摘要: 目的：探讨生长分化因子15对心肌梗死大鼠的作用。方法：18只SPF级雄性SD大鼠根据随机数字表法分为模型组、实验组(A组GDF-15低剂量组10 ng/mL、B组GDF-15高剂量组50 ng/mL)，每组6只，适应性喂养1周后，每天给药1次，连续1周，末次给药6 h后，各组大鼠均结扎冠状动脉左前降支进行心肌梗死造模。采用TUNEL/DAPI双染色法观察大鼠心肌细胞凋亡情况，分别统计凋亡细胞数及细胞总数，计算出细胞凋亡率。结果：与模型组相比，对照组B的细胞凋亡率显著减少(P < 0.01)，GDF-15呈剂量依赖性地减少细胞凋亡率(P < 0.05)。结论：生长分化因子15可减轻心肌梗死大鼠的细胞凋亡。
Abstract: Objective: To investigate the effect of growth differentiation factor 15 on myocardial infarction in rats. Methods: 18 SPF grade male SD rats were divided into model group and experimental group according to random number table method (group A, low-dose GDF-15 group, 10 ng/mL, group B, high-dose GDF-15 group, 50 ng/mL), with 6 rats in each group. After adaptive feeding for 1 week, the rats were given the drug once a day for 1 week. The left anterior descending branch of the coronary artery was lapped in each group for myocardial infarction modeling. TUNEL/DAPI double staining was used to observe the apoptosis of rat cardiomyocytes. The number of apoptotic cells and the total number of apoptotic cells were counted, and the apoptosis rate was calculated. Results: Compared with model group, the apoptosis rate of control group B was significantly decreased (P < 0.01), and GDF-15 reduced the apoptosis rate in a dose-dependent manner (P < 0.05). Conclusion: Growth differentiation factor 15 can reduce apoptosis in rats with myocardial infarction.
1. 引言
急性心肌梗死是冠状动脉粥样硬化性心脏病中一种常见类型，其发病率及死亡率在我国呈显著上升趋势，且年轻化明显，对个人、家庭及社会造成极大的影响。急性心肌梗死大多是由于冠状动脉狭窄闭塞，血供减少甚至中断，使大量心肌细胞供氧不足而发生缺血坏死，导致心肌细胞代谢紊乱，脂质沉积，炎症因子高表达，触发大量心肌细胞进入凋亡程序，出现大面积心肌梗死区域，心功能进一步恶化。基于这一现状，有效改善心肌细胞缺氧缺血状态、抑制心肌细胞凋亡，才能加强及恢复心功能[1]。生长分化因子15 (GDF-15)隶属于转化生长因子β家族，参与调节人体的细胞周期、炎症反应及细胞凋亡等相关进程，是一种评估各类疾病严重程度及预后的新兴生物学标志物；血清中的GDF-15水平在处于局部缺血缺氧、损伤坏死状态下的心肌细胞中表达升高，这可能为一种对受损心功能的保护性应答反应[2] [3]，起到保护心血管内皮细胞、抑制细胞凋亡、缓解细胞损伤的作用[4]，进而促进心功能恢复，是一种防治心血管疾病的重要应激反应细胞因子[5] [6]。本研究以心肌梗死大鼠为研究对象，通过探讨生长分化因子15对心肌梗死大鼠的作用，为心肌梗死患者的临床治疗提供新思路，并为外源性给予GDF-15提供分子生物学依据。
2. 材料与仪器
2.1. 实验动物
SPF级雄性SD大鼠18只，6~8周龄，体重180~200 g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，生产许可证号：[SCXK(京)2019-0010]。本次研究实验动物饲养于康泰医学检验服务河北有限公司，使用许可证号：[SYXK(冀)2021-006]，实验动物的使用遵循3R原则。所有实验操作均获得实验动物伦理委员会审批(审批号：MDL 2023-11-20-01)。
2.2. 实验药物
GDF-15蛋白(HY-P700727)购于MCE。GDF-15蛋白使用前进行离心，收集全部蛋白于管底；离心后加入复溶缓冲液混匀，室温放置数分钟保证蛋白充分溶解；2℃~8℃保存1周。
2.3. 主要试剂及仪器
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(C1090)、抗荧光淬灭封片液(P0126)、蛋白酶K (ST533)均购于碧云天，DAPI染色液(MD912361)、Citrate柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)、PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.2~7.4)均购于MDL。
3. 方法
3.1. 动物实验分组及给药
18只SPF级健康雄性SD大鼠适应性喂养1周，根据随机数字表法随机分为三组：模型组(腹腔注射等体积生理盐水)、实验组A (腹腔注射GDF-15低剂量10 ng/mL约5 mL)、实验组B (腹腔注射GDF-15高剂量50 ng/mL约5 mL)，每组6只，每天给药1次，连续1周，在末次给药6 h后，各组大鼠均结扎冠状动脉左前降支进行心肌梗死造模。
3.2. 造模方法
将大鼠仰卧固定于手术板上，异氟烷吸入麻醉后行气管插管，胸骨左侧碘伏消毒。于胸骨左侧纵向剪开皮肤约3~4 cm，钝性分离皮下肌肉，分离到三、四肋间时暴露胸膜，用镊子撕开胸膜并剪断撑开肋骨进入胸腔，充分暴露心脏。用镊子撕开心包膜，约在左心耳与肺动脉圆锥下可见细小的冠状动脉左前降支，按压时可见变色。用5-0缝合线从右侧进针，深度约2 mm，各组均穿线后打结。肉眼观察结扎前后左室前壁的局部颜色变化，以结扎后周围心肌组织光泽度降低、心前壁颜色变苍白、心电图ST段抬高视为结扎成功。依次缝合关闭肋间隙、肌肉及皮肤，碘伏消毒皮肤，术后大鼠存活视为造模成功。术后4 h取大鼠心脏组织进行后续实验。
3.3. 大鼠心肌细胞凋亡检测
每组大鼠取心脏组织制作石蜡切片。染色前将组织切片先放入二甲苯及梯度酒精中浸泡脱蜡，再放入蒸馏水中2 min，使其逐级脱蜡水化、易于上色。配制终浓度为20 μg/mL的Proteinase K工作液，滴加覆盖全部组织，37℃孵育20 min，用PBS洗涤切片，处理后放于湿盒保存。将试剂盒中的TdT酶与荧光标记液按比例充分混匀配制出适量TUNEL检测液。PBS再次洗涤后在样品上加入50 μL TUNEL检测液，覆盖封口膜，37℃避光孵育60 min。移除封口膜，PBS再次洗涤3次，加入抗荧光淬灭封片液封片。在黑暗中用新配制的DAPI染色液对样本进行复染，室温放置5 min后PBS洗涤，共3次，每次室温作用5 min。随后立即在荧光显微镜下分析样本，用标准的荧光过滤装置在570 nm下观察红色荧光，在460 nm观察DAPI的蓝色荧光。每个标本切换3个不同的视野分别统计凋亡细胞数(红色)和细胞总数(蓝色)，计算细胞凋亡率。
3.4. 统计学方法
所有数据均采用SPSS20.0进行统计学处理，计量资料符合正态分布的以均数±标准差表示，偏态分布的以中位数表示；计量资料符合正态分布的两组间比较使用两独立样本t检验，多组间差异性比较使用单因素方差分析；不符合正态分布，或者方差不齐时，采用秩和检验。P < 0.05为差异有统计学意义。采用Graph-Pad Prism 8.0软件进行统计图表制作。
4. 结果
GDF-15可降低心肌梗死大鼠心脏组织细胞凋亡率。模型组可见凋亡细胞呈粉色，数量较对照组显著增多；实验A组可见凋亡细胞数量较对照组显著增多，荧光光度较模型组降低；实验B组可见凋亡细胞数量较对照组略有增多，较模型组与实验A组减少。与模型组相比，实验组细胞凋亡率降低，且呈剂量依赖趋势(P < 0.05)，其中对照组B的细胞凋亡率显著减少(P < 0.01)见图1、图2。
Figure 1. Heart TUNEL/DAPI staining of rats in each group at 100 μm
图1. 100 μm下各组大鼠心脏TUNEL/DAPI染色
注：与模型组相比，#P < 0.05，##P < 0.01。
Figure 2. Comparison of cardiomyocyte apoptosis rate in heart tissue of rats in each group
图2. 各组大鼠心脏组织心肌细胞凋亡率比较
5. 讨论
急性心肌梗死大多是由于冠状动脉狭窄闭塞，大量心肌细胞供氧不足，进而触发心肌细胞进入细胞凋亡程序而发生缺血坏死，其病理生理机制复杂，涉及氧化应激损伤、能量代谢障碍、微循环障碍、内质网应激、细胞凋亡、自噬等多种机制[7]。
生长分化因子15 (GDF-15)隶属于转化生长因子β家族，是一种内源性抗炎因子，参与调节人体的细胞周期、炎症反应及细胞凋亡等相关进程，是一种评估各类疾病严重程度及预后的新兴生物学标志物；血清中的GDF-15在正常心肌细胞中几乎不表达或低表达[8]，而在处于局部缺血再灌注、缺血缺氧、损伤坏死、氧化应激或压力负荷过重等应激状态下的心肌细胞中呈高表达状态，这可能为一种对受损心功能的保护性应答反应[2] [3]，起到保护心血管内皮细胞、抑制细胞凋亡、缓解细胞损伤[4]、调控脂质代谢、稳定斑块[9]、降低炎症反应[10]、改善心肌缺血、减轻心梗面积的持续扩大、促进内皮细胞增殖及血管新生[12]、稳定斑块及抗心脏重塑等心肌保护作用，促进组织修复及心功能恢复，是一种防治心血管疾病的重要应激反应细胞因子[5] [6]。既往前期研究中表明：冠心病患者血清中的GDF-15及ALP呈高表达，且与糖尿病、冠脉病变程度等呈正相关，二者的水平对冠脉病变严重程度及心血管不良事件的发生风险具有重要预测价值，是评估患者病情严重程度的可靠指标，尤其以二者联合预测价值最高，具有积极的临床应用意义及前景[11]。
心肌梗死后心肌细胞进入细胞凋亡程序。宋和鉴[12]等的研究中通过观察人源脐静脉内皮细胞(HUVECs)在缺血缺氧状态下GDF-15对其增殖和凋亡的作用及影响，发现细胞内源性GDF-15的转录、翻译和分泌可通过细胞缺血缺氧状态所促进；当人源脐静脉内皮细胞由重组人源GDF-15 (rh-GDF-15)处理后，其细胞凋亡下降显著，并通过蛋白印记实验发现随着重组人源GDF-15干预剂量的进行性升高，细胞凋亡率及细胞内p53水平进行性下降，而Bcl-2蛋白表达进行性升高，提示GDF-15呈浓度依赖性的抑制p53蛋白的表达及成体心肌细胞凋亡。翁依佳[13]等研究表明沉默GDF15能增强H2O2诱导的内皮损伤，并抑制HUVECs的血管形成能力。黄红[14]等通过细胞和动物实验，提示GDF-15主要在巨噬细胞上表达，其可通过抑制TLR4，从而抑制了ox-LDL诱导的巨噬细胞脂质积累及炎症反应，起到缓解动脉粥样硬化的作用。同时，心肌梗死后侧支循环的形成有利于心功能的恢复，既往研究表明血清GDF-15水平与冠状动脉粥样硬化性心脏病患者侧支循环的形成呈正相关[15]，同时可促进心肌内皮细胞(CMECs)增殖及成管[16]。血管内皮生长因子(VEGF)是当前最重要的血管生成刺激因子，其表达将直接影响血管新生[17]，GDF-15通过双微体同源基因2 (Mdm2)-缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)/p53-VEGF信号系统，首先通过激活Mdm2蛋白，来增加缺氧的血管内皮细胞中积聚的p53蛋白降解和出核效应，下调胞核内p53表达，上调HIF-1α蛋白表达，继而上调VEGF表达，促进血管新生的形成[12] [18]。GDF-15可通过促进生成新生血管，进而促进冠状动脉侧支循环的形成，加快对心肌梗死区域血液供应的恢复，有效改善心肌细胞的缺血缺氧状态，进一步减小心肌梗死面积[19]，逐步改善及恢复心功能。
本研究显示：急性心肌梗死后，心肌细胞凋亡率显著升高，而外源性给予GDF-15的大鼠急性心肌梗死后，高浓度的GDF-15显著减少心肌细胞凋亡，缓解心肌组织损伤，且呈剂量依赖性。综上所述，大鼠急性心肌梗死后GDF-15可明显抑制缺血缺氧状态下心肌细胞的凋亡，改善心功能。由于实验条件受限，本研究实验动物数量较少、实验方法有待完善，期待进一步改进，进一步探索其具体的分子机制。
基金项目
2022年度内蒙古医科大学校级项目(YKD2022LH054)。
NOTES
*通讯作者。