基于网络药理学和分子对接的附子回阳救逆机制研究

Network Pharmacology Prediction and Molecular Docking-Based Strategy to Explore the Mechanism of Fuzi Bring Back Yang and Rescue from the Collapse

摘要: 目的：基于网络药理学和分子对接方法分析附子回阳救逆的具体作用机制，为新药研发及临床用药提供参考。方法：通过TCMSP、ETCM、HERB、SymMap数据库获取附子的主要化学成分，根据ADME筛选活性成分；通过STP数据库获取主要成分对应靶点；通过Gencards、OMIM数据库获取疾病主要靶点，利用String平台进行蛋白质相互作用分析，构建PPI网络并挖掘网络中潜在的蛋白质功能模块。采用DAVID数据库平台分析“药物–成分–靶点”及其参与的生物过程及通路，最后通过AutoDock Vina进行分子对接验证。结果：附子回阳救逆的核心活性成分为石防风素、多根乌头碱、去甲乌药碱，核心靶点有EGFR、MAPK1、MAPK3等，分子对接验证亦显示靶点与成分的结合活性较好。通路主要作用于cAMP信号通路、MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路。结论：本研究对附子回阳救逆传统功效进行了全面的解释，为后续基础研究提供参考。

Abstract: Objctive: Based on network pharmacology and molecular docking methods, to analyze the specific mechanism of fuzi bring back yang and rescue from the collapse, so as to provide reference for new drug development and clinical use. Methods: The principal chemical components of fuzi were obtained through TCMSP, ETCM, HERB, and SymMap databases, and the active ingredients were screened according to ADME; the corresponding targets of the components were searched on STP database and the important targets of diseases were obtained through the Gencards and OMIM databases. The intersection of compound target and disease target was obtained and the coincidence target was imported into STRING database to construct a PPI network. The DAVID database platform was used to analyze “drug-ingredient-target” and the biological processes and pathways involved, and finally the molecular docking verification was carried out through AutoDock Vina. Results: The core active ingredients of Fuzi bring back yang and rescue from the collapse are deltoin, karakoline, (R)-norcoclaurine. The protein with a higher degree in the PPI network is EGFR, MAPK1, MAPK3. Molecular docking verification also shows the binding activity between the target and the ingredients better. The signaling pathways mainly include cAMP, MAPK and PI3K-Akt signaling pathway. Conclusion: This study reveals a comprehensive explanation of the traditional efficacy of fuzi huiyangjiuni, and provides a reference for subsequent basic research.

1. 引言

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品。其气微，味淡，口尝无麻舌感，其性味表现为辛、甘，大热。归心、肾、脾三经。附子药性刚燥，走而不守，能上助心阳以通脉，中温脾阳以健运，下补肾阳以益火，是温里扶阳的要药，有“回阳救逆第一品”之称。附子具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛之的传统功效，用于亡阳虚脱，肢冷脉微，阴寒水肿，肾阳不足，阳虚外感，寒湿痹痛，四肢厥逆等沉寒痐冷之症。据现代药理研究，附子有强心、抗休克、扩张血管、抗炎、改善血流动力学、促进能量代谢功能[1]-[3]，此即回阳救逆功效的现代表现。由于多成分的特性，附子对血压、心肌收缩力、心率、心肌耗氧量、血管阻力均具有双向的调节作用，这种双向调节作用与机体所处的病理生理状态以及附子活性成分的复杂性相关[4]。现代药理学对附子回阳救逆作用的解释多偏重于其强心作用，而忽略了它对炎症、微循环、心肌保护等作用的研究。同样对附子的药效物质的研究也偏重于具有强心作用的乌头碱类化合物。而单就附子强心作用而言，其功效成分和毒效成分难以分开，这极大地限制了附子的临床使用，这也是中药附子在进一步开发利用中遇到的瓶颈。目前，对附子回阳救逆这一传统功效的现代药理机制解释不够全面和深入，传统功效和现代药理作用之间没能形成完整的对接，其功效活性物质也不清楚。网络药理学技术具有整体性、系统性的特点，与中医药整体观、辨证论治原则一致。本项研究基于网络药理学技术从系统层次和生物网络的整体角度出发，解析药物与疾病之间的分子关联规律，阐释整体作用的特点，为揭示附子“回阳救逆”传统功效的现代药理学机制提供网络药理学数据的支持，更为后续的研究工作奠定基础。

2. 材料与方法

2.1. 附子主要成分的收集与筛选

通过TCMSP (Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)、ETCM、HERB、SymMap数据库获取附子的主要化学成分，将所得的成分汇总去重后，根据口服利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%且类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18的2个ADME属性值对活性成分进行初筛。

2.2. 附子主要成分靶点预测

从TCMSP数据库中获取化学成分的InChIKey号，将InChIKey导入PubChem中获取其对应的Canonical SMILES号，再将得到的Canonical SMILES序列输入到STP数据库 (http://www.swisstargetprediction.ch/)，每个成分根据预测值大于0的前25个靶点(不足则全取)作为筛选条件，得到化合物对应的靶点。

2.3. 疾病成分靶点预测

根据文献参考以及药理学知识，对以下类型疾病进行靶点筛选：心力衰竭(Heart failure)；心肌细胞保护(Myocardial cell protection)；心律失常(Arrhythmia)；循环障碍(Circulatory disorder)、休克(Shock)、四肢厥逆症(Limb syncope)；炎症风暴(Inflammatory storm)。在Genecards数据库、OMIM数据库中搜索其疾病靶点，从数据库结果的条目中筛选适合的疾病(disease)和指征(indication)，收集各个数据库中score排序前500的靶点(不足则全取)，得到疾病预测靶点。

2.4. 附子主要成分与疾病靶点交集映射

利用Venny 2.1.0将从STP数据库中得到的化学成分预测靶点分别与疾病基因映射取交集，制作Venn图。

2.5. 附子成分–疾病靶点PPI网络构建

将交集靶点提交至STRING11.5数据库(https://string-db.org)构建蛋白互作(PPI)网络模型将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“high confidence”(>0.7)，其余设置均为默认设置，构建PPI网络关系，导入Cytoscape 3.9.1，利用CytoNCA (度中心性(degree)、中介中心性(Betweenness)以及接近中心性(Closeness))对网络进行可视化交集分析。

2.6. 附子成分–疾病靶点功能与通路的富集分析

通过DAVID数据库对作用靶点分别进行基因本体功能(Gene Ontology, GO分析)与京都基因和基因组百科全书富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG分析)，其中GO分析包括生物学过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)及细胞组分(cellular component, CC)。使用微生信(https://bioinformatics.com.cn/)进行分析。

2.7. 分子对接

分析得到附子成分–疾病靶点网络图中度值排名前3的靶点，查找其PDB ID，通过AutoDock Vina将预测靶点与附子主要活性成分进行对接。根据Docking Score值评价靶点与活性化合物的结合强度与活性。

3. 结果

3.1. 附子主要成分的收集与筛选

从ETCM中获取38个成分、HERB中得到135、SymMap获得251个成分、TCMSP得到65个成分。根据OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18筛选得到21个成分，筛选完后加入aconitine (乌头碱)、mesaconitin (新乌头碱)。乌头碱、新乌头碱已被大量研究报道证实为附子生物碱的主要活性成分，见表1。

Table 1. Main component information

表1. 附子主要成分信息表

Mol ID	化合物	分子式	Pubchem ID	OB (%)	DL
MOL002211	11,14-eicosadienoic acid	C20H36O2	5282805	39.99	0.2
MOL002388	Delphin_qt	C15O7H6	-	57.76	0.28
MOL002392	Deltoin	C19H20O5	162833668	46.69	0.37
MOL002393	Demethyldelavaine A	C37H52N2O11	5316517	34.52	0.18
MOL002394	Demethyldelavaine B	C37H52N2O11	5316518	34.52	0.18
MOL002395	Deoxyandrographolide	C20H30O4	15922991	56.3	0.31
MOL002397	karakoline	C22H35NO4	25083395	51.73	0.73
MOL002398	Karanjin	C18H12O4	100633	69.56	0.34
MOL002401	Neokadsuranic acid B	C30H44O3	162999855	43.1	0.85
MOL002406	2,7-Dideacetyl-2,7-dibenzoyl-taxayunnanine F	C42H48O14	162870998	39.43	0.38
MOL002410	benzoylnapelline	C29H37NO4	3075701	34.06	0.53
MOL002415	6-Demethyldesoline	C24H39NO7	162859296	51.87	0.66
MOL002416	deoxyaconitine	C34H47NO10	21598997	30.96	0.24
MOL002419	(R)-Norcoclaurine	C16H17NO3	440988	82.54	0.21
MOL002421	ignavine	C27H31NO5	3035320	84.08	0.25
MOL002422	isotalatizidine	C23H37NO5	11452543	50.82	0.73
MOL002423	jesaconitine	C35H49NO12	76963334	33.41	0.19
MOL002433	(3R,8S,9R,10R,13R,14S,17R)-3-hydroxy-4,4, 9,13,14-pentamethyl-17-[(E,2R)-6-methyl-7-[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6- (hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxymethyl]oxan- 2-yl]oxyhept-5-en-2-yl]-1,2,3,7,8,10,12,15, 16,17-decahydr	C42H68O13	6324887	41.52	0.22
MOL002434	Carnosifloside I_qt	C42H68O13	-	38.16	0.8
MOL000359	sitosterol	C29H50O	12303645	36.91	0.75
MOL000538	hypaconitine	C33H45NO10	163074003	31.39	0.26
MOL002424	Aconitine	C34H47NO11	162969175	7.87	0.23
MOL002089	mesaconitine	C33H45NO11	441747	8.7	0.25

3.2. 附子主要成分靶点预测

从STP数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)中获取成分对应的靶点根据预测值大于0取前25个靶点，去重后得19个化合物对应238个靶点。采用Cytoscape 3.9.1进行可视化分析，并绘制附子成分–靶点网络图，得到257个节点，436条相互作用线(图1)。根据度值排名，前3的化合物主要为石防风素、多根乌头碱、去甲乌药碱。

Figure 1. Fuzi component-target network diagram

图1. 附子成分–靶点网络图

3.3. 疾病成分靶点预测

从Genecards、OMIM数据库中搜索其疾病靶点，收集各个数据库中score排序前500的靶点(不足则全取)，去重后得到5791个靶点。

3.4. 附子主要成分与疾病靶点交集映射

将从STP数据库中得到的238个预测靶点与5791个疾病基因映射取交集，得到171个预测基因，并制作Venn图，见图2。

Figure 2. Disease target mapping of Fuzi components

图2. 附子成分疾病靶点映射图

Figure 3. Interaction target protein interaction diagram

图3. 交集靶点蛋白相互作用图

3.5. 附子成分–疾病靶点PPI网络构建

将潜在作用靶点导入STRING数据库即可获得拥有171个节点，424条相互作用线，平均节点度为4.96，局部聚类系数为0.453的网络图。将交互分数设置为0.700，勾选“hide disconnected nodes in the network”选项，得到蛋白相互作用网络图(图3)以及数据。数据导入Cytoscape 3.9.1对PPI进行可视化分析图中节点越大，度值越高，其为核心目标的可能性就越大(图4)。排名前十的目标为EGFR、MAPK3、MAPK1、PIK3CA、PRKCD、ADRBK1、JAK2、ESR1、MAPK8、MTOR。

Figure 4. PPI network diagram

图4. PPI网络图

3.6. 附子成分–疾病靶点功能与通路的富集分析

GO分析：利用David平台对潜在预测靶点分别进行GO分析，根据P value得到基因GO本体条目394条(P < 0.05)。其中生物过程(BP)相关的条目为203条；细胞组分(CC)相关条目68条；分子功能(MF)相关条目123条。将基因GO本体条目按P值进行排序，分别选取各类别中的BP、CC和MF的前10绘制柱形图，见图5。

Figure 5. GO analysis of the top 10 items of BP, CC and MF

图5. GO分析BP、CC和MF前10项

David平台得到KEGG通路富集分析104条(P < 0.05)，主要涉及钙信号通路、cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路、等信号通路，以P-value值进行排序，取前20绘制柱形图见图6。

Figure 6. KEGG analysis top 20 items

图6. KEGG分析前20项

3.7. 分子对接

根据网络药理学结果，筛选出排名前3的蛋白EGFR、MAPK3、MAPK1作为大分子受体，附子化合物作为小分子配体，进行分子对接验证。

3.7.1. 获取配体分子和受体蛋白文件

通过TCMSP数据库获取附子化合物对应的mol2文件，PDB数据库获得获取关键靶点相应的PDB ID。

3.7.2. Autodock Vina输出对接结果

Table 2. Binding energies of compounds and core targets

表2. 化合物与核心靶点的结合能

靶点	化合物	结合能
EGFR	石防风素	−5.14 kcal/mol
	多根乌头碱	−4.36 kcal/mol
	去甲乌药碱	−3.70 kcal/mol
MAPK1	石防风素	−6.08 kcal/mol
	多根乌头碱	−5.15 kcal/mol
	去甲乌药碱	−4.44 kcal/mol
MAPK3	石防风素	−5.56 kcal/mol
	多根乌头碱	−4.53 kcal/mol
	去甲乌药碱	−5.69 kcal/mol

如表2所示，3个主要成分与靶点对接结合成功后的结合能均小于0，表明配体分子均能与受体蛋白自发结合。

3.7.3. 使用Pymol分析对接结果

分子对接分析时，最优对接结果中配体成分与蛋白的氨基酸残基(对接活性位点)主要发生氢键作用、π-π共轭(pi-pi interaction)以及阳离子相互作用(pi-cation interaction)等分子间相互作用。使用Pymol对结合能小于-5 kcal/mol的对接结果进行分析，检查复合物中配体成分与受体蛋白的氢键相互作用情况(图7)。

(a) deltoin-EGFR (b) deltoin-MAPK1

(c) deltoin-MAPK3 (d) karakoline-MAPK1

(e) (R)-Norcoclaurine-MAPK3

Figure 7. Molecular docking results of main compounds of fuzi

图7. 附子主要化合物分子对接结果

结果表明，石防风素可与EGFR、MAPK1、MAPK3、PIK3CA相互作用(图7(a)~(c))；多根乌头碱可与MAPK1形成3个氢键(图7(d))；去甲乌药碱可与MAPK3形成3个氢键(图7(e))。基于此，预测这些化合物在附子回阳救逆功效中发挥着重要作用。

4. 讨论

明代名医张景岳把附子列为“药中四维”之一。他说：“夫人参、熟地、附子、大黄，实乃药中之四维，人参、熟地者，治世之良相也；附子、大黄者，乱世之良将也。”清代名医陆懋修认为：“药之能起死回生者，唯有石膏、大黄、附子、人参。有此四药之病，一剂可以回春，舍此之外则不能。”有“乱世之良将”之称的附子被历代医家用于“亡阳厥逆”证的治疗，足见附子在救治急症方面的地位和价值。从中医辩证的角度来看，亡阳厥逆属阳脱症，表现为脉微欲绝、四肢厥冷。四肢为诸阳之末，阳气不足，阴寒内盛，则阳气不能敷布，以致四肢厥冷；阳气虚衰，不能鼓舞血液运行，则见脉象沉微，与现代医学中的冷休克症状相似。冷休克时患者机体处于高阻低排状态，血管阻力增高，回心血量减少，每搏输出量也相应减少，心率代偿性增加，心肌耗氧量增加[5]。冷休克是多种临床疾症引起的终末症状，如急性心力衰竭、脑卒中、急性冠状动脉综合征等。对于这些急症的处理不只是单纯的对症治疗，同时还需要改善血液循环障碍、增加重要器官血流灌注以及加强对缺血细胞的保护等综合治疗。对附子回阳救逆的传统功效的机制分析一直偏重于其强心作用，而其是否具有调节血管阻力、改善微循环和器官血流灌注以及保护心肌细胞的作用少见报道，对其回阳救逆功效的解释较为片面。

本研究的主要目的是对附子回阳救逆传统功效的现代药理机制进行全面深入的解释。经过大量的筛选之后，得到19个化合物对应238个潜在靶点。其中主要化合物包括石防风素、多根乌头碱、去甲乌药碱。石防风素属于香豆素类化合物，对于由心律失常诱发的心力衰竭有保护作用[6]，还可抑制钙离子经钙通道进入细胞，从而产生降压、负性肌力及血管松弛作用[7]。此外，石防风素可通过抑制TNF-α的表达发挥抗炎作用[8]。多根乌头碱除具有强心作用外[9]，还可抑制炎症发生发展过程中炎症介质的释放、改善血液流变学指标等[10]。去甲乌药碱除具有强心作用外，还具有抗炎、舒张血管、保护细胞等作用[11] [12]。研究发现去甲乌药碱可以兴奋受体-G蛋白-cAMP对心脏产生正性肌力、正性频率作用[13]，轻度上调β-AR的活性[14]。有实验研究表明，去甲乌药碱可通过拮抗α₁‐AR而产生舒张血管，降低血压的作用[15]。去甲乌药碱可以降低过敏性鼻炎小鼠血清中IgE、组胺和IL-4的水平，并调节Th1/Th2细胞的失衡，进而发挥抗炎作用[16]。此外，去甲乌药碱可以抑制心肌纤维化，改善左心室重构、从而阻断心肾交互，对心肾产生保护作用，改善心肾功能[17]。去甲乌药碱通过激活PI3K/Akt信号通路抑制心肌细胞凋亡，减轻缺血再灌注引起的心肌损伤[18] [19]，并通过转录因子Nrf-2诱导血红素氧合酶1 (Heme Oxygenase 1, HO-1)表达发挥抗氧化、抗凋亡、血管扩张等作用，进而发挥对心肌细胞的保护作用[20]，还可改善氧–葡萄糖剥夺/再灌注诱导的神经原细胞损伤[21]。综上所述，去甲乌药碱可通过受体作用、激活PI3K/Akt信号通路等作用改善冷休克状态下的心排出量减少、血管收缩、微循环瘀滞、心肌细胞损伤。

从Genecards、OMIM数据库筛选得到5791个疾病靶点。发现附子与疾病之间有171个共同靶点，PPI显示EGFR、MAPK3、MAPK1可能是核心靶标。EGFR是一类细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶活性，当与其配体结合后会发生自动磷酸化[22]。既往研究提示EGFR可能参与调控心肌细胞的电兴奋性，其机制可能与促进Nav1.5 (心肌钠通道)和Cav1.2a (L型钙通道蛋白)的酪氨酸磷酸化有关[23]。MAPK1是MAPK信号通路中的关键激酶，抑制MAPK1表达可抑制炎症的发生[24] [25]。MAPK3被证实在心肌细胞凋亡和氧化损伤中发挥保护作用[26] [27]，PI3K/AKT信号通路被激活后，可促进MAPK3表达，减轻心肌细胞损伤[28]。

通过GO和KEGG富集分析来全面系统的分析附子的作用机制。KEGG分析显示，附子通过相关靶点的不同途径/信号通路产生不同的药理作用。cAMP信号通路是治疗心力衰竭的关键信号通路发挥治疗作用。有实验研究表明激活cAMP信号通路可抑制心肌细胞的凋亡，稳定心力衰竭大鼠的心脏功能[29]。

MAPK信号通路在炎症以及微循环障碍方面发挥重要作用。MAPK信号通路是细胞中重要的信使型信号通路，参与机体许多生物过程[30] [31]，与机体炎症密切相关[32] [33]。细胞因子刺激或者细胞处于应激状态时可以激活该通路，该通路主要包括3个信号调节激酶，其中的p38信号通路可引起白细胞和血小板激活，促进炎症因子、细胞趋化因子、黏附分子表达，增强白细胞与内皮细胞相互作用，从而产生过量活性氧加剧微血管内炎症，造成微循环障碍[34]。有研究表明抑制p38活性能够有效减轻炎症反应[31] [35]，从而促进供血功能，改善血液循环障碍。

在心肌保护方面，PI3K-Akt信号通路发挥着重要的作用。PI3K/AKT信号通路参与细胞增殖、分化、凋亡等多种功能的调节，是一条重要的调控心肌细胞存活和功能的信号通路，可以介导心肌细胞的保护作用[36] [37]。有研究表明，激活PI3K/AKT信号通路可抑制细胞凋亡，减轻心肌缺血再灌注损伤[38]，增加心肌细胞ATP含量，改善心肌细胞能量代谢缺血，进而保护缺血心肌，增加对缺血心肌供氧供能，使心肌氧的供求趋向平衡。最后结合分子对接技术探讨其分子机制，对接结果表明，这3个化合物均能与靶点结合。

综上，附子“回阳救逆”作用是基于多个药效物质对多靶点多通路的交互作用上，这体现了中医药多靶治疗的特点。附子救治“亡阳厥逆”证不仅仅体现在强心作用上，在强心的同时，其改善血管炎症和微循环作用，以及心肌细胞保护作用在治疗中均贡献突出，是中医药综合治疗的典型体现。

5. 结论

本研究基于网络药理学和分子对接技术，对附子的主要化学成分及其回阳救逆功效的潜在机制进行了初步探索。我们的研究表明石防风素、多根乌头碱、去甲乌药碱可能是附子的主要活性成分，EGFR、MAPK1、MAPK3可能是潜在的治疗靶点。附子可能通过cAMP信号通路、MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路等发挥治疗作用。此外，我们的研究将为附子后续的基础研究和临床用药提供参考。

NOTES

^*通讯作者。