中性粒细胞胞外陷阱在重症肺炎发生发展中的作用

The Role of Neutrophil Extracellular Traps in the Occurrence and Development of Severe Pneumonia

摘要: 中性粒细胞胞外陷阱(Neutrophil Extracellular Traps, NETs)由中性粒细胞活化后分泌并释放到细胞外，是一种由DNA、组蛋白和抗菌蛋白组成的网状结构，负责捕获和杀死细胞外病原体。中性粒细胞在细菌、真菌、炎症因子等刺激物的刺激下被活化并持续释放NETs，可使周围血小板活化，组织细胞受损。一些研究已经证明了Nets的形成是促进炎症发生发展的方式之一，炎症因子如IL-8、IL-1β和TNF-α与NETs的形成关系密切。近年来，NETs在重症肺炎(Severe Pneumonia, SP)发生发展中的作用不断被揭示出来。因此，我们综述了目前对NETs与重症肺炎相关的作用机制的相关研究。旨在为评估重症肺炎病情的严重程度及寻找治疗重症肺炎的新靶点提供理论依据。

Abstract: Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are secreted and released outside the cell by activated neutrophils and are a meshwork of DNA, histones and antimicrobial proteins responsible for trapping and killing extracellular pathogens. The activation and sustained release of NETs by neutrophils stimulated by stimuli such as bacteria, fungi and inflammatory factors can lead to activation of peripheral platelets and damage to tissue cells. Several studies have demonstrated that the formation of NETs is one of the ways to promote the occurrence and development of inflammation, and inflammatory factors such as IL-8, IL-1β, and TNF-α are closely related to the formation of NETs. In recent years, the role of NETs in the occurrence and development of Severe Pneumonia (SP) has been continuously revealed. Therefore, we reviewed the current studies related to the mechanism of action of NETs associated with severe pneumonia. The aim is to provide a theoretical basis for evaluating the severity of severe pneumonia and searching for new targets for the treatment of severe pneumonia.

1. 引言

中性粒细胞胞外陷阱(Neutrophil Extracellular Traps, NETs)，也称为中性粒细胞胞外诱捕网，是细胞外染色质纤维的网络，通常被瓜氨酸化，并被抗菌肽和酶修饰，如中性粒细胞弹性酶、防御素和髓过氧化物酶(MPO)等。Nets是通过一种被称为NETosis的过程驱动的。在感染情况中，NETs既具有保护也具有有害的作用[1]。近年来，国内外多项研究表明，NETs在多种疾病的发生发展及病理过程中起着关键作用[2]。本文将结合国内外研究，综述NETs结构、形成和释放以及在炎症、组织损伤及凝血功能中的作用机制，并结合重症肺炎发生发展过程中的相关病理过程，分析NETs在重症肺炎中的作用，以期为重症肺炎的诊治提供新思路。

2. NETs

中性粒细胞是人体中丰富的免疫效应细胞，作为在炎症或感染时做出反应的主要细胞，是免疫反应正常运作的关键参与者[3]。其具有广泛有效的抗菌成分，这些抗菌成分主要储存在特定的颗粒中，但中性粒细胞也可以损害宿主组织，它的部署受到三种调控：吞噬、脱颗粒及中性粒细胞胞外陷阱(NETs)的释放，被释放出细胞外的NETs可以捕获、中和和杀死细菌、真菌、病毒和寄生虫，并被认为能防止细菌和真菌的传播[4]。

早在20年前，Brinkmann等人发现，活化的中性粒细胞可以产生一种细胞外结构，即中性粒细胞胞外陷阱，是由颗粒和细胞核成分组成的网状结构[5]。这是一种疏松的细胞外网状纤维结构，是由胞质蛋白和颗粒蛋白组成，它们组装在双链DNA支架上。其主要的结构和成分包括染色质DNA以及CitH3、MPO、NE、抗菌肽等30余种颗粒蛋白及酶，这些颗粒蛋白及酶黏附在染色质周围，具备杀灭病原微生物的功能[6]。

NETs可由中性粒细胞在多种刺激如细菌、真菌、寄生虫、病毒、有机因子如脂多糖(LPS)、免疫复合物、激活的血小板、无机因子如钙离子、过氧化氢和细胞因子如白细胞介素-8 (IL-8)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)等刺激下被活化的中性粒细胞释放到细胞外而形成[7]。这些刺激可增加中性粒细胞胞质钙浓度，导致NADPH氧化酶的激活及活性氧(ROS)的爆发[8]。之后激活中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)及髓过氧化物酶(MPO)，这些酶是NETs形成的关键酶。线粒体也可以触发这一过程，但并不依赖NAPDH氧化酶[9]。中性粒细胞释放NETs到细胞外的过程称为NETosis。目前认为NETosis主要分为两种不同机制，包括自杀性溶解性NETosis和非溶解性NETosis [10]。这两种机制的主要区别在于中性粒细胞在释放NETs后是否还存活。自杀性溶解性NETosis的过程涉及细胞死亡、中性粒细胞核脱落及核膜解体、染色质解聚、细胞膜破裂、细胞溶解，并将NETs释放到细胞外[11]。非溶解性NETosis则不会损害中性粒细胞的结构和功能完整性，产生的蛋白质修饰的染色质通过囊泡排出而不破坏质膜[12]。且不同的刺激物导致的NETs形成方式不同，同一刺激物也可能诱导不同的NETs形成方式[13]。

3. NETs与炎症反应

NETs的形成是炎症相关疾病发生的标志[14]。虽然NETs的产生可以抑制病原体并发挥抗菌作用，但过度产生的NETs可通过其多种蛋白酶和组蛋白等发挥细胞毒性作用，引起急性炎症反应和组织损伤[15]。当炎症发生时，受损组织和其他免疫细胞释放的细胞因子(如趋化因子)会吸引中性粒细胞朝向炎症部位进行定向迁移，并通过识别和吞噬病原体及释放炎症介质等方式参与炎症反应[16]。随后中性粒细胞便可通过释放NETs来对抗炎症部位的病原体。NETs可激活TLR-4/TLR-9/NF-κB信号通路并上调NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 (NLRP3)和pro-IL-1β水平，说明了NETs有助于激活NLRP3炎症小体和炎症反应[17]。目前已知的核心组蛋白有：H2A、H2B、H3和H4，其也是NETs的重要组成部分。且组蛋白可以通过NLRP3炎性体激活单核细胞来源的树突状细胞，诱导IL-1生成[18]。H3能够作为趋化因子，诱导炎症因子的产生以及白细胞和组织细胞的凋亡，并同时激发直接细胞毒性，引发炎症反应[19]。也有研究证明了NETs可能通过促进肺泡巨噬细胞极化为M1型来加重炎症反应[20]。一项有关NETs的小鼠实验中发现，NETs释放的高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)可诱导巨噬细胞的死亡，以此介导多形核中性粒细胞(PMN)和巨噬细胞之间的联系，并发挥促炎作用，从而影响感染后炎症的进展[21]。除此之外，还有研究发现NETs能够直接刺激巨噬细胞引起慢性炎症反应。因此，当炎症反应随着病情加重时，越来越多的中性粒细胞在炎症部位聚集并释放NETs，NETs的水平升高并进一步加重炎症反应，其发展过程可能与重症肺炎的病情发展密切相关。

4. NETs与重症肺炎

重症肺炎(Severe Pneumonia, SP)是临床上常见的重症呼吸系统疾病，其发病率及病死率高，且发病机制复杂，患者常出现低氧血症、呼吸衰竭等严重症状[22]，增加治疗的难度，降低患者生活质量，严重威胁患者生命安全，炎性细胞、内皮细胞损害及凝血功能的异常也贯穿在其发展的病理过程中，与其预后密切相关[23] [24]。在重症肺炎患者发病过程之初，患者在病原体入侵后，机体免疫系统会释放多种炎症因子，如白细胞介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)等，引起全身炎症反应和局部肺部炎症反应，从而进一步损伤肺部组织和器官功能[25]。一项有关重症肺炎患者血液中炎症指标的研究表明，在重症肺炎患者中，血液炎症指标IL-6、铁蛋白、降钙素原升高提示患者死亡风险高[24]。重症肺炎患者通常存在着不同程度的血小板下降。有研究表明，重症肺炎患者血小板计数 < 150 × 10⁹/L是重症肺炎患者死亡的独立影响因素[26]。且重症肺炎患者常伴有凝血功能障碍和血栓形成，主要是由于炎症反应及氧化应激反应的增强引起，凝血因子的异常激活会产生纤维蛋白等血栓物质，堵塞肺小动脉，影响肺部氧合功能[25]。重症肺炎由于病情的进展，可造成肺部组织出现肺水肿、炎细胞浸润等生理病理学改变，若病情未得到有效控制，可造成急性肺损伤的发生[27]。综上所述，重症肺炎病程发展过程发病机制复杂，主要涉及病原体入侵、炎症反应、凝血功能障碍、血栓形成、组织损伤等多方面，治疗难度大，死亡率高，目前NETs在许多炎症性疾病中被广泛报道，多项研究实验证据表明，NETs可能在重症肺炎的发生发展过程中发挥关键作用。

4.1. NETs在重症肺炎发生及发展中的作用

有研究表明，肺炎患者体内NETs被过度激活，患者外周血和肺组织中的NETs水平升高，且NETs形成能力与肺炎患者呼吸窘迫的发生率和严重程度密切相关[28]。一项对155名肺炎患者进行的研究[29]发现，NETs参与了肺炎的发生与发展，且重症肺炎患者中NETs水平显著升高。此外，一项关于重症肺炎患者的临床研究[30]发现，重症肺炎患者血清及肺泡灌洗液中NETs水平明显增高，且与单核细胞计数、C-反应蛋白(CRP)存在明显相关性。这说明NETs与重症肺炎及其严重程度存在正相关关系。并且NETs水平升高在一定程度上影响重症肺炎患者的预后[31]。

4.2. NETs与炎症反应在重症肺炎中的作用

目前有多篇文献报道重症肺炎患者的预后与诸多炎症相关因子有关，这可能与NETs在炎症反应中发挥的作用相关。有研究发现，在重症肺炎患者中，NLRP3炎症小体介导的IL-1β和NET形成前馈回路，并加重重症肺炎的炎症反应[32]。并且有研究表明，重症肺炎患者NLRP3、IL-1β等炎症因子水平呈高表达，并且其表达与病情严重程度呈正相关，联合检测可提高重症肺炎患者的诊断价值[33]。在一项关于NLRP3与重症肺炎炎症反应及预后的临床研究中，证明血清NLRP3在重症肺炎患者水平升高，可能作为辅助评估重症肺炎患者预后的生物标志物[34]。除此之外，一项对重症肺炎患者不良预后因素的临床研究发现，血清中HMGB1等水平对于重症肺炎患者转归不良具有较高的预测价值[35]。且HMGB1检验对重症肺炎合并呼吸衰竭患者的预后也有预测价值[36]。因此，上述实验及研究再次证明了NETs在重症肺炎中可能起到促进炎症反应的作用。重症肺炎病情严重时常会出现急性肺损伤，甚至ARDS。在急性肺损伤发生发展时，中性粒细胞在肺部大量积聚，并可产生大量细胞毒性物质并产生释放NETs，形成炎症风暴，对组织产生损害[37]。Thomas等人的研究也证明，过度的NETosis会损害肺上皮细胞和内皮细胞[38]。因此，NETs的产生与释放也可能与重症肺炎所致的肺组织损伤相关。

4.3. NETs在重症肺炎相关凝血功能异常中的作用

NETs的持续释放导致周围血小板活化，血管内皮细胞和血管平滑肌细胞受损[39]。血小板也可以参与NETs的释放，并与中性粒细胞相互作用，共同定位感染直到感染被清除，但某些病原体可能引发血小板–中性粒细胞相互作用的失调，并可能随后传播血栓炎症过程[40]。所以，重症肺炎患者中NETs的形成可能与活化血小板与中性粒细胞之间的相互作用有关。一项关于重症监护室中重症肺炎患者的血栓栓塞症事件的发生率及病死率的回顾性研究发现，重症肺炎患者的血栓栓塞症事件的发生率及病死率均高[41]。也有研究表明，NETs在血栓形成过程中也发挥着促进的作用[42]。血液中的NETs可以为血栓提供支架作用[4]。血栓形成的过程中NETs的形成是由于缺氧诱导内皮细胞释放血管性血友病因子(VWF)和p选择素，p选择素促进中性粒细胞积聚，随后中性粒细胞促进血小板产生血栓烷A2，诱导内皮细胞表达细胞间粘附分子1 (ICAM1)，加强中性粒细胞与内皮细胞的相互作用，诱导中性粒细胞产生并释放NETs。除此之外，还可以通过血小板衍生的高迁移率组蛋白B1 (HMGB1)、ROS和整合素的机制触发NETosis，NETs可通过形成Weibel-Palade小体促进血栓形成，并且NETs结合的中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)可切割组织因子途径抑制剂(TFPI) [43]。目前，NETs在重症肺炎中促进血栓形成的机制仍需进一步研究。

5. 小结与展望

综上所述，NETs与重症肺炎的发生及发展关系密切，其参与了炎症反应、组织损伤、血栓形成等诸多病理生理过程。但NETs在重症肺炎病理过程中的作用机制及在重症肺炎病情发展中所发挥的作用尚未阐明。随着未来的进一步研究，NETs可能成为重症肺炎诊断或病情预测的生物学指标，也可能成为治疗重症肺炎的潜在干预靶点。因此，NETs的研究将为重症肺炎的诊治提供新的思路与方向。

NOTES

^*通讯作者。