1. 引言
根据Plastics Europe (2023)发布的统计数据显示，2022年全世界范围内塑料的总产量约为400.3 Mt，其中聚乙烯(polyethylene, PE)的生产占总产量的14.1%，而中国生产的塑料产品占总量的32%。由于我国是生产和消费塑料产品的主要国家之一，塑料垃圾对我国环境的污染造成巨大的威胁。目前，全球对于塑料垃圾的处理仍采用原始的方法，如：填埋、焚烧、堆肥等，这些原始的处理方式易产生大量有毒有害物质，对人体及生物体生产造成危害[1]-[5]。塑料的生物降解方法是指在一定时间范围内，塑料在生物(如细菌、真菌和藻类等)的作用下被逐渐分解为对环境无害的生物质、CO2、CH4和水的过程[6]-[9]，生物降解方法具有安全、清洁、高效、环境友好等特点，能够用于大量降解塑料[9]。因此，微生物降解作为一种安全、环保的塑料垃圾处理方式，受到人们关注。
国内外对于塑料降解菌的研究主要集中在对降解菌的筛选、表征及降解机理等方面。对于塑料降解菌的筛选，通常采用以塑料为唯一碳源的选择培养基，在适宜的条件下进行富集培养后，从中筛选出塑料降解菌株[10]-[14]。目前已经发现具有塑料能力的微生物主要有：青霉菌(Penicillium)、芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)等[15]-[19]。对微生物降解塑料的特性研究，主要采用失重法、傅立叶红外光谱法(FTIR)、扫描电镜法(SEM)等方法测定菌株的塑料降解率[17]-[20]。目前已报道的菌株，塑料降解效率在0.75%~58.19% [2] [3] [21]，且降解时间较长，一般在60 d以上[3]。对于微生物降解塑料的机理，一般认为与微生物的酶促反应密切相关，微生物分泌的某些酶可以催化各种反应，促使塑料完成降解[21]-[26]，目前已有研究报道，脂肪酶、酯酶、漆酶、脲酶、过氧化氢酶等与塑料降解有关[15] [23] [27]。
当前，高效降解菌的选育及降解酶的分离纯化仍是塑料生物降解的主要研究方向[6]。为寻找具有塑料降解功能的微生物，本研究以聚乙烯塑料为唯一碳源，从含半降解塑料的土壤中筛选塑料降解菌，通过失重法测定塑料降解菌的降解效率，并采用核酸分类学鉴定筛选出的塑料降解菌，为塑料的微生物降解研究提供有价值的参考。
2. 实验材料与方法
2.1. 实验材料
聚乙烯塑料薄膜：购于鸿达包装材料有限公司，厚度为0.004 mm。
PE粉：购于恒发塑化，物理性状为白色球形，粒径范围为0.075 mm~0.106 mm，平均分子量为5000，密度为0.94 g/mL。
半降解带土塑料：采于吉林市江南东山和北华大学垃圾回收站。
2.2. 试剂与培养基
无机盐溶液培养基：硝酸铵2.0 g，七水硫酸镁0.1 g，磷酸氢二钾1.5 g，磷酸二氢钾3.0 g，无水氯化钙0.01 g，二水乙二胺四乙酸二钠0.01 g，pH调至7.5，加水至1 L，121℃灭菌20 min。
LB琼脂糖固体培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，琼脂粉17 g，蒸馏水1 L，pH：7.4~7.6，121℃灭菌20 min。
LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 L，pH：7.2~7.6，121℃灭菌20 min。
2.3. 实验方法
2.3.1. 塑料的处理
将PE粉置于紫外灯下辐照灭菌2 h后备用。
准确称取0.8~1.0 g聚乙烯塑料薄膜，剪成约10 × 3 cm长条，用无菌水清洗后于75%酒精中浸泡1 h，再置于紫外灯下，辐照处理1 h后，留存备用。
2.3.2. 菌悬液的制备
取采自吉林市江南东山和北华大学东校区废品站的带土塑料约10 g，加入250 mL无机盐溶液培养基中，于25℃，180 rmp条件下摇床振荡30 min，室温静置沉降10 min，得菌悬液。
2.3.3. 塑料降解菌的筛选与驯化
1) 塑料降解菌的富集
无菌条件下，准确称取0.16 g聚乙烯颗粒加入盛有80 mL无机盐溶液培养基中，加入1 mL菌悬液，于25℃，180 rmp条件下摇床振荡培养7 d。
2) 塑料降解菌的筛选
① 塑料降解菌的初步筛选
将塑料降解菌富集液稀释100倍后，各取50 uL、100 uL、150 uL稀释液涂布于LB琼脂培养基上，25℃倒置培养2 d。挑取单菌落加入4 mL含聚乙烯颗粒的无机盐溶液培养基中，25℃，180 rmp摇床培养7 d。筛选出有明显生长迹象的菌株，在LB固体培养基上划线分离。
② 塑料降解菌的复筛
挑取塑料降解菌的单菌落，加入含5% LB (V/V)的无机盐溶液液体培养基中，25℃，180 rmp条件下振荡培养1 d。取1.6 mL菌液，加入80 mL含0.2%聚乙烯颗粒(W/V)的无机盐溶液培养基中，25℃，180 rmp条件下振荡培养7 d。取1.6 mL培养的菌液于80 mL上述聚乙烯–无机盐液体培养基中进行继代培养，重复10次。从中筛选出具有明显浑浊现象的菌株。
3) 塑料降解率测定
① 精密称取0.8~1.0 g灭菌处理的聚乙烯薄膜，放入80 mL含5% LB (V/V)的无机盐溶液培养基中，按1% (V/V)比例加入复筛出塑料降解菌的菌液，25℃，120 rmp条件下振荡培养7 d。
② 转接实验：将培养液中聚乙烯塑料条转入80 mL含5% LB (V/V)的无机盐溶液培养基中，并按1% (V/V)比例加入相应菌株的培养液，25℃，120 rmp条件下振荡培养14 d。
③ 重复该过程16次。
④ 塑料降解率的测定：最后一次转接实验后，取出各菌株降解的聚乙烯塑料，用洗涤剂浸泡3 min后进行清洗，60℃烘干至恒重，称量并记录其准确质量，按以下公式计算各菌株的塑料降解率，并从中筛选出降解率较高的菌株。
塑料降解率 = (m0 − m1) ÷ m0 × 100%
m0：降解前的聚乙烯塑料质量
m1：降解后的聚乙烯塑料质量
2.3.4. 塑料降解菌的核酸分类学鉴定
1) 塑料降解菌的纯化
取各塑料降解菌的菌液，于LB琼脂培养基上划线分离，37℃倒置培养1 d后，挑取单菌落重复划线分离三次。挑取生长良好的单菌落，加入700 uL LB液体培养基中，于25℃，160 rmp条件下振荡培养8 h。吸取100 uL菌液按照1:1比例加入50%甘油，混匀后−80℃冰箱保存菌种。
2) 塑料降解菌的DNA提取
取各塑料降解菌的菌液200 uL，12,000 rmp，离心1 min，弃上清，加入200 uL ddH2O，涡旋混匀，100℃加热10 min，2000 rmp，离心1 min，上清中含菌株的基因组DNA。
3) 16S rDNA片段的PCR扩增
以各塑料降解菌DNA提取液作为模板，用16S rDNA的通用引物27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)、1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增反应。20 uL反应体系包含：8.5 uL ddH2O，10 uL PCR mix，0.5 uL 上游引物(10 umoL/L)，0.5 uL下游引物(10 umoL/L)，0.5 uL DNA模板。PCR反应程序为：95℃ 5 min；95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 1 min 40 s，循环30次；72℃ 2 min；12℃，1 h。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
4) 16S rDNA片段的序列测定
将扩增效果良好的PCR扩增产物送往上海生工进行DNA序列测定，测序引物为27F/1492R，双向测序。
5) 塑料降解菌的鉴定
测序结果经MEGA7.0软件去除无用序列后，使用DNAMAN软件进行序列比对和序列拼接，所整理的各菌株16S rDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析。用MEGA7.0软件将各菌株16S rDNA序列与数据库中已知序列进行DNA序列比对，选择NJ树法，采用Bootstrap检测(1000次)对塑料降解菌进行聚类分析，最终确定各塑料降解菌株的种属。最后根据各塑料降解菌的特性，分析各菌株的潜在应用价值。
3. 结果与讨论
3.1. 塑料降解菌的筛选
Figure 1. Screening of plastic degradation bacteria
图1. 塑料降解菌筛选
以PE塑料为唯一碳源的无机盐培养基从半降解塑料的土壤中筛选出可利用塑料的菌株。经两步筛选，共得到9个具有塑料降解作用的菌株，分别为PE 3-1、PE 3-2、PE 3-5、PE 3-7、PE 3-10、PE 4-1、PE 4-5、PE 4-7和PE 4-8。筛选结果如图1，从图中可以看到，各菌株经培养后，培养基均出现明显的浑浊，表明各菌株在以塑料为唯一碳源的培养基中能生长繁殖。
3.2. 塑料降解率的测定
以塑料膜为降解对象，在低能量培养基中，采用失重法对各菌株的塑料降解率进行测定。降解率实验结果见图2。结果表明，PE 3-1、PE 3-2、PE 3-5、PE 3-7、PE 3-10、PE 4-1、PE 4-5、PE 4-7和PE 4-8九株菌的塑料降解率分别为1.41%、4.24%、1.12%、1.42%、0.338%、0.702%、0.65%、0.33%和0.413%。其中，菌种PE 3-2的降解效果显著高于其他菌株。
目前，塑料的微生物降解仍存在降解效率，降解时间长的问题。如段亚良[11]用黑曲霉(Aspergillus niger)对聚乙烯塑料颗粒进行30 d的降解后，降解率为7.65%，Hou等[28]用两株假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)降解聚乙烯塑料60 d，降解率分别为3.62%和5.95%。本研究中筛选出的塑料降解菌，经224 d，降解率也仅为4.24%，说明该菌株对塑料膜的降解能力有限，另外，本研究使用的塑料膜较厚，比表面积小，微生物与塑料接触少，也是导致降解率低的原因。
Figure 2. Degradation results of plastic degrading bacteria
图2. 塑料降解菌对塑料的降解率作用
3.3. 塑料降解菌的核酸分类学鉴定
采用平板划线法对塑料降解菌进行纯化，提取各菌株的DNA后，采用通用引物(27F-1492R)扩增其16S rDNA序列，PCR扩增产物和琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3。实验结果显示，各塑料降解菌均扩增出单一、明显的条带，扩增产物长度约1500 bp。
Figure 3. Electrophoretic profile of 16S rDNA fragments from plastic degrading bacteria.
图3. 塑料降解菌的16S rDNA片段扩增结果
对各塑料降解菌株的16S rDNA片段进行测序，各序列整理后，经序列比对，在NCBI数据库中进行BLAST检索，挑选出相似度最高(99%以上)的同源序列，进行序列比对及聚类分析。各塑料降解菌及其相似序列的聚类分析结果如图4。聚类分析结果显示，菌株PE 3-1、PE 3-2、PE 3-5、PE 3-7、PE 4-7和PE 4-8与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的同源性最高(99.93%)，故这6株菌同为恶臭假单胞菌。菌株PE 3-10、PE 4-1和PE 4-5与产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes)的同源性最高(99.93%)，因此这3株菌的鉴定结果为产吲哚金黄杆菌。
Figure 4. Cluster analysis of plastic degrading bacteria
图4. 塑料降解菌的聚类分析
各塑料降解菌的核酸分类学鉴定结果见表1。其中恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) 6株，产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes)3株。已报道的塑料降解菌以假单胞菌(Pseudomonas)居多[28] [29]，另据报道，青霉菌(Penicillium)、芽孢杆菌(Bacillus)等也具有塑料降解的作用[17] [18] [27]。本研究筛选出的塑料降解菌多为恶臭假单胞菌，塑料降解能力较强，该菌属为革兰氏阴性菌[30]，是人类咽部的正常菌群。球杆状、氧化酶阴性、无动力、为专性需氧菌，最适生长温度25℃~30℃，可产生荧光素(青脓素)，能够降解烟酸，且不会产生二次污染[31]。能够诱导棉花植株的系统抗性，提高棉花抗病性[32]；其发酵菌液产生的环二肽cyclo (L-Pro-L-Ile)，可抑制线虫的活性[33]，还可促进双孢蘑菇生长发育[34]等。筛选出的产吲哚金黄杆菌，塑料降解能力较弱。该菌属为非发酵型革兰氏阴性菌，圆形、菌落大小0.5~1 mm、金黄色、较透明、蛋白酶阳性，其培养物或培养物分离出的化合物可抑制线虫的生长繁殖，尤其是对松材线虫有显著抑制作用，还可高效降解废水中的有机污染物[35]，并可用于制备蛋白质谷氨酰胺酶[36]和弹性蛋白酶[37]。另外，该类菌也可高效降解羽毛角蛋白，72 h内羽毛降解率高达70%以上，且其菌液及其羽毛发酵液对哺乳动物无副作用[38]。
Table 1. Identification results of plastic degradation bacteria
表1. 塑料降解菌的鉴定
| 引物 |
菌株 |
基因ID |
拉丁名 |
中文名 |
相似度(%) |
| 27F/1492R |
PE 3-1 |
MK780186.1 |
Pseudomonas putida |
恶臭假单胞菌 |
99.93 |
| PE 3-2 |
| PE 3-5 |
| PE 3-7 |
| PE 4-7 |
| PE 4-8 |
| PE 4-1 |
KX817277.1 |
Chryseobacterium indologenes |
产吲哚金黄杆菌 |
99.93 |
| PE 4-5 |
| PE 3-10 |
4. 结论
本文以聚乙烯为唯一碳源，分离出9株可培养塑料降解菌株，其塑料降解率为0.33%~4.24%，菌株PE 3-1的降解率最高(4.24%)。经核酸分类学鉴定有6株为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，3株为产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes)。两类菌均有一定应用价值，且较为安全，其中，恶臭假单胞菌的塑料降解能力较强，在塑料降解方面有更大的应用潜力。
致 谢
本文受北华大学林学院大学生创新创业训练计划项目资金支持。
感谢吉林省林业生物技术工程研究中心和北华大学林学院林业生物技术创新研究平台对本课题的支持和帮助。
NOTES
*通讯作者。