摘要: 目的：通过网络药理学及分子对接技术探讨三仁汤主要成分对甲流的作用机制。方法：通过TCMSP及HERB数据库获取三仁汤主要成分中单味药的化学成分，通过PubChem数据库得到规范化学成分名称和PubChemCID (以下简称CID)，经SwissADME数据库，筛选得到活性成分后再利用Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测；以“InfluenzaA”为关键词，通过GeneCards、DisGeNET数据库获取与甲流相关的疾病靶点；Venny2.1.0获取三仁汤组分靶点与甲流的共有靶点；运用Cytoscape3.9.1软件构建“三仁汤–化学成分–作用靶点”网络图，并根据网络图中的degree值，筛选出三仁汤治疗甲流的核心活性成分；通过STRING数据库及Cytoscape3.9.1软件以构建交集靶点的蛋白相互作用(PPI)网络图，并筛选核心靶点；基于DAVID数据库对交集靶点的基因进行GO与KEGG富集分析，预测三仁汤治疗甲流的潜在作用通路，最后利用分子对接技术，对有效成分和对应靶点的组合能力进行验证。结果：筛选出三仁汤化学成分20个，化学成分靶点与甲流疾病共同靶点97个。“三仁汤–化学成分–共有靶点–甲流”网络图筛选核心化合物5个，分别为槲皮素、山柰酚、木犀草素、葛根素、7-甲氧基-2甲基异黄酮。PPI网络分析和KEGG富集分析发现，三仁汤可通过作用于信信号通路等核心靶点发挥治疗甲流的作用。分子对接验证其主要成分和关键靶点的相互作用，其中10,11-Dimethoxynareline与核心靶点RAF1、PRKCQ、PIK3CG的对接亲和度较高。结论：网络药理学及分子对接技术联合揭示三仁汤可以通过多靶点、多成分、多途径治疗甲流，为进一步研究及临床应用提供新思路与理论依据。
Abstract: Objective: To explore the mechanism of the main components of Sanren Decoction on methylation through network pharmacology and molecular docking. Method: Drug components and targets are screened through TCMSP and HERB databases, and disease targets are obtained with the help of GeneCards and DisGeNET databases. The “drug-active ingredients-target” network diagram is built with Cytoscape 3.9.1 software, and the genes of intersection targets are analyzed with GO and KEGG based on the DAVID database, and molecular binding energy is calculated with the help of Autodock operation. Results: 20 chemical components of Sanren decoction were screened, and 97 common targets of chemical composition targets and strients of strilearly. “Sanren decoction - chemical composition - total target - methyl flow” network diagram screen screening 5 core compounds, namely Quercetin, Kaempferol, Luteolin, Puerarin, 7-methoxy-2 methyl isoflavones. PPI network topology analysis and KEGG pathway enrichment analysis found that Sanren decoction can play a role in treating thyroid flow by acting on core targets such as signaling pathways. Molecular docking verifies the interaction between its main components and key targets, of which 10,11-Dimethoxynareline has a high docking affinity with the core targets RAF1, PRKCQ and PIK3CG. Conclusion: Network pharmacology combined with molecular docking technology reveals that Sanren Decoction can treat strients, targets and multiple pathways, providing new ideas and theoretical basis for further in-depth research and clinical application.
1. 引言
甲型流行性感冒InfluenzaA，简称甲流；是一种由甲型流感病毒(IAV)引起的、具有极强传染性的急性呼吸道疾病，每年都会在全球范围内引发季节性流行，给人类巨大的威胁。[1]，目前西医学对甲流的治疗主要是通过运用磷酸奥司他韦胶囊，但是其在临床作用仍存在局限，近年来中医药治疗甲流，成为当前研究的热点问题[2]，与抗病毒药物不同，中药在抗甲流时作用不受发病时间的影响[3]。中医治疗甲流兼有外邪和整体，认为流行性感冒的特点是季节性和区域性，将其称作时行感冒，与中医“风温”“湿温”“疫疠”“时气”“疫气”近似，属于“温病学”范畴[4]。三仁汤是适用于湿温初起的代表方，用于卫气同病。在时行疫病防治过程中也发挥了中医药治疗疫病的优势[5]，叶天士提出“肺位最高，邪必先伤”，指出湿热邪气，或外感或内伤，皆可伤肺。因其湿热特性而治之方以“三仁汤”为组方代表三焦同治，使邪气上下分消，肺气得以宣肃。因此，可将“三仁汤”作为相关呼吸系统疾病的基础治疗方剂[6]。但其作用机理还需进一步明确，本研究采用网络药理学和分子对接技术，筛选三仁汤中的活性化合物及靶点，对其抗甲流作用机理进行分析，为其深入开展研究提供理论支撑。
1.1. 筛选三仁汤的化学成分
通过对HERB数据库进行检索，利用PubChem数据库校准化学成分名称并记录PubChemCID (以下简称CID)，同时下载每个化学成分2D结构的sdf文件，输入SwissADME数据库，预测三仁汤各化学成分的类药性和口服生物利用度。其中类药性预测基于lipinski原则，即认为符合相对分子质量(molecularweight, MW) ≤ 500，脂水分配系数(moriguchilogP, MlogP) ≤ 4.15，氢键给体数目(H-bonddonors, HBD) ≤ 5，氢键受体数目(H-bondacceptors, HBA) ≤ 10中的3项及以上的小分子化合物具有类药性[7]。口服生物利用度预测基于veberfilter，该预测系统认为可旋转键的数量(rotatablebonds, RoB) ≤ 10且拓扑极性面区(topologicalpolarsurfacearea, TPSA) ≤ 140Å2的化合物具有较好的口服生物利用度[8]。本研究将同时满足lipinski原则和veberfilter的化合物作为三仁汤主要的活性成分，纳入下一步研究。
1.2. 三仁汤主要活性成分靶点预测
将1.1中筛选的sdf文件录入SwissTargetPrediction数据库以进行预测，并将物种限定为“Homosapiens”，然后设置Probability > 0进行靶点筛选。
1.3. 甲流有关基因获取
将关键词“InfluenzaA”录入GeneCards数据库和DISGENT数据库以收集甲流相关的疾病靶点，将GeneCards中靶点相关性score值 < 0.7之下的数值筛除，并去除重复靶点。
1.4. 三仁汤主要成分与甲流的活性成分–疾病靶点网络的建立
将三仁汤主要成分与甲流的相关靶点分别输入Venny数据库绘制韦恩图，以取得两者交集靶点。并应用Cytoscape3.9.1软件进行处理，建立三仁汤主要成分与甲流的活性成分–疾病靶点网络，并计算每个节点的度值，通过节点大小以表示节点度值的大小。
1.5. 交集基因(蛋白)PPI网络的构建
将Venny图保存时的交集基因录入STRING11.0数据库，选择物种为人类，组合打分combinedscore > 0.9，隐藏游离靶点并构建PPI模型，最终其网络由68个节点以及197条边组成，两个节点之间的边越多，则两节点间的关联程度越高。将PPI模型中的tsv文件导入Cytoscape3.9.1软件进行拓扑属性分析，并运用cytonca功能进行网络拓扑学分析。
1.6. GO功能和KEGG富集分析
分别在分子功能(MF)、细胞组件(CC)和生物学过程(BP)对预测靶点的基因及其产物进行功能定义分析，利用微生信平台对三仁汤主要成分和IVA的共同靶点进行GO功能和KEGG富集分析，并将目标对象限制为人类。
1.7. 成分–靶点分子对接
计算“活性成分–靶点”网络图中活性成分的度值，将degree > 15的活性成分与查阅文献后保留3个密切度高的核心蛋白进行分子对接，再将PDB数据库取得关键靶点的3D结构，导入PyMOL和AutoDockTools1.5.7软件进行去配体及水分子等处理后作为对接受体。PubChem数据库下载关键活性成分的3D结构，再对其做加氢、加电荷等操作。设置Gridbox参数以确定对接范围，采用AutoDockVina对三仁汤主要方活性成分与甲流靶点进行分子对接。
2. 结果
2.1. 三仁汤主要活性成分获得
运用TCMSP数据库以及HERB数据库筛选出三仁汤核心成分的活性成分，纳入下一步研究，经Swiss Target Prediction数据库预测，限定物种为“Homosapiens”，并根据Probability > 0.1进行靶点筛选，整合2个数据库删除无靶点成分后，共获得三仁汤主要活性活性成分32个，对应靶点751个，其主要成分结果见表1。
Table 1. The main ingredients of Sanren soup
表1. 三仁汤主要成分
|
pubchem ID |
化合物 |
相对分子质量 |
Rob |
HBA |
HBD |
MlogP |
TPSA / |
| 白豆蔻 |
128558 |
Yuanhunine |
355.4 |
3 |
5 |
1 |
2.2 |
51.16 |
| 白豆蔻 |
128736 |
Dehydrobaimuxinol |
236.35 |
1 |
2 |
1 |
2.74 |
29.46 |
| 白豆蔻 |
190797 |
Wilforonide |
220.26 |
0 |
3 |
0 |
1.95 |
43.37 |
| 白豆蔻 |
3050416 |
Galanal A |
318.4 |
2 |
3 |
1 |
2.85 |
54.37 |
| 白豆蔻 |
5320013 |
10(14)-Guaien-4-ol |
222.37 |
1 |
1 |
1 |
3.67 |
20.23 |
| 白豆蔻 |
6477028 |
6-Hydroxy-3-(1-hydroxy-1-methylethyl)-6,10,12a-trimethyl-1,2,3,3a,4,5,6,9,10,12a-decahydrocyclopenta[a]cycloundecen-4-yl acetate |
364.5 |
3 |
4 |
2 |
3.67 |
66.76 |
| 白豆蔻 |
6602484 |
Granatan-3-one |
153.22 |
0 |
2 |
0 |
1.07 |
20.31 |
| 白豆蔻 |
10399059 |
10,11-Epidioxycalamene |
232.32 |
0 |
2 |
0 |
3.35 |
18.46 |
| 白豆蔻 |
20831623 |
(+)-beta-
Caryophyllene |
204.35 |
0 |
0 |
0 |
4.63 |
0 |
| 白豆蔻 |
1.02E+08 |
10,11-
Dimethoxynareline |
412.4 |
4 |
8 |
1 |
1.78 |
89.82 |
| 白豆蔻 |
1.32E+08 |
10-Acetoxy-8-
heptadecene-4,
6-diyn-3-ol |
304.4 |
10 |
3 |
1 |
3.73 |
46.53 |
| 杏仁 |
5870 |
Estrone |
270.37 |
0 |
2 |
1 |
3.44 |
37.3 |
| 杏仁 |
222284 |
Sitosterol |
414.71 |
6 |
1 |
1 |
6.73 |
20.23 |
| 杏仁 |
5280794 |
Stigmasterol |
412.69 |
5 |
1 |
1 |
6.62 |
20.23 |
| 杏仁 |
64971 |
CLR |
386.65 |
5 |
1 |
1 |
6.34 |
20.23 |
| 杏仁 |
9064 |
Mairin |
290.27 |
1 |
6 |
5 |
0.24 |
110.38 |
| 杏仁 |
5320083 |
(+)-catechin |
366.36 |
3 |
6 |
2 |
2.55 |
93.04 |
| 杏仁 |
5281331 |
Glycyrol |
412.69 |
5 |
1 |
1 |
6.62 |
20.23 |
| 杏仁 |
5318999 |
Licochalcone B |
286.28 |
4 |
5 |
3 |
1.27 |
86.99 |
| 杏仁 |
124052 |
Glabridin |
324.37 |
1 |
4 |
2 |
2.73 |
58.92 |
| 杏仁 |
44257530 |
Phaseol |
336.34 |
2 |
5 |
2 |
2.88 |
83.81 |
续表
| 杏仁 |
281691 |
Machiline |
285.34 |
3 |
4 |
3 |
1.84 |
61.72 |
| 杏仁 |
6917970 |
l-SPD |
327.37 |
2 |
5 |
2 |
1.75 |
62.16 |
| 薏苡仁 |
9548595 |
Sitosterol alpha1 |
426.72 |
5 |
1 |
1 |
6.82 |
20.23 |
| 薏苡仁 |
222284 |
Sitosterol |
414.71 |
6 |
1 |
1 |
6.73 |
20.23 |
| 薏苡仁 |
5280794 |
Stigmasterol |
412.69 |
5 |
1 |
1 |
6.62 |
20.23 |
| 薏苡仁 |
273686 |
CLR |
386.65 |
5 |
1 |
1 |
6.34 |
20.23 |
2.2. 甲流–三仁汤的靶点整合
检索甲流相关靶点，其中GeneCards数据库得到514个，DISGENT数据库得到1913个，通过与筛选得到的2156个甲流对应靶点，借用HERB对与三仁汤主要活性成分靶点做出预测共获得362个靶点，将两者取交集，共获得97个共同靶点，其韦恩图见图1。
Figure 1. Drugs-disease intersection target Wayne diagram
图1. 药物-疾病交点靶点韦恩图
2.3. “中药–活性成分–靶点网络图”的分析
将实验中97个共有靶点通过cytoscape3.9.1构建的“中药–活性成分–靶点”，网络图包含397个节点，783条边。通过内置数据分析功能计算出每个节点的度值大小，通过网络分析得到三仁汤核心成分之中排名前五的活性成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素、葛根素、7-甲氧基-2甲基异黄酮，分别与139、53、52、50、34个蛋白靶点发生作用详见图2。
Figure 2. Traditional Chinese medicine - active ingredient - target network diagram
图2. 中药–活性成分–靶点网络图
2.4. PPI网络分析
初始PPI网络由131个节点及1524条边组成，见图3，经过CytoNCA插件进行分析后得到由19个节点与132条边组成的简化网络，最终经MCODE插件分析得到由9个节点与26条边组成的核心靶点，见图4。
Figure 3. PPI network analysis
图3. PPI网络分析
Figure 4. Core target screening process
图4. 核心靶点筛选流程
2.5. GO功能和KEGG富集分析结果
经于微生信平台进行GO功能及KEGG分类富集分析，生物过程得到的555个条目；细胞组成涵盖了78个条目；分子功能得到139个条目，选取前二十条绘制气泡图，从图5(A)~(C)可以得到的主要GO进程，并运用DAVID及微生信平台对靶点进行KEGG通路富集分析，共获得校正后P < 0.05的121条通路，取前二十条结果进行可视化，富集通路包括PD-1，HF-1等信号通路等，结果见图5。
(a)
(b)
(c)
(d)
Figure 5. The enrichment process. (a): CC; (b): BP; (c): MF; (d): KEGG
图5. 富集进程。(A): CC；(B): BP；(C): MF；(D): KEGG
2.6. 分子对接验证
该靶点团包括TYK2、TLR9、RAF1、PRKCQ、PIK3CG、PIK3CD、PIK3CB、CCR5、BRAF，选取经Cytoscape分析后得到三仁汤主要成分的有效成分及网络拓扑度 > 20的关键化合物进行对接，结果见图，一般认为结合能 < 0时配体可与受体结合，本研究以结合能(affinity) < −5 kcal∙mol时认为配体与受体具有较好的结合活性，且能量越低则结合越稳定。结果显示三仁汤的18个关键活性成分与相应靶蛋白结合较好。在结合活性最好的前3对配体与受体中，CID1.02E+08与PRKCQ的结合活性最好，化学成分配体均结合在靶蛋白的活性口袋内且匹配良好，各hub靶蛋白对接结果最佳的分子对接模拟图见图6。
Figure 6. Molecular docking results
图6. 分子对接结果
以上研究结果表明三仁汤治疗甲流的hub靶蛋白是RAF1、PRKCQ、PIK3CG，通过反向分子筛选得到三仁汤治疗甲流的15个活性成分，分别与RAF1 (PDBID:4RA5)、PRKCQ (PDBID:4WWP)、PIK3CG：(PDBID:6VJJ)进行分子对接，验证结果显示主要活性成分10,11-Dimethoxynareline可与多个相关靶点成功对接，基本信息如表2所示。
Table 2. Docking results
表2. 对接结果
| 活性成分 |
基因靶点 |
PODID |
结合能量/(kcal∙mol−1) |
| 10,11-Dimethoxynareline |
RAF1 |
4RA5 |
−5.37 |
| 10,11-Dimethoxynareline |
PRKCQ |
4WWP |
−8.65 |
| 10,11-Dimethoxynareline |
PIK3CG |
6VJJ |
−5.44 |
3. 讨论
甲流(Influenza)中医学范畴中属于“疫”病，疫毒为本病的始动因素。国医大师晁恩祥以疫毒侵于肺卫，以营卫失调、正气不足为核心病机，甲流患者治以透邪、清热、化湿，并注意通腑泄肺，使肺中的邪毒有出路[9]。吴瑭《温病条辨》中记载三仁汤中杏仁苦辛，轻开肺气以宣上；白蔻仁芳香化湿以畅中；薏苡仁渗湿健脾以渗下，三焦并调使得肺气得宣，中焦得运，下焦邪出，使气畅湿行复脾胃通畅[10]。为了深入研究三仁汤治疗甲流的作用机制，本文章采用网络药理学筛选出三仁汤治疗甲流潜在的32个主要活性成分和751个靶点，涵盖有新甘草酚(Glycyrol)、白桦脂酸(Mairin)、豆甾醇(sitosterol)、光甘草定(Glabridin)等活性成分对应靶点较多，是作用于甲流的主要活性成分。感染甲流时大量炎症细胞浸润在肺泡间质及肺泡中，触发“细胞因子风暴”释放出多种炎症细胞因子，造成肺水肿、肺泡渗出增多甚至肺组织损伤等[11]，本研究发现作用于关键靶点的活性成分中白桦脂酸、槲皮素和豆甾醇均有抗炎活性。杏仁与薏苡仁两味中药共有豆甾醇的有效成分。白桦脂酸为杏仁的有效成分，白桦脂酸有着显著的抗炎作用，其抗炎的原因是它能与糖皮质激素受体作用，同时还能促进合成内源性的抗炎蛋白[12]。光甘草定也可以通过抑制ERK信号通路来抑制炎症作用，抑制p-ERK蛋白的表达，进而使下游炎症因子TNF-α和IL-18的减低，并通过抑制p38-MAPK和ERK信号通路、抗氧化和减轻炎症反应来减少肺部损伤[13]。豆甾醇能抑制炎症模型中炎症因子IL-1β和TNF-α的水平，并且提升抗炎因子IL-10的水平，这表明豆甾醇具有抗炎作用[14]，豆甾醇可能通过调节雌激素信号通路上MAPK3和PRKACA两个核心靶点的表达，调控细胞因子水平，从而发挥抗炎作用[15]。基于PPI网络分析发现三仁汤通过TLR9、RAF1、PRKCQ、PIK3CG、PIK3CD、PIK3CB、CCR5、BRAF等核心靶点来发挥作用。TLR9 (Toll样受体9)在人体天然免疫和适应性免疫活化中发挥关键作用，IVA感染可诱导IFN-Ⅰ介导的免疫信号，抑制中性粒细胞募集及IL-17的免疫反应能力导致菌感性增加[16]，IVA感染可增加人单核细胞和DC中TLR9的表达水平，而实验中TLR9缺失小鼠更易感染隐球菌，且IFN-γ和IL-17的生成减少，致使其感染后的肺损伤加重，病死率增高，证明TLR9可在抵御甲流继发相关细菌感染的过程中发挥作用[17]，PIK3CD是异常磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase, PI3K)之一，参与免疫调节、气道炎症等，与肺部疾病的发生、发展密切相关[18]，相关研究证实PI3K能通过调节病毒非结构蛋白-1 (A/NS1)的表达参与IVA感染后的病理变化[19]。KEGG通路富集结果包含PD-1，HF-1信号通路等，实验证明PD-L1缺陷小鼠对IAV感染的敏感性降低[20]，相关研究表明(程序性细胞死亡蛋白1/程序性细胞死亡配体1) (PD-1/PD-L1)通路可以调节甲流病毒(IAV)感染后的抗病毒反应[21]。HF-1通路在流感病毒的刺激后诱导不同的下游效应，例如改变宿主细胞代谢，促进炎症和促进病毒复制[22]。相关研究表明IVA感染后激活的HIF-1可能会重新编程宿主细胞葡萄糖代谢以增强糖酵解以影响病毒复制。另一方面HIF-1通路可以调节宿主先天性和适应性免疫反应从而促进病毒清除[23]。然而其具体作用仍有待进一步实验验证。
分子对接的结果提示三仁汤中的主要核心化合物与核心靶点有良好结合活性。这表明，三仁汤主要活性成分10,11-Dimethoxynareline可以作用于RAF1、PRKCQ、PIK3CG靶点，从而干预IVA的病理进程。
综上，本研究选择了网络药理及分子对接技术，对三仁汤主要治疗的有效成分、作用目标、信号路径等进行了分析。结果提示该方可以作用于RAF1、PRKCQ、PIK3CG等靶点，并干预PD-1、HF-1等信号通路，发挥抗病毒、抗病毒诱导的炎症、减轻肺损伤，以起到治疗甲型流感的作用。目前，国家有关部门正在积极组织开展有关中医药治疗甲型流感的相关研究，本次研究具体作用机制还需要通过体内、体外实验进一步明确，以期为甲型流感的中医药治疗提供新的相关依据。