1. 引言
海洋微型污损生物系指在海工设施表面上附着繁衍的底栖微型生物，通常包括细菌类、单胞藻和原生动物，其中硅藻是其最主要的类群，并和细菌形成生物膜，与海洋腐蚀在同一个界面发生，互相作用，直接影响了海工设施的性能发挥，造成重大经济损失——仅全球防污费用每年可达200亿美元[1]-[3]。
硅藻系单细胞真核藻类，约有10万余种，占全球浮游生物总量的60%以上，贡献了全球约1/5的海洋初级生产力[4]。根据生长方式分类，硅藻可以分为浮游硅藻(Planktonic diatom)和底栖硅藻(Benthic diatom)两大类，附着在海工设施表面上的硅藻主要为底栖附着硅藻。在微型污损单胞藻群落中，硅藻具有种类多、丰度高、繁殖快等特点，可为原生动物和后生动物的幼仔提供饵料，是微型污损生物群落中70%初级生产力的主要贡献者。硅藻细胞具有硅质化的细胞壁，由96%的SiO2构成，大部分会沉积海底形成硅质沉积物，是海洋生物地球化学中海洋硅循环的主要构成。硅藻广泛分布于地球各海域，由于能够快速反映水体物质的变化，可以作为水质环境生物指标，被欧洲明确列入《水框架指南》[5] [6]。硅藻通过分泌多糖，蛋白等有机质，在细胞壁上形成胞外聚合物EPS (Extracellular polymers substance)，极易吸引原生动物及后生动物幼仔的附着[7] [8]。硅藻在进行光合作用时，需和海水中的Fe2+作用。在缺氧的环境中，厌氧细菌利用Fe2+催化进行氧化还原作用，均能影响钢铁的腐蚀作用，因而成为海洋腐蚀污损研究的热点[9]-[11]。
港湾生态是海洋生态中受人类活动影响最为严重的区域。胶州湾属北温带季风气候，典型的半日潮为我国海洋科学研究的源地，已有近百年的研究历史，现保存有50余年长期考察资料和生物样品。2003年，设置了14个基本涵盖胶州湾主要生态系统的观察站，每月检测记录湾内的水文气象参数[12]。青岛中港位于胶州湾的东岸，是海洋腐蚀学和污损生物学研究基地，已记录了50年可视污损生物种群及其变化[1] [2] [13] [14]。然而对于微型污损生物调研仅有20余年的调研资料[15]-[19]。微型污损生物群落，是在有限小空间竞争繁衍的，具有复杂的空间结构的微生态系统，是多学科关注的结合体，需要众多的、长期的、连续的调查和观察资料。青岛中港作为国际邮轮母港，受外港物种影响较大，更需关注。本文以青岛中港为例，利用PRIMER6软件[20]实施调查资料的计算，为寻求附着硅藻与浮游硅藻的相关性，同时为脆弱的港湾生态系统提供基础数据。
2. 材料与方法
2.1. 试板与实验架的制备
取载玻片试板(2.5 × 7.5 cm)，将其擦干后用丙酮和无水乙醇除油，清洗干净。用两条带槽塑料按照图1所示，将载玻片试板紧密排列，并用捆扎带对载玻片试板进行装架后固定、备用。
Figure 1. Optical photograph of the test plate after mounting
图1. 实验架实物光学照片
Figure 2. Satellite map of Jiaozhou Bay and Zhong-gang Harbor in Qingdao
图2. 胶州湾和青岛中港卫星图
Table 1. Basic physical and chemical environmental parameters of seawater in Zhong-gang harbor, Qingdao [8]
表1. 青岛中港海水物理化学环境参数[8]
| 指标 |
数据 |
| 平均气温/℃ |
12.3 |
| 平均空气湿度/% |
71.0 |
| 平均年降雨量/mm*a−1 |
643.0 |
| 平均海水温度/℃ |
13.7 |
| 平均海水盐度/‰ |
31.5 |
| 平均海水溶解氧/mg*L−1 |
8.4 |
| 平均海水pH值 |
8.3 |
2.2. 试板的投放与回收
于2016年3~8月在青岛中港海鸥浮码头投放月板试样架进行挂片实验(地标详见图2，环境理化因子见表1)。将两个实验架试板分别固定在有金属重锤的尼龙绳上，然后将实验试架试板浸入海水中1 m左右。每月取出并投放新试架试板。用无菌手套将浸入海水的试板取出，放入装有40 mL灭菌海水的离心管中。为研究深度对材料表面附着硅藻的影响，同时降低大型污损生物对附着硅藻的影响，选择青岛冬季无大型污损生物繁殖的季节，即2017年12月至2018年3月进行100天的挂片实验。表层实验试架试板浸入海水1 m左右，底层实验试架试板距离海底1 m左右。第100天取出试板备用，并用采水器，采集表层和底层水样各1 L。
2.3. 浮游硅藻样品的鉴定计数
水体浮游植物样品沉降48 h，浓缩至20 mL，使用浮游生物计数板，在带有微分干涉的Nikon Eclipse 80i显微镜下进行观察计数。每个样品计数大于200个细胞，获得物种数及相对细胞丰度数据，然后根据浓缩体积计算水体中物种的细胞丰度。对于细胞个体不足200的样品计数所有细胞，统计物种及相对丰度后，计算水体中各物种的细胞丰度。
2.4. 附着硅藻的鉴定计数
将试板表面的附着硅藻刮下，使用次氯酸钠法对附着在其表层的硅藻进行酸化，以去除其内部有机质。酸化后的硅藻壳使用Mountmedia (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan)进行封片。制成的永久封片，使用带有微分干涉的Nikon Eclipse 80i显微镜进行观察计数。在显微镜下对底栖硅藻进行鉴定和计数，每个样品需计数200个硅藻壳以上，装片内的硅藻若不足200个则全部计数。
2.5. 数据处理
使用PRIMER 6 [20]对试板表面以及水体的硅藻种群的Shannon多样性指数[21]，Pielou’s均匀度指数[22]等进行计算。附着和浮游硅藻种群的优势度(Y)计算公式如下：
式中ni为全部样品中第i个种的总丰度，N为全部样品中所有物种的总丰度，fi为第i个种在全部样品中的出现频率。
3. 结果
3.1. 月板表面附着硅藻的种类与组成
月板表面鉴定出硅藻57种，优势种见表2，其形貌详见图3。在所有试板表面附着的硅藻物种中，优势种为覆盖平片藻(Tabularia investiens)、十字卵形藻(Cocconeis stauroneiformis)、普氏藻一种(Proschkinia cf. hyalosirella)、伪菱形藻一种(Pseudo-nitzschia cf. cuspidata)、多枝舟形藻(Navicula ramossissima)和鸟喙舟形藻(Navicula avium) (优势度 > 5%，表2)。
1. 伯克利书形藻；2. 伪菱形藻；3. 覆盖平片藻； 4. 小型平片藻；5. 十字卵形藻；6. 普氏藻。
Figure 3. Dominant species attached to test plate (bar = 10 μm)
图3. 附着在试板上的优势种(标尺 = 10 μm)
Table 2. Dominant diatom species attached to the surface of the test plate
表2. 试板表面附着硅藻优势物种
| 硅藻类别 |
拉丁名 |
Y |
| 覆盖平片藻 |
Tabularia investiens |
15.09% |
| 十字卵形藻 |
Cocconeis stauroneiformis |
13.43% |
| 普氏藻一种 |
Proschkinia cf. hyalosirella |
7.17% |
| 伪菱形藻一种 |
Pseudo-nitzschia cf. cuspidata |
7.17% |
| 多枝舟形藻 |
Navicula ramossissima |
6.19% |
| 鸟喙舟形藻 |
Navicula avium |
5.06% |
| 伯克利书形藻 |
Parlibellus berkeleyi |
4.91% |
| 中肋骨条藻 |
Skeletonema costatum |
4.91% |
| 小型平片藻 |
Tabularia parva |
2.57% |
| 橙红伯克力藻 |
Berkeleya rutilans |
2.49% |
| 透明菱形藻 |
Nitzschia pellucida |
2.11% |
3.2. 3~8月试板表面附着硅藻群落结构的月变化
3~8月附着硅藻优势物种变化较大，详见图4。3月份试板表面硅藻主要为平片藻属(Tabularia)，其中覆盖平片藻占绝对优势(73.46%)；4~5月份，书形藻(Parlibellus)、舟形藻(Navicula)、海氏藻(Haslea)、普氏藻(Proschkinia)和菱形藻(Nitzschia)等属的硅藻相对丰度占优势，其中一种普氏藻占绝对优势(40.64%)；6~7月份，卵形藻(Cocconeis)和双眉藻(Amphora)等属硅藻的相对丰度占优势，其中十字卵形藻在6~7月份的试板表面最为优势(53.50%, 43.45%)。然而，到8月份时，细弱伪菱形藻(Pseudo-nitzschia cf. cuspidata)和中肋骨条藻(Skeletonema costatum)两种浮游硅藻在样品中大量出现，相对丰度分别为33.93%和23.21%。
Figure 4. Monthly variation in the relative abundance (%) of dominant attached diatom species
图4. 附着硅藻优势种的相对丰度月变化(%)
3.3. 3~8月试板表面附着硅藻的多样性变化
附着硅藻的物种数在3月份最低为12种，随后物种数逐渐升高，至8月份最高为24种。7月份物种数略低，为19种。Shannon多样性指数(H')在3月份时最低(1.05)，4月份达到最高值(2.0)，随后基本稳定(表3)。均匀度(J')与多样性基本呈现相同的趋势，即3月份时最低(0.5596)，4月份至8月份无明显的变化(0.6473~0.8174)。优势度的趋势与多样性和均匀度相反。
Table 3. Changes in the biodiversity of diatoms attached to test plates
表3. 试板附着硅藻的生物多样性变化
| 生物多样性指数/时间 |
3月 |
4月 |
5月 |
6月 |
7月 |
8月 |
| 物种数(S) |
12 |
17 |
18 |
21 |
19 |
24 |
| 多样性指数(H') |
1.051458 |
2.312677 |
2.085725 |
2.025302 |
2.150295 |
2.269714 |
| 均匀度(J') |
0.4231379 |
0.8162736 |
0.7216112 |
0.6652282 |
0.7302901 |
0.7141837 |
3.4. 冬季100天实验的附着和浮游硅藻种类与组成
在表层和底层的试板表面鉴定得到23种硅藻，在表层和底层的水体当中鉴定得到18种硅藻。其中，表层和底层试板以扇形楔形藻(Licmorphora flabellate)、奇异楔形藻(Licmorphora paradoxa)，十字卵形藻(Cocconeis stauroneiformis)和极细舟形藻(Navicula perminuta)最为优势(相对丰度均大于10%)。表层水体以绕孢角毛藻(Chaetoceros cinctus)占比最高，达81.28%，其次为中肋骨条藻(Skeletonema costatum, 12.83%)。底层水体以中肋骨条藻占比最高，达52.00%，同时还包含许多底栖物种，如透明菱形藻(Nitzschia hyalina)，极细舟形藻(Navicula perminuta)，新月细柱藻(Cylindrotheca closterium)等(表4，表5，图5)。
Table 4. Community structure of diatom species in test plates during the 100-day experiment on the Seagull from 2017 to 2018
表4. 2017~2018年海鸥号100天实验表底层试板硅藻群落结构
| 试样类型 |
硅藻种类 |
拉丁名 |
Y |
| 试板表层 |
扇形楔形藻 |
Licmorphora flabellata |
30.57% |
| 奇异楔形藻 |
Licmorphora paradoxa |
29.02% |
| 十字卵形藻 |
Cocconeis stauroneiformis |
15.03% |
| 极细舟形藻 |
Navicula perminuta |
14.51% |
| 小型平片藻 |
Tabularia parva |
3.11% |
| 舟形藻 |
Navicula sp. |
2.07% |
| 飞鸟舟形藻 |
Navicula avium |
2.07% |
| 其他 |
Others |
3.62% |
| 试板底层 |
十字卵形藻 |
Cocconeis stauroneiformis |
24.44% |
| 极小舟形藻 |
Navicla perminuta |
17.78% |
| 格氏双眉藻 |
Amphora graeffeana |
14.07% |
| 扇形楔形藻 |
Licmorphora flabellata |
11.85% |
| 奇异楔形藻 |
Licmorphora paradoxa |
11.85% |
| 双眉藻一种 |
Amphora sp. |
4.44% |
| 舟形藻一种 |
Navicula sp. |
2.96% |
| 海滨双壁藻 |
Diploneis littoralis |
2.22% |
| 橙红伯克力藻 |
Berkeleya rutilans |
2.22% |
| 透明菱形藻 |
Nitzschia hyalina |
2.22% |
| 其他 |
Others |
5.95% |
Table 5. The community structure of predominant diatom species in surface and bottom water columns during the 100-day experiment on the Seagull from 2017 to 2018
表5. 2017~2018年海鸥号100天实验表、底层水样主要硅藻物种的群落结构
| 试样类型 |
硅藻种类 |
拉丁名 |
Y |
| 表层水体 |
绕孢角毛藻 |
Chaetoceros cinctus |
81.28% |
| 中肋骨条藻 |
Skeletonema costatum |
12.83% |
| 霍氏半管藻 |
Hemiaulus hauckii |
3.21% |
| 新月细柱藻 |
Cylindrotheca closterium |
2.14% |
| 其他 |
Others |
0.54% |
续表
| 底层水体 |
中肋骨条藻 |
Skeletonema costatum |
52.00% |
| 透明菱形藻 |
Nitzschia hyalina |
8.00% |
| 极小舟形藻 |
Navicula perminuta |
8.00% |
| 舟形藻一种 |
Navicula sp. |
5.00% |
| 新月细柱藻 |
Cylindrotheca closterium |
4.00% |
| 菱形藻 |
Nitzschia sp. |
4.00% |
| 格氏双眉藻 |
Amphora graeffeana |
4.00% |
| 柔弱海链藻 |
Thalassiosira tenera |
3.00% |
| 菱形藻一种 |
Nitzschia sp. |
3.00% |
| 圆筛藻一种 |
Coscinodiscus |
2.00% |
| 奇异楔形藻 |
Licmorphora paradoxa |
2.00% |
| 尖端盘状藻 |
Tryblionella apiculata |
2.00% |
| 橙红伯克力藻 |
Berkeleya rutilans |
2.00% |
| 其他 |
Others |
1.00% |
Figure 5. The community structure of predominant diatom species during the 100-day experiment conducted from 2017 to 2018
图5. 2017~2018年100天实验中主要硅藻物种的群落结构
Table 6. Differences in diatom diversity indices between test plates and water columns (S: Number of species; J': Evenness index; H': Diversity index)
表6. 试板与水样中的硅藻多样性指数的差异(S：物种数；J'：均匀度指数；H'：多样性指数)
| Sample/多样性指数 |
S |
J' |
H' (loge) |
| 试板 |
23 |
0.6737 |
2.112 |
| 水样 |
18 |
0.587 |
1.697 |
| 底层试板 |
17 |
2.210 |
0.780 |
| 表层试板 |
10 |
1.655 |
0.719 |
| 底层水 |
13 |
1.768 |
0.689 |
| 表层水 |
6 |
0.723 |
0.404 |
3.5. 冬季100天硅藻群落结构聚类分析
试板和水体的硅藻类别具有明显差异，而表层和底层试板也存在着物种组成上的差异。总体上来看，底层试板和海水的硅藻物种数多于表层海水和试板(表4，表5)。试板表面附着的硅藻物种数S (23种 vs. 18种)、多样性指数J' (2.112 vs. 1.697)、物种均匀度H' (0.6737 vs. 0.587)均高于水体(表6)。图6的聚类分析显示，表层和底层试板表面附着硅藻的群落结构最为相近，其次为底层水体中的硅藻，而与表层水体的差异较大。
Figure 6. Clustering analysis of diatom grades on the test plates and in the water columns
图6. 试板与水体中硅藻等级聚类分析
4. 讨论
4.1. 附着硅藻种群结构的月变化
由实验结果(表2，图3)可知，3~8月份的月板表面附着硅藻的种群结构发生了较为明显的变化。3月份的试板表面检出12种硅藻，其中主要物种为固着的无壳缝硅藻平片藻。4、5月份则以舟形藻、书形藻、普氏藻等双壳缝运动类群为主要类群。6、7月份小型单壳缝附着硅藻十字卵形藻的丰度最为优势。而在8月份共检出24种硅藻，优势类群也转变为浮游型的伪菱形藻、骨条藻。附着硅藻种群结构变化可能由试板表面状态和水体环境变化引起。从生物解剖镜对月板镜检的结果可以看出(图7)，试板表面在3月时仅出现少量附着丝状藻类，而8月份的试板表面布满大型污损生物，由此增大了试板与海水界面的比表面积，改变了试板表面粗糙度，促进了试板表面生物群落结构的变化，即由微型生物膜转变为可视污损生物群落，增大了附着面积[23]。海水温度随月份的变化而升高，水温是生物最敏感的参数。水温升高，浮游生物的种类和数量增高。硅藻是海洋生物链上重要的初级生产者，维持着生态系统平衡。一般地，较高温度下物种具有较高的生长速率，菱形藻、骨条藻在八月份成为海水硅藻种群的优势种，进而成为试板上的优势种。研究指出，温度的升高会改变硅藻的生物地理学分布、物候学和营养级别[24]。
Figure 7. Optical photos of the test plates in different months
图7. 试板在不同月份的光学照片
4.2. 冬季百天附着硅藻与浮游硅藻种群结构变化
由检测结果(表4，表5，图5)表明，表层和底层试板共检测出14种硅藻，而从水体中检出15种，两者的物种数相差很小而种群结构有较大差异。试板表面附着硅藻中，优势度大于10%的为楔形藻、卵形藻和舟形藻，而表层水体中绕孢角毛藻为绝对优势种(Y = 81.28%)。其次为中肋骨条藻，占比12.8%。底层水体中的中肋骨条藻占比52%，其余十余种中出现较多的底栖物种，如透明菱形藻，舟形藻等。表层和底层附着硅藻种群结构相似，主要为底栖附着类群，明显区别于水体中的浮游硅藻类群(图6)。这可能是由于底栖附着硅藻可释放更多的EPS，相对于浮游类群具有较强的附着污损能力[25]，更容易附着在基质试板的表面。
4.3. 试板浸水时间对硅藻种群结构的影响
胶州湾冬季海水低于4℃的时间长达100多天，这段时间海水中大多数生物处于休眠期，适应冬季繁衍的硅藻种群得以充分繁衍，不必争夺生存空间。本实验百天海水中检出的浮游硅藻和附着硅藻均为该海域常见硅藻种群，但成为优势种群的通常是那些生命周期长或繁殖能力强的物种，如水体中的包角藻，中肋骨条藻；对于试板上的附着硅藻浸水百天和浸水30天的(月板)检出硅藻种群均为十多种，但物种结构存在较大差异：30天的月板上附着的平片藻占比为73.46%，为绝对优势种，而在冬季百天的试板上平片藻仅占比3.11%，占比10%以上的物种为扇形楔形藻(30.57%)、奇异楔形藻(29.02%)，详见表4。这是在无大型生物干扰下，硅藻种群间竞争的结果。马士德等在我国热带海域的三亚海水试验站研究表明，玻板浸海2天、5天、15天、30天，附着硅藻种群分别为2种、4种、7种和29种；前3周期硅藻增长速度为1倍，后15天猛增为中3周期(15天)的4倍之多[26]。热带海域在大型生物干扰下，为试板下水时间的增加硅藻物种增幅较大。
此外，浸水时间也是影响附着硅藻种类的原因之一。冬季百天(12月~次年3月)的试板和3月份试板表面的物种数差异不大(10种 vs. 12种)，但物种组成存在较大差异。3月份试板上附着的平片藻占比73.46%，而冬季百天的试板上平片藻仅占3.11%，占比10%以上的物种为扇形楔形藻(30.57%)，奇异楔形藻(29.02%)，十字卵形藻(15.03%)和极细舟形藻(14.51%)。这可能是由于前期已附着的其他硅藻对平片藻的附着产生一定的竞争作用。
4.4. 冬季百天表、底层试板与水体硅藻种群物种多样性差异
由实验结果表6所示，试板表面附着硅藻的物种数，Shannon多样性指数、均匀度等方面均高于水体中的硅藻，底层试板与底层水中的硅藻在上述指标上高于表层试板和表层水中的硅藻。这是由于表层水体中绕孢角毛藻为绝对优势种(Y = 81.28%)，其它种类物种数和细胞丰度均较低，群落组成较为单一所致。另一方面，由于底层水体扰动，底层浮游硅藻样品中混入了许多底栖附着类群，导致物种数、多样性指数较高，而表层试板因底栖硅藻扩散的局限性，使其多样性低于底层试板。
5. 结论
用自行设计的微型污损生物生态调查方法对青岛中港海域硅藻调查初步得出：
1) 3~8月的月板检测结果，硅藻的种群和群落结构逐月变化显著，是由于水温逐月升高、生物繁衍旺盛、试板表面逐月变化较大所致。
2) 百余天的冬季大型污损生物处于休眠期，百天试片和海水中硅藻检测结果物种数相近，十余种硅藻均为该海域常见种，而优势种不同：表层水中为孢角毛藻，而底层水中则为中肋骨条藻，附着硅藻为楔形藻、卵形藻和舟形藻，而浸水三十天的冬季月板则为小平片藻，这是硅藻种群之间生存竞争的结果。
3) 冬季百天硅藻种群多样性底层大于表层；附着硅藻大于浮游硅藻。
基金项目
国家自然科学基金(42076044, 59471054和59071040)。
NOTES
*通讯作者。