1. 引言
目前各国药典对药品的无菌检查均采用培养基浑浊观察法来判断其无菌状况[1]-[3]。现行的无菌检查法作为法定方法及判定金标准沿用多年，适用范围广，但也存在着一定的局限性[4]。首先，根据中国药典2020版四部“1101无菌检查法”，培养时间不少于14天。对于短效期的无菌制剂，如部分细胞和基因治疗产品、正电子发射层析显像产品(PET)等，现行的无菌检查法无法保证在产品使用前完成检查，不利于产品的快速放行，也不利于企业及早采取纠正措施[5]。对于无法终端灭菌的产品，也迫切需要补充快速的检查方法实现在线无菌检查。其次，现行的无菌检查法具有一定的主观性，对于不引起培养基浑浊的微生物污染，目测无法识别，可能产生假阴性判断，影响结果的准确性和可靠性。同时在整个检查过程中需检验人员逐日观察，操作繁琐，自动化程度低。鉴于上述问题，探索和创新药品无菌快速检测方法，弥补药典现行无菌检查法的不足，以缩短检验时间，提高检测灵敏度、准确度、自动化程度，已经成为国内外无菌制剂检验的研究热点。
随着微生物检测技术的快速发展，近年国内外开发的一些快速微生物检测方法作为无菌检查法的替代方法，已经被引入制药行业[6] [7]。与现行的无菌检查法相比，替代方法的优势在于自动化程度和灵敏度更高，重现性好，可有效缩短检测时间，从14 d的检验周期缩短到几天或几小时，部分技术还具有实时或近实时监控潜力[8]，可有效地弥补药典中无菌检查法的不足。检查结果的快速和实时获得，使得实验室从被动模式变为主动模式，不仅可以实现无菌制剂的快速放行，还可以进行在线过程控制，对无菌保障的有效性作出及时的评价。
目前微生物检验替代方法根据检验原理的不同可分为三大类[9]。第一类是检测微生物生长信号的方法，主要有呼吸信号法、ATP生物发光法[10]和微菌落荧光染色法等。第二类是直接测定微生物的方法，主要有流式细胞计数法[11]、固相细胞计数法等。第三类是微生物细胞中特定成分分析法，主要有脂肪酸谱分析法、质谱技术、核酸扩增分析技术[12]等。
其中呼吸信号法是常用的微生物替代方法之一。呼吸信号检测系统的原理是通过检测微生物生长代谢产生的二氧化碳或消耗的氧气，引起的培养系统内物理或化学变化信号，例如反应底物的显色、荧光变化信号或培养瓶顶空压力变化信号等，自动判读或结合目视观察，判定供试品中是否有微生物生长。该方法是美国药典通则“〈1071〉无菌短货架期产品的快速无菌检查法——基于风险的方法”收载的方法之一[13]，也是中国药典(2020版)第一增补本“9406细胞类制品微生物检查指导原则”(以下简称为9406)中的推荐方法[14]。
采用这类原理的代表性产品的有BacT/ALERT (BTA)系统和BACTEC系统等，目前国内外已有多位学者对这两种系统作为无菌产品微生物检验替代方法的可行性进行探讨[15]-[17]，其中BTA系统已经被FDA批准用于细胞治疗产品的无菌检查[18]。近年来国产微生物快速检测系统因其性价比具有明显优势，在市场上逐渐具有竞争力，它们最初是按照临床检验的要求而开发，目前已广泛应用于临床血液、无菌体液的病原学诊断等领域。但是国产微生物快速检测系统在制药领域的应用仍然有限，还需经过验证试验，证明其可替代药典方法，才能用于药品生产过程的质量控制和最终产品的放行。
本次研究在中国药典(2020版)四部“9201药品微生物检验替代方法验证指导原则”(以下简称为9201)、9406和案例报道[16] [17]的基础上，考察国产MICROTRACE微生物检测体系的BC120全自动血培养系统在定性微生物替代方法验证的关键参数上，与中国药典无菌检查法是否存在差异，为该方法应用于无菌产品的生产过程控制和产品放行提供参考。
2. 仪器与材料
2.1. 仪器
BC120全自动血培养系统(郑州安图)，生物安全柜(Thermo)，LRH-250F生化培养箱(上海一恒)。
2.2. 试验菌株
大肠埃希菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003、生孢梭菌CMCC(B)64941、藤黄微球菌CMCC(B)28001，以上均购于中国医学细菌菌种保藏管理中心。
酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes) GDMCC1.1.3591 (等同于ATCC12344)购于广东省微生物菌种保藏中心。
2.3. 样品
血栓通注射液(血1批号：210102、血2批号：220202)。
丙泊酚中/长链脂肪乳注射液(丙1批号：5C211012、丙2批号：5C210803)。
2.4. 培养基
培养基：硫乙醇酸盐液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基和血琼脂平板均购于广东环凯生物技术有限公司。
培养瓶：需氧培养瓶和厌氧培养瓶购于郑州安图生物工程股份有限公司。
3. 方法和结果
3.1. 方法学验证
验证替代方法在微生物检验中所具有的专属性、检测限等关键参数。
3.1.1. 方法
依据9201，定性检验的替代方法验证参数包括专属性、检测限、耐用性和重现性。其中专属性、检测限这两个参数相对更加重要，重现性和耐用性可从设备供应商处获得验证数据，目前本实验室仅按照中国药典的规定来限制设备运行条件，评估后认为在此情况下这两个参数对试验结果的影响较小，暂时不对其进行验证。
在不含样品的情况下，将1 ml菌悬液直接接种至相应的培养基或培养瓶中，进行专属性和检测限试验，每种菌的培养条件见表1。药典组逐日目测观察培养基是否浑浊，快速组由仪器实时监测并自动报告结果。
专属性试验：将各试验菌稀释成15~50 cfu/ml的菌悬液，每种菌3份平行。为了测试BC120培养体系的促生长能力，部分菌种同时采用需氧和厌氧两种条件进行培养。
检测限试验：将各试验菌稀释成<5 cfu/ml的菌悬液，每种菌10份平行。
Table 1. Culture conditions of test bacteria
表1. 试验菌的培养条件
| 菌种名称 |
需氧培养 |
厌氧培养 |
专属性试验是否同时进行需氧和厌氧培养 |
| 快速法(需氧瓶，40 ml/瓶，32.5℃)药典法(TSB，40 ml/瓶，32.5℃) |
快速法(厌氧瓶，40 ml/瓶，32.5℃)药典法(FTM，40 ml/瓶，22.5℃) |
| 大肠埃希菌 |
√ |
|
√ |
| 金黄色葡萄球菌 |
√ |
|
√ |
| 铜绿假单胞菌 |
√ |
|
√ |
| 枯草芽孢杆菌 |
√ |
|
|
| 白色念珠菌 |
√ |
|
|
| 黑曲霉 |
√ |
|
|
| 生孢梭菌 |
|
√ |
|
| 酿脓链球菌 |
√ |
|
√ |
| 藤黄微球菌 |
√ |
|
|
3.1.2. 结果
Figure 1. Specificity test results
图1. 专属性试验结果
根据专属性试验结果(见图1)可以看出，对于除铜绿假单胞菌以外的大多数试验菌而言，两个试验组的促生长能力基本相当。从平均报阳时间来看，除了厌氧条件下培养的铜绿假单胞菌、酿脓链球菌和金黄色葡萄球菌，其他试验菌的快速组平均报阳时间均短于药典组，尤其是需氧条件培养的黑曲霉和酿脓链球菌，平均报阳时间缩短一天。
值得注意的是快速组厌氧条件培养的铜绿假单胞菌3个平行样均未报阳。
检测限试验结果见表2，采用卡方检验(χ2)评估这两种方法的检测限，均无显著差异。
Table 2. Limit of detection results
表2. 检测限试验结果
| 平行 |
报阳性时间TOD (d) |
| 大肠埃希菌 |
金黄色葡萄球菌 |
铜绿假单胞菌 |
枯草芽孢杆菌 |
白色念珠菌 |
黑曲霉 |
生孢梭菌 |
酿脓链球菌 |
藤黄微球菌 |
| 药典组 |
快速组 |
药典组 |
快速组 |
药典组 |
快速组 |
药典组 |
快速组 |
药典组 |
快速组 |
药典组 |
快速组 |
药典组 |
快速组 |
药典组 |
快速组 |
药典组 |
快速组 |
| 1 |
1 |
0.56 |
1 |
1.07 |
2 |
0.76 |
1 |
0.64 |
2 |
3.23 |
3 |
3.06 |
1 |
0.96 |
3 |
1.32 |
2 |
1.56 |
| 2 |
1 |
0.58 |
1 |
1.02 |
2 |
0.77 |
1 |
0.64 |
2 |
3.77 |
3 |
2.72 |
1 |
0.96 |
3 |
1.28 |
2 |
1.42 |
| 3 |
1 |
0.56 |
1 |
1.04 |
2 |
0.77 |
1 |
0.62 |
2 |
3.56 |
3 |
2.76 |
1 |
1.02 |
3 |
1.24 |
2 |
1.36 |
| 4 |
1 |
0.61 |
2 |
1.10 |
2 |
0.83 |
1 |
0.67 |
2 |
3.10 |
4 |
3.85 |
1 |
1.05 |
3 |
1.24 |
2 |
1.30 |
| 5 |
1 |
0.60 |
2 |
1.05 |
2 |
0.83 |
1 |
0.66 |
2 |
2.76 |
4 |
2.30 |
1 |
1.15 |
3 |
1.24 |
2 |
1.35 |
| 6 |
1 |
0.55 |
2 |
1.12 |
2 |
0.90 |
1 |
0.63 |
2 |
4.69 |
4 |
2.81 |
1 |
0.96 |
3 |
1.19 |
2 |
1.36 |
| 7 |
1 |
0.55 |
2 |
1.11 |
2 |
0.84 |
1 |
0.64 |
4 |
3.02 |
4 |
2.93 |
1 |
0.96 |
3 |
1.22 |
2 |
1.36 |
| 8 |
1 |
0.55 |
2 |
1.15 |
2 |
0.83 |
1 |
0.64 |
4 |
- |
4 |
2.68 |
1 |
0.93 |
3 |
1.20 |
2 |
1.30 |
| 9 |
1 |
0.56 |
- |
1.17 |
3 |
- |
1 |
0.63 |
4 |
- |
4 |
3.18 |
1 |
1.00 |
4 |
0.97 |
2 |
1.30 |
| 10 |
- |
0.59 |
- |
- |
- |
- |
1 |
- |
- |
- |
- |
- |
1 |
- |
- |
1.21 |
- |
1.30 |
注：“-”表示培养至5天仍未报阳。
在进行方法学验证试验时，共平行设置34支阴性对照和空白对照培养瓶(其中需氧瓶阴性对照4支，空白对照20支；厌氧瓶阴性对照4支，空白对照6支)，系统均报告阴性，未发现假阳性情况。
3.2. 方法适用性试验
考察替代方法应用于2种无菌产品的适用性。
3.2.1. 方法
药典组：将试验样品按照无菌检查方法验证结果进行试验。快速组：用无菌注射器将样品直接接种至培养瓶中，混匀。将制备好的菌悬液平行接种至培养基或培养瓶中，接种量<100 cfu/瓶。
3.2.2. 结果
两种样品加标后分别采用两种方法检测的报阳时间见图2。从实验结果可以发现，两种方法均能检出所有试验菌，替代方法的平均报阳时间不慢于药典方法。在4个样品9种试验菌这36个对比项中，有29个对比项的替代方法平均报阳时间快于药典方法，占比约80.6%。
(a)
(b)
(c)
(d)
Figure 2. Test results of method applicability
图2. 方法适用性试验结果
4. 讨论
随着生物药、放射药等创新药物的发展，无菌检查法耗时长等问题逐渐成为制药行业关注的焦点，替代方法的出现能够满足企业对加速放行的需求，但在追求时效的同时更应该考虑药品的安全性。替代方法的检验质量和可靠性应该得到充分评估，证明其在各方法学参数上不劣于药典法，或者起码有明确的相关性。同时需要针对具体产品评价替代方法的适用性，最后结合风险评估结果，确定该替代方法是否可以应用于具体产品的生产过程控制和产品放行。
本次研究从专属性、检测限和方法适用性方面，对BC120全自动血培养系统作为药品微生物替代方法进行验证。研究涉及的试验菌，除了涵盖中国药典2020版四部通则1101无菌检查法中的6种标准菌株以外，还参考9406增加了大肠埃希菌、藤黄微球菌和酿脓链球菌。并且基于风险考虑，针对部分试验菌同时进行需氧和厌氧两种培养方式进行专属性研究。
本次研究选择的两种样品经过无菌检查方法验证，均为采用直接接种法进行检验的样品。其中血栓通注射液为澄清液体状的中药注射液，接种至培养基和培养瓶后液体呈清澈透明状态，可以目测得知液体是否浑浊。丙泊酚中/长链脂肪乳注射液为乳白色乳液状化学药注射液，接种至培养基和培养瓶后呈浑浊状态，无法目测液体是否浑浊。它们分别具有一定的代表性。
本次研究选择的试验菌中，除了铜绿假单胞菌以外，对于其他菌株这两种不同的培养体系其促生长能力基本相当，两种方法的检测限也无显著差异。进行专属性实验时发现快速组厌氧条件培养的铜绿假单胞菌和酿脓链球菌，它们的平均报阳时间慢于药典组，尤其是铜绿假单胞菌，3个平行样均未报阳，说明该系统的厌氧培养体系不利于专性需氧菌的生长，单独使用厌氧培养系统进行无菌检查时，结果存在假阴性风险。如采纳该方法作为替代方法用于指导生产和产品放行，需要严格按照系统使用说明，同时用厌氧和需氧培养系统进行检验。
此外，验证试验无法覆盖生产或检验工作中可能产生影响的所有菌种，所以不能简单地认为两种方法的培养体系，对除铜绿假单胞菌以外的其他微生物的促生长能力相当。因此除了药典规定的标准菌株以外，替代方法的拟使用单位应当根据环境监控结果、生产工艺特点和产品污染历史，选择更多的试验菌进行验证。
针对本研究所选的两种样品，替代方法的报阳时间不慢于药典方法，大多数情况下替代方法能更快地报告阳性，结果表明该替代方法可对特定注射剂品种进行快速无菌检查。根据文献可知，样品本身的特性对替代方法的影响很明显，替代方法并非适用于所有品种，即便样品规格满足检验量要求并且无抑菌性，也可能无法通过替代方法验证试验[16]，因此进行替代方法的可行性研究时，需要针对具体样品逐一验证。用几个品种的验证结果证明替代方法等同于药典方法是不科学的。
另外，验证试验采用的菌悬液浓度均低于100 cfu，低浓度菌悬液的计数从统计学角度来看存在很大的不确定性，因此需要足够多的重复次数才能满足统计分析的要求。所以即使验证结果显示两种方法的检测限无显著差异，在验证通过并采用替代方法后，替代方法的使用方仍需要在一段时期内同时使用药典方法，持续积累两种方法的等效性数据，完善验证结果。
BC120全自动血培养系统是国产的微生物快速检测系统，本项目收集了两种不同类型的无菌制剂，参照9201，评价对于单一品种无菌检查采用该系统替代药典无菌检查法的可行性，结果表明该方法可对特定注射剂品种进行快速无菌检查。中国药典在2010年版中首次在指导原则中收载了药品微生物检验替代方法验证的内容，鼓励在生产过程控制或产品放行时涉及的无菌检查、微生物限度检查和微生物鉴定等领域中尝试采用药典的替代方法。这些替代方法有望为保证微生物检验数据可靠性提供新思路，同时提高检测效率和自动化程度，以及通过即时监控改进过程控制方式，为提高药品质量做出贡献。
基金项目
广东省医学科学技术研究基金项目(项目编号：B2021335)。
NOTES
*通讯作者。