基于蛋白质组学的动脉粥样硬化研究进展

Advances in the Study of Atherosclerosis Based on Proteomics

摘要: 动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是心血管疾病最常见的危险因素之一，随着现代社会生产生活方式、饮食结构等因素的改变，其发病率显著增加，而AS的斑块也常引起冠心病、脑血管意外的风险增加。近年来关于AS分子机制的研究不少，但都偏向于局部某种信号通路或某种细胞的功能，都没有从整体水平上来研究其机制。蛋白质组学是从整体水平基础上，研究蛋白质结构、功能、相互作用，获得蛋白质水平上关于疾病发生发展、细胞代谢等整体而全面的认识。基于蛋白质组学角度研究AS的血液蛋白、组织蛋白、细胞外囊泡蛋白、斑块内蛋白等，能从整体水平认识AS的分子机制。现阐述基于蛋白质组学的AS研究进展。

Abstract: Atherosclerosis (AS) is one of the most common risk factors for cardiovascular disease. With changes in production and life style, diet structure and other factors in modern society, the incidence has increased significantly. AS plaques also often cause increased risk of coronary heart disease and cerebrovascular accidents. In recent years, there have been a lot of studies on the molecular mecha-nism of AS, but all of them tend to focus on some local signaling pathway or some cell function, but have not studied its mechanism from the overall level. Proteomics studies protein structure, function and interaction on the basis of the overall level, so as to obtain an overall and comprehensive understanding of disease development and cell metabolism at the protein level. The study of blood proteins, histones, extracellular vesicle proteins and plaque proteins of AS from the perspective of proteomics can understand the molecular mechanism of AS from the overall level. The progress of AS research based on proteomics is reviewed here.

1. 引言

心脑血管疾病是世界上威胁人类生命健康的第一杀手，其中动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)被认为是诱发各种心脑血管病的主要潜在病因，是心脑血管疾病病理变化的共同基础，是冠心病和脑梗死的根源[1] [2]。AS的发生发展病理生理过程主要涉及氧化应激炎症反应、血管内皮细胞功能障碍、脂肪质粒浸润、血小板聚集及黏附等多种因素。目前，随着生活方式的改变，动脉粥样硬化的风险因素已由低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein, LDL)胆固醇、血压和吸烟水平等转变成为新的风险因素，如睡眠不安、缺乏身体活动、空气污染、生活压力增强等，同时也促使动脉粥样硬化的相关理论发生了转变[3]。

组学是从整体水平上以全局视野对机体的生命活动规律进行研究，包括基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学等，是系统生物学的重要组成部分[4]。随着组学技术的进步，更多目光聚集到与新的风险因素相关的AS理论的研究中。其中基于蛋白质组学AS的研究，能在相关蛋白质基础上(如血浆蛋白、组织蛋白、细胞外囊泡蛋白、斑块内蛋白等)从蛋白质结构、功能、互助作用等方面获得AS整体而全面的认识。

2. 动脉粥样硬化机制及生物标志物研究

动脉粥样硬化是一种慢性的全身动脉血管炎症反应的疾病，其机制主要是脂质积聚和动脉炎症反应[5]。其具体病理过程是：首先在动脉血液湍流的分叉区域由某些血浆脂蛋白(包括LDL)和富含甘油三酯脂蛋白的残余物积累并随之脂质氧化产生促炎物质[6] [7]，导致白细胞募集和炎症；其次由氧化磷脂或氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein, OX-LDL)处理内皮细胞，诱导粘附分子和趋化因子的表达[8]，单核细胞(Monocyte, Mo)被募集到血管壁以响应内皮细胞表达粘附分子和趋化因子；再次上述细胞响应局部产生的细胞因子分化为巨噬细胞，病变的巨噬细胞(Macrophages, mø)通过清道夫受体或聚集脂蛋白发挥吞噬作用去吸收内膜脂蛋白，产生充满胆固醇的mø或“泡沫细胞”[9] [10]；最后是脂质和泡沫细胞连续积聚，其他白细胞(特别是T细胞)进入病变并与mø相互作用，随着时间的推移，泡沫细胞死亡，产生由细胞碎片和胆固醇组成的坏死核心[11]。此外，平滑肌细胞(smooth-muscle-cell, SMC)从收缩状态转变为增殖状态，并迁移到内皮细胞下方的区域，形成保护病变免于破裂的“纤维帽”；SMC还可以分化为巨噬细胞样细胞，产生泡沫细胞和骨样细胞，沉积钙磷矿物质，引起钙化[12] [13]。

既往大多研究一致认为动脉粥样硬化性心血管疾病的生物标志物和危险因素主要是髓过氧化物酶、血浆纤维蛋白原、心肌肌钙蛋白-I和C反应蛋白等，但其是否在动脉粥样硬化发生发展的全过程中一直升高以及在血栓形成中的机制，目前仍不能完全研究清晰[14]。最近的相关研究发现某些新的生物标志物与动脉粥样硬化有关：如生长分化因子15 (GDF-15)是一种细胞因子，参与细胞应激与炎症反应，其水平升高与心血管疾病死亡/心力衰竭、不良心血管事件的发生率的增加显著且独立相关[15]；如三甲胺-N-氧化物(TMAO)是动脉粥样硬化患者和心血管疾病患者的肠道菌群代谢产物，是一种新发现的心血管疾病的危险因子[16]；如D-二聚体和白细胞、CRP、纤维蛋白原等生物标志物能检测和监测主动脉和全身动脉的血管炎症，其中在急性主动脉综合征(Acute aortic syndrome, AAS)患者血清中D-二聚体更具有高度敏感性[17]；如中性粒细胞–淋巴细胞比值(NLR)能独立预测动脉粥样硬化事件，是残留炎症风险的潜在生物标志物[18]。在脂蛋白和冠状动脉钙化关系的研究中，血浆脂蛋白a (Lp(a))在高水平的炎症反应和高度凝血状态的冠状动脉钙化中表达，是冠状动脉钙化体积进展的潜在生物标志物[19]。在外泌体(如血液、唾液和脑脊液等)检测到的几种环状RNA (circRNA)受氧化应激调节，能介导活性氧(ROS)的产生，并促进ROS诱导的细胞死亡、细胞凋亡和炎症，是动脉粥样硬化性心血管疾病的生物标志物和新的治疗靶点[20]。此外阻断有些标志物对动脉粥样硬化可能具有治疗作用，如促性腺激素(卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH))可增加内皮集落形成细胞(ECFC)相关的血管生成，并可能参与心血管疾病中凝血酶的生成，可以作为动脉粥样硬化性心血管疾病新的生物标志物和新的治疗方法[21]。

然而上述针对动脉粥样硬化发病机制及生物标志物的研究，都忽略了疾病发生发展是一个多种因素参与和病理动态变化的过程。从整体基础水平上运用蛋白质组学探索动脉粥样硬化心血管疾病的发生发展病理生理变化过程才能为疾病机制的研究、早期的防治、药物治疗的新靶点提供好而新的思路与方法。

3. 蛋白质组学

3.1. 概念

蛋白质是生命的物质基础，构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者[22]。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，通过蛋白质的表达、翻译后修饰、蛋白与蛋白相互作用等方面的研究来获得关于疾病发生发展、细胞代谢等在蛋白质水平上全面整体的认识[23]。蛋白质组学根据研究的目的不同，可分为表达蛋白质、功能蛋白质和结构蛋白质组学三大分支。表达蛋白质组学主要是观察某种细胞或组织中蛋白质的整体表达，分析不同状态条件下蛋白质表达量的变化；功能蛋白质组学主要是通过分析蛋白间的相互作用、蛋白质的三维结构、蛋白质细胞定位以及翻译后修饰来研究蛋白质在细胞或组织中的生理功能[24] [25]；结构蛋白质组学主要是活性构象下研究单一蛋白质或蛋白复合体(如蛋白质–药物复合体)的三维构象(如二级、三级及四级结构)，目的是研究蛋白的三维结构与生物学功能之间的关系[26]。随着技术的进步发展，在病理生理机制关于血管炎症以及动脉粥样硬化的研究中，目前早已能够在蛋白质水平上运用高通量测量技术对数据进行收集并且加以分析[27]。

3.2. 蛋白质组学的优势

组学研究是从整体层面探讨生物系统的组成和活动模式，已成为疾病发生发展、细胞代谢过程研究的热点。基因组学主要研究基因的结构、功能或者遗传的变异，侧重解释疾病的倾向；转录组学主要研究细胞基因转录及转录调控规律；二者均无法研究出蛋白质降解后的信息，且需要核苷酸的特异性结合；而蛋白质组学能通过直接研究蛋白质解决此问题，还可反映蛋白互助和复杂而潜在的翻译及修饰，能准确地反映机体内生化和疾病发生发展的过程。

动脉粥样硬化形成机制及病理过程异常复杂，在血液、尿液、血管壁、斑块以及其他组织中均能检测到与病理生理途径相关的不同生化因子。从整体水平基础上利用蛋白质组学技术为研究动脉粥样硬化的病理生理机制提供新的理论与方法，探索与疾病高度相关的特异因子或蛋白为检测动脉粥样硬化相关疾病提供新的依据和生物标志物。这些生物标志物具有重要的理论意义和临床应用价值，可以为疾病的诊治提供新的线索。

4. 动脉粥样硬化的蛋白质组学研究

4.1. 动脉粥样硬化血液蛋白质组学研究

血清蛋白组是在收集血液时，通过离心分离产生的无细胞液中容纳的循环蛋白质组，理论上可以起源于任何器官或细胞，甚至可以穿过胎盘在母子之间交换，是最丰富的蛋白质，如白蛋白、载脂蛋白和补体系统成分等[28]。血浆蛋白质组可以帮助弥合基因组和疾病之间的距离[29]。Fernández-Ruiz [30]通过二维电泳分离蛋白质以研究AS患者血清蛋白成分的差异，通过基质辅助激光解吸电离方法使用肽质量图对蛋白质组分进行鉴定，结果显示AS中血红素结合蛋白、甲状腺素转运蛋白、视黄醇结合蛋白(Retinol binding protein, RBP) 4链A和补体系统蛋白(C9和C3部分)含量增加；激肽原，锌指蛋白133和B细胞CLL/淋巴瘤6成员B蛋白含量减少。蛋白质差异表达常常是通过蛋白质亚型引起，特别是甲状腺素转运蛋白引起的。功能相互作用的蛋白质是甲状腺素转运蛋白与RBP。RBP4浓度是与胰岛素抵抗和冠心病相关的心血管危险因素；因此，RBP4可作为代谢并发症和动脉粥样硬化的标志物，用于评估冠心病。此外，已知在冠状动脉粥样硬化患者中，RBP4水平升高与疾病严重程度相关。甲状腺素转运蛋白与RBP结合形成的复合物与内膜介质的厚度之间存在相关性，内膜介质可作为诊断颈动脉粥样硬化的指标之一。

泡沫细胞是吞噬大量脂肪的巨噬细胞，其形成是AS形成的早期事件。机制是巨噬细胞介导渗入血管内皮下的LDL胆固醇发生氧化修饰，形成OX-LDL胆固醇，并主要通过A型清道受体吞噬大量OX-LDL胆固醇，导致细胞内脂质堆积，形成泡沫细胞[31]。研究清楚巨噬细胞介导的泡沫细胞形成的分子机制可能成为减少泡沫细胞、改善AS新的潜在药物靶点。Finamore等人[32]利用巨噬细胞集落刺激因子刺激人外周血单核细胞，通过OX-LDL将得到的巨噬细胞转化为泡沫细胞。运用蛋白质组学技术，鉴定的差异表达蛋白(DEP)亚细胞定位分析结果显示，巨噬细胞/单核细胞的下调DEPs大多位于细胞核中，而泡沫细胞/巨噬细胞的上调DEPs大多位于细胞外或位于质膜中。运用串联质量标签(TMT)标记与质谱相结合的技术，还发现了泡沫细胞转化与蛋白质组谱之间的关联。DEP的功能分析表明，胆固醇代谢相关蛋白在泡沫细胞中上调，而免疫反应相关蛋白在泡沫细胞中下调。蛋白质相互作用网络显示，巨噬细胞与泡沫细胞相互作用得分最高的DEPs主要集中在溶酶体和内质网中，而位于其中的DEPs可能是泡沫细胞形成的关键驱动因素。

4.2. 动脉粥样硬化斑块组织蛋白质组学研究

斑块破裂或糜烂导致AS血栓形成是导致心血管疾病主要急性事件(如脑卒中、急性冠脉综合征和外周动脉闭塞)的基础病变。LDL是胆固醇在外周组织的主要载体，是AS和心血管疾病的公认主要危险因素。在传统的观念里，高密度脂蛋白(High-density lipoprotein, HDL)具有重要的血管保护作用，负责清除细胞中多余的胆固醇并将其转运到肝脏，同时其具有抗氧化、抗炎和抗血栓形成的作用。但是最近的研究表明HDL蛋白负荷在心血管疾病中将HDL从抗动脉粥样硬化转变为促动脉粥样硬化。Kopczak等人[33]在“软”“硬”(蛋白质丰度)两种不同类型斑块的动脉粥样硬化蛋白质组学的研究中发现：HDL有37种蛋白质在“硬”组中下调，1种上调，而在“软”组中发现6种蛋白质下调，59种蛋白质上调；LDL在“硬”组中显示8个下调和1个上调蛋白，而有4个和5个蛋白质分别在“软”斑块中表达不足和过度表达；“硬斑块”显示出与急性期反应和炎症相关的生物学过程(ORM2、DCD、CD59和A2M)；“软斑块”显示出与脂质代谢过程、运输、定位和稳态(LRP2、APOH、APOC2、APOC4和APOF)相关的生物学过程。

颈动脉斑块内出血(intraplaque hemorrhage, IPH)是AS易损斑块急性损伤引起缺血性脑血管意外事件的主要原因[34]。其机制可能是红细胞从缺乏SMC和内皮间隙链接的新血管泄露，被分解成铁、胆固醇等，进而胆固醇沉积的红细胞脂膜促进了坏死核心区域扩张，血红蛋白与释放的铁促进了氧化应激反应，促炎和促氧化增强了IPH [35]。相关研究表明：目前没有针对IPH的有效防治措施。鉴此，运用蛋白质组学技术检测斑块，寻找与其发生机制相关的生物标志物或药物新靶点至关重要。Stakhneva等人[36]研究人类颈动脉粥样硬化斑块蛋白质组学的结果显示：糖蛋白抗原蛋白CD5、S100A12在不稳定的斑块中上调，主要参与炎症反应；蛋白肌酸激酶B，能够发挥止血作用；CEMIP可以调节AS中血管SMC的增殖与迁移。

Mallia等人[37]对15名患者获得的来自不同发展阶段的冠状动脉粥样硬化斑块进行蛋白质组学的研究发现：在脂质化和纤维化阶段，稳定动脉粥样硬化斑块中的波形蛋白(vimentin)、原肌球蛋白β链、肌动蛋白、角蛋白、微管蛋白β链、微纤维相关糖蛋白4、血清淀粉样蛋白P组分和膜联蛋白5等蛋白量增加；在纤维化和钙化阶段的斑块中，mimecan和纤维蛋白原的量增加；在坏死性营养不良型不稳定动脉粥样硬化斑块中，人血清白蛋白、mimecan、纤维蛋白原、血清淀粉样蛋白P组分和膜联蛋白的量增加。然而，冠状动脉粥样硬化性疾病(稳定或不稳定)斑块鉴定出的蛋白与颈动脉斑块中的不一致，可能提示IPH与冠状动脉粥样硬化性疾病是两个不同的病理生理过程。

4.3. 动脉粥样硬化细胞外囊泡(EVs)蛋白质组学研究

细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)是一种由细胞受到炎症、缺氧、应激、衰老、死亡等刺激下分泌或者生理状态下分泌释放到细胞外基质的脂质结合膜性的小囊泡；其参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生等过程，广泛地存在于各种体液和细胞上清液中，并稳定携带了一些重要的分子，其中主要是脂质介质、核酸、蛋白质[38]。EV按其生物起源、cargo、生化组成和释放途径，它们可以分为三大类：外泌体、微囊泡(MV)和凋亡体。外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合而释放的膜性小泡，细胞间和器官内通信系统的重要组成部分，能够将生物信号从一种细胞或组织传递到另一种细胞或组织[39]。EV已经被证明是一个用于疾病诊断的很有价值的生物标志物[40]，也被认为是各种不同疾病的生物治疗药物[41]。研究表明：巨噬细胞衍生的EVs在血管钙化(VC)过程中通过炎症和氧化应激等促进血管平滑肌细胞(VSMC)钙化。Yaker L等人[41]运用脂多糖(LPS-EK)处理巨噬细胞产生的EV在蛋白质组学的研究中显示：其EV中促炎细胞因子和CAD、PAI-1和Saa3蛋白，这三种分子涉及炎症、氧化应激和VC；在钙化条件下，这些EV通过增加成骨标志物和降低收缩标志物表达来显著增加VSMC的钙化。

5. 总结与展望

动脉粥样硬化性血栓形成导致的心脑血管疾病急性事件(如脑卒中、急性冠脉综合征和外周动脉闭塞)具有病情比较严重、死亡风险高、预后差、致残率高的特点。基于系统生物学组学技术的出现和发展，为筛选AS的药物新靶点与新的生物标志物提供了全面而崭新的信息。基于蛋白质组学的AS机制研究已经取得了飞速的发展，但由于生物物种的多样性、基因和蛋白的复杂性，AS的研究还是有所不足。利用多组学技术，结合高通量测序、先进的计算机数据分析技术、公共的数据资源库，进行多维度、多层次整体而全面的分析与挖掘，能进一步揭示复杂的生物学过程和动脉粥样硬化或其他疾病发生发展的全过程。

NOTES

^*通讯作者。