摘要: 三阴性乳腺癌是一种乳腺癌的亚型，其特点是缺乏雌激素受体、孕激素受体以及人表皮生长因子受体2 (HER2)受体的表达。这种癌症亚型对传统的内分泌治疗和HER2靶向治疗不敏感，因此对于三阴性乳腺癌的治疗仍然存在较大的挑战。紫杉醇是一种经典的癌症治疗药物，被广泛应用于三阴性乳腺癌的治疗中。然而，紫杉醇的疗效存在一定的局限性，其不良反应主要包括胃肠道反应、神经系统反应和骨髓抑制等。近年来，人们对于药物载体技术的研究成果日益丰富，其中胶束技术作为一种有效的药物传递系统，被广泛关注。紫杉醇胶束作为一种新型的紫杉醇制剂，具有较小的粒径、长时间的血药浓度稳定性以及较好的组织分布性。因此，探究紫杉醇胶束在治疗三阴性乳腺癌中的疗效以及对肠道菌群的影响具有重要的临床意义。此外，PARP抑制剂是一类针对DNA修复途径的药物，近年来被广泛用于治疗BRCA突变相关的乳腺癌。然而，目前关于PARP抑制剂在治疗三阴性乳腺癌中的作用还存在争议，并且其对肠道菌群的影响尚不清楚。因此，本研究旨在探究紫杉醇、紫杉醇胶束、紫杉醇加PARP抑制剂以及紫杉醇胶束加PARP抑制剂对三阴性乳腺癌肠道菌群的影响以及其疗效的对比。
Abstract: Triple-negative breast cancer constitutes a distinct subtype characterized by the conspicuous absence of estrogen receptors, progesterone receptors, and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) expression. This variant, refractory to conventional endocrine therapy and HER2-targeted interventions, presents formidable challenges in clinical management. Paclitaxel, a venerable anti-neoplastic agent, has achieved pervasive utilization in the therapeutic landscape of triple-negative breast cancer. Nonetheless, the efficacy of paclitaxel confronts certain constraints, notably adverse reactions manifesting predominantly as gastrointestinal responses, neurological manifestations, and bone marrow suppression. Recent years have witnessed notable strides in drug delivery technologies, with a particular focus on the burgeoning domain of drug carrier systems. Micelle technology, distinguished as an efficacious drug delivery system, has undergone thorough exploration. Paclitaxel micelles, a novel formulation of the aforementioned agent, showcase reduced particle size, protracted stability in blood drug concentrations, and enhanced tissue distribution. Consequently, a profound inquiry into the efficacy of paclitaxel micelles in the treatment of triple-negative breast cancer and their ramifications on the intestinal microbiota assumes paramount clinical significance. Moreover, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitors emerge as a pharmacotherapeutic class targeting the DNA repair pathway, garnering widespread employment in the recent management of breast cancer associated with BRCA mutations. However, ongoing discussions regarding the role of PARP inhibitors in the treatment of triple-negative breast cancer remain contentious, and their impact on the intestinal microbiota remains enigmatic. Thus, this study endeavors to elucidate the effects on the intestinal microbiota and juxtapose the efficacy of paclitaxel, paclitaxel micelles, paclitaxel with PARP inhibitors, and paclitaxel micelles with PARP inhibitors in the context of triple-negative breast cancer.
1. 引言
乳腺癌作为全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一[1]-[4]，其治疗和研究一直是医学领域的重点。三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌中一个特殊的亚型，由于其对传统的内分泌治疗和HER2靶向治疗的不敏感性，治疗上面临着巨大的挑战[5] [6]。TNBC的特点是雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2 (HER2)的缺失，这使得患者无法从目前乳腺癌治疗的主流方法中受益[7] [8]。因此，开发新的治疗策略对于提高TNBC患者的生存率至关重要[9] [10]。
近年来，随着对肠道微生物群落在人类健康和疾病中作用的认识不断深入，肠道微生物与癌症治疗之间的相互作用受到了广泛关注[11]。肠道微生物群落的组成和功能可能会影响药物的代谢和疗效，进而影响癌症治疗的结果[12] [13]。在TNBC的治疗中，紫杉醇作为一种常用的化疗药物，其疗效和副作用可能受到肠道微生物群落的影响[14] [15]。紫杉醇胶束作为一种新型的药物传递系统，可能提供了一种改善紫杉醇疗效和减少副作用的方法[16]。此外，PARP抑制剂作为一种新兴的靶向治疗药物，在TNBC中的应用也引起了广泛关注[17] [18]。
本研究旨在探讨紫杉醇、紫杉醇胶束以及PARP抑制剂对TNBC治疗的疗效，以及这些治疗方法对肠道菌群的影响[19] [20]。通过对比分析这些不同治疗方法对TNBC患者肠道微生物群落的影响，我们希望能够为TNBC的治疗提供更多的信息和策略，特别是在考虑到肠道微生物群落在药物代谢和疗效中可能发挥的作用。此外，本研究还将探讨紫杉醇胶束和PARP抑制剂在TNBC治疗中的潜在优势和局限性，为未来的临床应用和研究提供方向。
2. 资料方法
2.1. 分组信息
(1) 空白对照；(2) PMP紫杉醇胶束组；(3) PMP-Pi紫杉醇胶束加抑制剂组；(4) PTX紫杉醇组；(5) PTX-Pi紫杉醇抑制剂组。分别进行两组差异分析和多组差异分析。
2.2. 实验及分析流程
从样本中提取总DNA，使用琼脂糖凝胶电泳等方法检测DNA质量。质检合格后构建测序文库，进行文库质量检测，库检合格后，使用Illumina平台PE150上机测序。首先基于测序reads进行质控过滤，保留的clean reads进行组装，获得contig (即连续长序列)。基于Contig进行基因预测，再经过去冗余，得到Unigene集合。将clean reads重新比对Unigene，进行基因定量；将Unigene序列比对KEGG、eggNOG等数据库进行功能注释。对于物种注释，若选择基于reads (定量更准确，与同样本16S测序的一致性更高)，使用Kaiju软件获得物种在各样本的丰度信息；若选择基于基因(定量准确性相对较弱，但可以获得物种–功能对应关系)，使用MEGAN软件的LCA (Lowest Common Ancestor)算法获得物种的丰度信息。基于物种/功能丰度表格开展Alpha多样性、Beta多样性、物种/功能分布、物种/功能差异分析，若有环境因子表格，还可进行环境因子关联分析等。
3. 结果
3.1. 基因预测
采用MetaGeneMark软件，我们对超过500 bp的contigs进行了基因预测，并利用CD-HIT (设定为95%的同一性和90%的覆盖率)进行了基因聚类(图1)。通过选取每个聚类中最长的基因作为代表序列，我们构建了一个初步的非冗余基因集合。如图所示，我们的数据显示，对照组的非冗余基因数量明显低于所有处理组，标识紫杉醇、紫杉醇胶束加PARP抑制剂可能促进了肠道微生物组内基因多样性的增加。特别是，在PT3处理组中，我们观察到了最高的基因数量，能指示了对肠道微生物群落结构和功能特别强的影响。
Figure 1. Distribution of UniGene
图1. 非冗余基因数量分布
3.2. 基因丰度统计
Table 1. Count of the UniGene
表1. 基因统计表
| GeneID |
Control1_count |
Control2_count |
Control3_count |
PMP1_count |
PMP2_count |
PMP3_count |
| Unigene2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
| Unigene3 |
72 |
0 |
0 |
36 |
31 |
38 |
| Unigene4 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| Unigene5 |
0 |
0 |
0 |
122 |
0 |
22 |
| Unigene7 |
0 |
0 |
0 |
303 |
0 |
52 |
| Unigene10 |
266 |
0 |
17 |
9 |
19 |
12 |
| Unigene11 |
8 |
0 |
0 |
0 |
113 |
77 |
| Unigene12 |
10 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| Unigene15 |
0 |
0 |
0 |
0 |
112 |
107 |
| Unigene18 |
13 |
0 |
0 |
8 |
2 |
5 |
通过bowtie2软件将清洁读取数据重新映射到初始非冗余基因集上，随后利用PathoScope软件对读取进行重新分配，以确定最佳匹配基因(表1)。在此过程中，我们筛除了在所有样本中读取支持数不超过两个的基因，确保了数据的可靠性。基于映射的读取数量、基因的长度以及测序深度，我们计算了每个基因在各样本中的相对丰度。在表格中，我们展示了筛选后基因集中前十个基因的丰度数据。特别值得注意的是，如Unigene10在对照组中表现出显著的高丰度，而在PMP1处理组中，Unigene7的丰度极高，这表明这些基因可能在紫杉醇、紫杉醇胶束加PARP抑制剂治疗下呈现出特异性的表达模式。这些结果揭示了肠道微生物群落在药物作用下的动态变化。
3.3. 基因功能注释
在构建非冗余基因集后，我们应用了DIAMOND工具(阈值设定为e-value ≤ 1e−5)来比对样本中的Unigenes与NR，KEGG，eggNOG，CAZy，CARD，VFDB，PHI等数据库中的序列，旨在综合注释并预测微生物群落的功能特性(表2)。通过整合基因丰度数据，我们能够评估各数据库中的基因丰度，并进一步分析这些基因在样本中的分布情况。本表格展示了在不同数据库中比对得到的基因数量和在样本中的相对丰度百分比(表2)。结果表明，NR数据库中的基因占样本总基因数的83.62%，是最主要的基因资源，而KEGG和eggNOG数据库也显示出较高的基因丰度，分别占74.43%和76.18%。相比之下，MGE和BacMet数据库的基因在样本中的丰度极低，表明与这些数据库相关的功能在样本中较为稀缺。
Table 2. Count of genes in different databases
表2. 不同数据库的基因数量
| Database |
GeneCount |
GenePercent (%) |
| NR |
618,915 |
83.62% |
| KEGG |
550,886 |
74.43% |
| eggNOG |
563,839 |
76.18% |
| CAZy |
118,308 |
15.99% |
| VFDB |
76,655 |
10.36% |
| PHI |
103,425 |
13.97% |
| CARD |
29,495 |
3.99% |
| MGE |
67 |
0.01% |
| BacMet |
187 |
0.03% |
3.4. 物种组成
在本研究中，通过高通量测序技术，我们在物种水平上对比分析了不同实验组(包括对照组和各种处理组)的肠道菌群物种组成。通过绘制物种累积柱状图，我们能够直观地观察到各组中不同细菌的相对丰度分布(图2)。图中显示，Lachnospiraceae bacterium，Mucispirillum schaedleri，[Clostridium] cocleatum，Escherichia coli，以及两个Muribaculaceae bacterium的不同分离株(分别标记为Isolate-104和Isolate-110)等物种在大部分样本中均表现为优势菌群。此外，Lachnospiraceae bacterium A4，Prevotella sp. MGM2，以及Bacteroides acidifaciens也在一些样本中占据显著位置。
Figure 2. Distribution of species composition
图2. 物种组成分布
3.4.1. Alpha多样性分析
在本研究中，我们采用了Chao1指数来评估特定生境中的物种丰富度，从而量化alpha多样性。Alpha多样性是生态研究中评价单个生境或样本中物种多样性和丰富度的重要指标。通过对属水平的Chao1指数进行统计分析，我们使用Welch’s t检验对两组样本间的多样性进行对比，同时采用Tukey HSD检验来处理多组样本间的多样性比较。结果显示，不论是两组对照还是多组对照，所有的P值均大于0.05 (P > 0.05)，表明在统计上，实验组之间的物种丰富度没有显著差异。这一发现表明，无论是紫杉醇、紫杉醇胶束、紫杉醇加PARP抑制剂还是紫杉醇胶束加PARP抑制剂处理，都未对三阴性乳腺癌患者的肠道微生物群落的物种丰富度造成显著影响(图3)。
Figure 3. α diversity
图3. α多样性
3.4.2. Beta多样性分析
在我们的Beta多样性分析中，我们采用了Adonis检验，这是一种基于距离矩阵的无监督多元方差分析方法，用于确定不同实验组间样品的物种组成差异。我们的结果表明，各实验组间的物种组成没有统计学上的显著差异(P > 0.05)，这意味着各组间的物种结构具有高度相似性。此外，我们还通过Bray-Curtis距离绘制了PCoA图以直观地呈现这些结果。PCoA图进一步支持了Adonis检验的发现，显示出各个实验组的样品点在多维空间中没有明显的聚集趋势。这些分析综合表明，无论是紫杉醇、紫杉醇胶束、紫杉醇加PARP抑制剂还是紫杉醇胶束加PARP抑制剂的应用，均未对三阴性乳腺癌患者的肠道微生物群落物种结构产生显著的变化(图4)。
Figure 4. β diversity
图4. β多样性
3.4.3. 物种差异分析
我们在种水平上基于样本的物种丰度信息绘制韦恩图，展示不同样本之间的共有特微生物，结果显示PTX组相较于Control组有最多的特有菌为165个，PXT组和Control组有最多的共有菌是668个；PMP组相较于Control组有特有菌141个，PMP组和Control组有共有菌655个。PTX组和PTX-Pi组比较，共有菌774个，PMP特有菌有77个，PTX-Pi特有菌有37个；PMP组和PMP-Pi组比较，共有菌719个，PTX特有菌59个，PMP-Pi特有菌38个(图5)。
Figure 5. Venn of the taxa
图5. 物种韦恩图
3.4.4. 物种差异Indicator分析
Indicator分析常用来筛选各个分组的指示物种，指示物种(biomarker)是指一定区域范围内能指示生长环境或某些环境条件的物种或群落。我们筛选出属水平top10的biomarker有Archaea_noname、Methanobrevibacter、Methanothrix、Candidatus_Methanomethylophilus、Methanomassiliicoccales_noname、Acidobacteria_noname、Actinomyces、Bifidobacterium、Corynebacterium、Mycobacterium。同时绘制了气泡图可直观通过气泡大小寻找各分组的biomarker (图6)。
Figure 6. Indicator of the biomarker
图6. 生物标志物分析
3.5. 基因丰度统计KEGG功能分析
3.5.1. KEGG-功能分布分析
KEGG是一个关于基因功能注释方面的综合性数据库，包括基因的功能、分类、代谢通路(KEGG Pathway数据库，是KEGG最核心的功能注释数据库)等诸多方面的信息。主要的代谢通路如下图所示，所有分组中占比最多的通路为Metabolic pathways (图7)。
Figure 7. Distribution of metabolic pathways
图7. 代谢通路分布
3.5.2. KEGG-Beta多样性分析
我们基于第三级Pathway进行分析，采用经典的Beta多样性距离指数进行分析，基于Bray_curtis距离指数绘制绘制PCoA图。结果显示PMP组、PTX组、PTX-Pi组均距离Control组较远，且PMP的组内距离最近，其次是PTX组(图8)。
Figure 8. β diversity of the pathway
图8. 代谢通路的β多样性
3.5.3. KEGG-功能差异分析Alpha多样性分析
我们基于第三级Pathway进行分析并绘制韦恩图，结果显示PMP-Pi组有最多的特有通路为16个，PTX-Pi无特有通路，其次是PMP仅有一个特有通路(图9)。
Figure 9. Venn of the pathway
图9. 代谢通路维恩图
3.6. eggNOG功能分析
3.6.1. eggNOG-功能分布分析
我们基于LevelA使用Diamond进行eggNOG注释，下图以柱形图展示25个功能分类的基因数目统计情况，对比群落中各功能分类的基因数量分布(图10)。
Figure 10. Relative abundance distribution of eggNOG
图10. eggNOG相对丰度分布
3.6.2. eggNOG-Beta多样性分析
我们基于LevelA进行分析，采用经典的Beta多样性距离指数进行分析，基于Bray_curtis距离指数绘制绘制PCoA图。结果显示PMP组内距离最近，且与Control组的组间距离最远，其次是PTX组，PMP-Pi组内距离最远(图11)。
Figure 11. β diversity of the eggNOG
图11. eggNOG β多样性
3.6.3. eggNOG-功能差异分析
我们基于Level A进行分析并绘制韦恩图，eggNOG-功能分析各组无特有基因，共有基因23个(图12)。
Figure 12. Venn of eggNOG
图12. eggNOG韦恩图
3.7. 代谢通路ReporterScore分析
对比较组内pathway，我们基于reporter_score算法，进行精细的差异分析，获得pathway的得分，我们挑选显著富集的20条代谢通路，绘制柱形图展示(图13，表3)。
Table 3. Main information of the top 10 metabolic pathways
表3. 前10个代谢通路的主要信息
| Pathway ID |
Pathway |
ReporterScore |
Sig |
Control |
| ko01100 |
Metabolic pathways |
0.3581161297184898 |
ns |
0.15674793857689232 |
| ko01110 |
Biosynthesis of secondary metabolites |
0.036811161671251945 |
ns |
0.06868525839900314 |
| ko01120 |
Microbial metabolism in diverse environments |
0.30468223106776066 |
ns |
0.03461713639906878 |
| ko01230 |
Biosynthesis of amino acids |
−0.6937807445909746 |
ns |
0.028293036447271058 |
| ko02020 |
Two-component system |
0.16955124744465508 |
ns |
0.02106490273872344 |
| ko02010 |
ABC transporters |
−1.5877975202287902 |
ns |
0.015233900886231893 |
| ko01200 |
Carbon metabolism |
2.2867237517236547 |
* |
0.020154575150774987 |
| ko00520 |
Amino sugar and nucleotide sugar metabolism |
3.704777904841253 |
* |
0.014021273703245615 |
| ko02024 |
Quorum sensing |
−2.332010109028414 |
* |
0.009550999473314637 |
| ko00230 |
Purine metabolism |
−1.2853867403498587 |
ns |
0.013004228560885735 |
Figure 13. Lefse score of the reporter score
图13. Reporter score的Lefse打分
4. 总结与展望
本研究深入探讨了紫杉醇、紫杉醇胶束以及PARP抑制剂在三阴性乳腺癌治疗中的应用及其对肠道菌群的影响。研究结果显示，这些治疗方法对肠道微生物群落的物种丰富度和结构均未产生显著影响，从而提供了关于这些治疗策略生物相容性的新见解。
在紫杉醇和紫杉醇胶束的比较中，我们发现紫杉醇胶束在治疗效果上可能有一定优势，尤其是在药物传递和组织分布方面。然而，这些发现需要在临床实验中进一步验证。同时，我们也注意到PARP抑制剂在三阴性乳腺癌的治疗中仍存在争议，尽管在BRCA突变相关乳腺癌中表现出潜力。
在未来的研究中，更多的焦点可能会放在以下几个方面：
1) 长期影响的评估：探索这些治疗方法在长期应用后对肠道菌群结构和功能的影响，特别是它们如何影响肠道微生态平衡和患者的整体健康。
2) 临床试验的开展：通过临床试验验证实验结果，特别是评估紫杉醇胶束和PARP抑制剂的安全性和疗效，以及这些治疗方法对肠道菌群的长期影响。
3) 个体化治疗方案的探索：基于患者个体的肠道菌群组成和遗传背景，探索更加个性化的治疗方案，以提高治疗效果并减少不良反应。
4) 药物开发与优化：进一步优化紫杉醇胶束和PARP抑制剂的配方，以提高其治疗效果和生物相容性。
5) 微生物群落与癌症治疗关系的深入研究：深入研究肠道菌群与癌症治疗之间的相互作用机制，以期发现新的治疗靶点或辅助治疗方法。
通过这些研究，我们可以更好地理解和利用肠道微生物群落在癌症治疗中的作用，从而为三阴性乳腺癌患者提供更有效、更安全的治疗方案。
NOTES
*通讯作者。