006,389 |
2.63 |
由表5可知，大豆多糖是由D-核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、D-无水葡萄糖、半乳糖、D-木糖、阿拉伯糖组成，其保留时间的RSD分别为3.30%、0.74%、0.86%、0.65%、1.01%、1.40%，峰面积的RSD分别为3.02%、2.34%、3.21%、2.87%、1.24%、2.63%，表明用此方法检测大豆多糖单糖组成结果在24 h内较稳定。
Table 6. Stability results of shiitake mushroom polysaccharide
表6. 香菇多糖的稳定性结果
| 单糖种类 |
平均保留时间(n = 6) |
保留时间RSD (%) |
平均峰面积(n = 6) |
峰面积RSD (%) |
| D-甘露糖 |
27.703 |
1.70 |
755,153 |
3.16 |
| 鼠李糖 |
38.360 |
1.76 |
806,755 |
0.86 |
| D-无水葡萄糖 |
55.281 |
2.21 |
83,554,157 |
1.62 |
由表6可知，香菇多糖是由D-甘露糖、鼠李糖、D-无水葡萄糖组成，其保留时间的RSD分别为1.70%、1.76%、2.21%，峰面积的RSD分别为3.16%、0.86%、1.62%，表明用此方法检测香菇多糖单糖组成结果在24 h内较稳定。
Table 7. Stability results of fungus polysaccharide
表7. 木耳多糖的稳定性结果
| 单糖种类 |
平均保留时间(n = 6) |
保留时间RSD (%) |
平均峰面积(n = 6) |
峰面积RSD (%) |
| D-甘露糖 |
27.744 |
2.27 |
6,346,667 |
2.45 |
| D-无水葡萄糖 |
55.605 |
2.16 |
2,053,105 |
3.26 |
| 半乳糖 |
62.562 |
1.63 |
307,742 |
1.42 |
| 阿拉伯糖 |
65.818 |
2.06 |
1,555,476 |
2.61 |
由表7可知，木耳多糖是由D-甘露糖、D-无水葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，其保留时间的RSD分别为2.27%、2.16%、1.63%、2.06%，峰面积的RSD分别为2.45%、3.26%、1.42%、2.61%，表明用此方法检测木耳多糖单糖组成结果在24 h内较稳定。
Table 8. Stability results of medlar polysaccharide
表8. 枸杞多糖的稳定性结果
| 单糖种类 |
平均保留时间(n = 6) |
保留时间RSD (%) |
平均峰面积(n = 6) |
峰面积RSD (%) |
| D-甘露糖 |
27.595 |
3.33 |
314,503 |
2.51 |
| D-无水葡萄糖 |
55.263 |
2.81 |
441,066 |
1.49 |
| 半乳糖 |
60.059 |
1.31 |
70,491 |
0.92 |
| D-木糖 |
66.013 |
0.96 |
77,501 |
3.31 |
由表8可知，枸杞多糖是由D-甘露糖、D-无水葡萄糖、半乳糖、D-木糖组成，它们的保留时间的RSD分别为3.33%、2.81%、1.31%、0.96%，它们的峰面积的RSD分别为2.51%、1.49%、0.92%、3.31%，表明用此方法检测枸杞多糖单糖组成结果在24 h内较稳定。
3.1.5. 加标回收率测定结果
准确移取10 mL的大豆多糖样品4份，其中三份分别加入1 mg/mL的阿拉伯糖1 mL、3 mL、5 mL；分别准确移取10 mL的香菇和枸杞多糖各4份，其中三份分别加入1 mg/mL的葡萄糖1 mL、3 mL、5 mL；准确移取10 mL的木耳多糖4份，其他三份分别加入1 mg/mL的D-甘露糖1 mL、3 mL、5 mL；按照样品处理方法制备样品溶液衍生化后，在相同的色谱条件下测定，记录各样品的峰面积，分别计算这四种植物多糖在三种不同的加标量下的平均回收率，结果见表9。
Table 9. Results of recovery rate
表9. 加标回收率结果
| 多糖样品 |
加标量p/(mg) |
回收率(%) |
平均回收率(%) |
| 大豆多糖 |
1.0 |
108.4 |
101.4 |
| 3.0 |
100.2 |
| 5.0 |
95.6 |
| 香菇多糖 |
1.0 |
104.7 |
99.7 |
| 3.0 |
99.9 |
| 5.0 |
94.6 |
| 木耳多糖 |
1.0 |
102.3 |
98.5 |
| 3.0 |
98.1 |
| 5.0 |
95.2 |
| 枸杞多糖 |
1.0 |
101.8 |
98.0 |
| 3.0 |
98.4 |
| 5.0 |
93.8 |
由表9可知，大豆多糖中阿拉伯糖在三种不同的加标量下的平均回收率为101.4%，香菇多糖中D-无水葡萄糖在三种不同的加标量下的平均回收率为99.7%，木耳多糖中D-甘露糖在三种不同的加标量下的平均回收率为98.5%，枸杞多糖中D-无水葡萄糖在三种不同的加标量下的平均回收率为98.0%，证明此检测方法有较好的准确度，可满足分析试验的要求。
3.1.6. 四种植物多糖样品的测定
对四种样品经水解以及衍生化处理按照2.2.4中的方法进行检测。四种样品的HPLC色谱图见图2，并对其单糖组成进行定性定量分析，结果如表10。
Figure 2. HPLC chromatograms of four plant polysaccharides
图2. 四种植物多糖的HPLC色谱图
Table 10. Analysis of monosaccharide composition and content of four plant polysaccharide samples
表10. 4种植物多糖样品的单糖组成及含量分析
| 样品名称 |
D-甘露糖 |
D-核糖 |
鼠李糖 |
葡萄糖醛酸 |
D-无水葡萄糖 |
半乳糖 |
D-木糖 |
阿拉伯糖 |
| 大豆多糖 |
— |
400.23 |
361.45 |
378.07 |
256.10 |
5951.36 |
2006.45 |
2886.06 |
| 香菇多糖 |
218.31 |
— |
151.09 |
— |
4062.85 |
— |
— |
— |
| 木耳多糖 |
1166.11 |
— |
— |
178.62 |
936.13 |
215.71 |
— |
292.00 |
| 枸杞多糖 |
829.12 |
— |
— |
— |
2835.27 |
256.84 |
271.31 |
— |
注：“—”表示未检出，表中单位为μg·mL−1。
由图2和表10可知，大豆多糖是由D-核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、D-无水葡萄糖、半乳糖、D-木糖、阿拉伯糖组成，香菇多糖是由D-甘露糖、鼠李糖、D-无水葡萄糖组成，木耳多糖是由D-甘露糖、葡萄糖醛酸、D-无水葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，枸杞多糖是由D-甘露糖、D-无水葡萄糖、半乳糖、D-木糖组成，此四种植物多糖均为杂多糖。
4. 结论
本研究利用超声辅助提取大豆、香菇、木耳、枸杞多糖，通过酸水解后采用PMP衍生化-反相液相色谱法建立了大豆、香菇、木耳、枸杞多糖中单糖的分析方法。以乙腈-磷酸缓冲盐为流动相等度洗脱在254 nm检测，发现D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-无水葡萄糖、半乳糖、D-木糖、阿拉伯糖分离度良好，其浓度在1.03~550 μg/mL范围内呈良好的线性关系(R2 > 0.95)，加标回收率在93.8%~108.4%之间，分离度大于1.5，检出限大于2.01 μg/mL，定量限大于6.43 μg/mL，精密度与重复性均小于4%，加标回收率在98.0%~101.4%之间，说明所建立的色谱方法准确、可靠，可用于大豆、香菇、木耳、枸杞多糖中单糖组成的分析，它还为测定其他多糖的单糖组成提供了参考。
通过该方法对大豆、香菇、木耳、枸杞多糖中各单糖的分析，结果发现大豆多糖是由7种单糖组成，每种单糖的含量依次为半乳糖 > 阿拉伯糖 > D-木糖 > D-核糖 > 葡萄糖醛酸 > 鼠李糖 > D-无水葡萄糖，为基于半乳糖的杂多糖，半乳糖含量为53.40%；香菇多糖是由3种单糖组成，每种单糖的含量依次为D-无水葡萄糖 > D-甘露糖 > 鼠李糖，为基于D-无水葡萄糖的杂多糖，且D-无水葡萄糖的含量为45.74%；木耳多糖是由5种单糖组成，每种单糖的含量依次为D-甘露糖 > D-无水葡萄糖 > 阿拉伯糖 > 半乳糖 > 葡萄糖醛酸，为基于D-甘露糖的杂多糖，且D-甘露糖的含量为18.64%；枸杞多糖是由4种单糖组成，每种单糖的含量依次为D-无水葡萄糖 > D-甘露糖 > D-木糖 > 半乳糖，为基于D-无水葡萄糖的杂多糖，且D-无水葡萄糖的含量为21.07%。
基金项目
本研究受陕西省教育厅自然科学专项项目“20JK0617”、陕西省教育厅一般专项项目“22JK0362”、陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院项目“23HKY035”资助。
NOTES
*通讯作者。