自然杀伤细胞在急性髓细胞白血病治疗中的研究进展

Advancements in the Therapeutic Application of Natural Killer Cells in Acute Myeloid Leukemia

摘要: 急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)是一种具有异质性遗传格局和复杂克隆进化特征的侵袭性血液系统恶性肿瘤。这种病在各个年龄段都有可能发生，而且随着年龄的增长，发病率也会越来越高。目前治疗AML面临着原发耐药和早期复发等挑战，因此需要寻找新的治疗方法。免疫治疗主要通过激活机体免疫反应来攻击肿瘤细胞，而不同于传统的化学疗法。造血干细胞移植也是依赖于供体免疫细胞对宿主白血球进行攻击和消灭以达到治疗白血病的目的。近年来，免疫治疗在AML治疗中受到越来越多的关注，以增强免疫应答为目的的新型抗肿瘤治疗策略的兴起，使自然杀伤(Nature Kill, NK)细胞成为备受关注的领域。NK细胞是一种可以直接识别抗原、非特异性地杀伤肿瘤细胞的机体固有免疫系统的细胞毒性淋巴细胞，是机体防御系统的第一道屏障。本文将对目前在急性髓系白血病治疗中NK细胞及其应用进展的机制探索进行总结。

Abstract: Acute myeloid leukemia (AML) is an aggressive hematologic malignancy characterized by a heterogeneous genetic profile and complex clonal evolution. AML can occur across all age groups, with an increasing incidence as age advances. Current treatment of AML is challenged by primary resistance and early relapse, underscoring the need for novel therapeutic strategies. Unlike traditional chemotherapy, immunotherapy targets tumor cells by activating the body’s immune response. Hematopoietic stem cell transplantation also relies on donor immune cells to attack and eradicate host leukemic cells, serving as a therapeutic approach for leukemia. In recent years, immunotherapy has garnered growing attention in the treatment of AML. The emergence of novel anti-tumor strategies aimed at enhancing immune responses has highlighted the importance of natural killer (NK) cells. NK cells are cytotoxic lymphocytes of the innate immune system, capable of directly recognizing antigens and non-specifically killing tumor cells, serving as the first line of defense in the body’s immune system. This review will summarize the current mechanistic insights and therapeutic advancements in the application of NK cells in the treatment of AML.

1. 引言

急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)是白血病中最常见的类型之一，是一种侵袭性的血液系统恶性肿瘤，具有异质性的遗传格局和复杂的克隆进化特征[1]，AML的发病可出现在各个年龄段，随着年龄的增长，发病率也会增加[2]。研究显示，AML患者初诊年龄较大，成人发病率高于儿童[3]。由于年龄的因素，AML的预后很差。治疗方案的优化和风险分层使AML的治疗结果得到了改善，总生存率得到了提高。标准的治疗方法是使用蒽环类药物和阿糖胞苷的高剂量化疗，使80~90%的患者达到完全缓解的状态，然后进行额外的化疗或异基因造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT) [4]。尽管缓解率高，但50%~70%的患者会复发[5]。研究表明，即使在第二次缓解中使用强化再诱导化疗和HCT，复发AML的结果仍然非常差[3]。

在目前对于AML的治疗中，原发耐药和早期复发是具有挑战性和亟待解决的一大重要问题，因此，寻找治疗AML的新疗法势在必行[3]。难治性AML发生率约10~40%，预后差，中位生存期不到1年[6]。2010年NCCN指南定义难治性AML的诊断标准[7]为：(1) 诱导缓解治疗无效；(2) 首次CR (Completely Review, CR1)后6~12个月内复发；(3) CR1后6~12个月后复发，原诱导方案治疗无效；(4) 具有2次或2次以上复发；(5) 髓外白血病持续存在。复发白血病诊断标准[8]：CR后外周血重新出现白血病细胞或骨髓原始细胞>5%或髓外出现白血病细胞浸润。对骨髓中原始细胞比例较低(5%~20%)的患者，应重复骨髓检查以除外其他原因如巩固化疗后骨髓重建等。近年来，随着分子生物学技术的发展，AML高度异质性的复杂特征得到了更深的理解，从而出现一些新的治疗策略，包括新的细胞毒性药物组成新的化疗方案、靶向治疗、免疫治疗等，这些新的治疗使耐药的患者能够再次获得缓解，延长了患者的生存时间[9]。AML治疗方案的选择需要结合患者年龄、体能状态、合并症、细胞遗传学与分子生物学特征、患者意愿等多方面的利弊来权衡判断[3]。免疫治疗不同于传统化疗，主要通过激活免疫反应来攻击肿瘤细胞[5]，HSCT也是依赖于供体免疫细胞攻击和杀伤宿主白血病细胞而治疗白血病的[7]，因此，免疫治疗在治疗AML中越来越受到关注。近年来，以增强免疫应答为目的新的抗肿瘤治疗策略的兴起，使自然杀伤(nature kill, NK)细胞成为人们关注的焦点。NK细胞是机体固有免疫系统的细胞毒性淋巴细胞，是机体防御体系的第一道屏障，无须抗原预先致敏就可以直接识别，非特异性地杀伤肿瘤细胞[10]。NK细胞过继免疫治疗成为新的肿瘤治疗策略[11]。本文将总结当前关于NK细胞的机制探索，就目前关于NK细胞对于急性髓系白血病的杀伤机制及治疗进展方面等进行综述。

2. NK细胞的特点

NK细胞是免疫系统的一个组成部分，具有细胞毒性和免疫调节双重功能，表面特异性表达CD56和CD16，不表达CD3，占外周血淋巴细胞的10%~15%。根据表达分子表面强度的差异又将NK细胞分为CD56dim CD16bright和CD56bright CD16dim两种亚型，其中CD56dim CD16bright亚型主要分布于外周血，表达免疫球蛋白样受体(killer cell inhibitory receptor, KIR)，具有高杀伤活性；而CD56bright CD16dim亚型主要分布于周围淋巴器官，以分泌IFN-γ、IL-12、IL-15等起到免疫调节作用的细胞因子[12] [13]。

与T和B淋巴细胞不同的是，NK细胞是人体免疫的第一道防线，可以非特异性地迅速杀死肿瘤或病毒感染的细胞[10] [14]。NK细胞的杀伤作用主要通过穿孔素/颗粒酶途径和细胞凋亡途径等直接杀伤作用及分泌细胞因子等机制起效[15]。除此之外，NK细胞还可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytoxicity, ADCC)发挥抗白血病效应[16]。

同时，NK细胞也是机体过继免疫治疗中十分重要的一环。NK细胞对恶性肿瘤和病毒感染性疾病具有天然的细胞毒性和治疗潜力。研究发现，NK细胞的肿瘤浸润与肿瘤患者的存活时间延长有关，而与肿瘤风险降低有关的是细胞毒性更强的NK细胞。从健康供体到癌症患者的同种异体过继转移NK细胞已经显示出作为控制或逆转多种人类恶性肿瘤(包括多发性骨髓瘤和AML)发展的有效手段。然而，这种治疗方法仍有许多问题，例如活化受体的丧失、转移的NK细胞残余细胞毒性，以及在强化条件下，血液学和非血液学毒性的出现，影响了使用过继转移NK细胞的长期癌症治疗效果。

3. NK细胞抗AML的机制

3.1. NK细胞的受体及配体

NK细胞表达多种不同的受体，根据受体在靶细胞表面相对应的配体不同进行分类[17]：人白细胞抗原-I (HLA-I)类分子特异性受体、非HLA-I类分子特异性受体和其他受体。HLA-I类分子特异性受体识别的配体是HLA-I类分子，包括免疫球蛋白样超家族受体杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptors, KIR)家族和免疫球蛋白样转录物(immunoglobulin like transcripts, ILT)家族以及C型凝集素超家族受体CD94/NKG2。非HLA-I类分子特异性受体包括NKG2D [18]和天然细胞毒受体(natural cytotoxicity receptors, NCR) [19]。NKG2D识别的配体是应激诱导的MHC-I相关链A、B分子(MHC class I-related chain A and chain B, MICA/MICB) [20]和巨细胞病毒糖蛋白UL1b结合蛋白(UL1b binding proteins, ULBP) [21]。

从NK细胞表达的受体功能上将它们分为抑制性受体和激活性受体两大类[19]。抑制性受体包括KIR抑制性受体、CD94/NKG2A、B等，均为HLA-I类分子特异性受体；NK细胞的主要激活受体为天然细胞毒受体(NCR: NKp30, NKp46, NKp44)、NKG2D和DNAM-1等。

NK细胞通过表达多种受体，整合抑制性受体和激活性受体转导的负性信号和活化信号，使机体能够区分自身正常细胞和HLA-I分子水平下调或丢失的异常细胞。当细胞表面MHC-I类分子发生改变(减少或缺失)时，活化信号占主导地位，使NK细胞活化产生杀伤作用，即NK细胞的“自我缺失”识别模式[22]。因此，当白血病靶细胞上MHC-I表达降低或活化性配体表达增高时，NK细胞的活化性信号超过抑制性信号，NK细胞的杀伤功能就被激活，从而起到抗白血病的效应。因此，NK细胞的杀伤功能也与其表面活化性和抑制性受体与其相应的特异性配体相互作用所介导的信号间的平衡来实现[23]。当这些受体及其配体的表达失衡时，NK细胞对肿瘤细胞的识别被阻碍使肿瘤产生进展。

3.2. AML患者NK相关受体配体的变化

在AML患者中，某些激活性受体，如NKG2D、NKp46、NKp30等表达水平较高[24]。激活受体的表达依赖于AML细胞表面的相对应配体[25]。此外，患者自身的身体情况也会对NK细胞受体产生影响。Fauriat等[26]报道，AML患者中NKp30和NKp46的表达在诊断时降低，但在CR后部分恢复，复发时再次下降。Chretien等[27] [28]研究发现，NKp30和NKp46受体表达降低的患者的总体和无复发、无进展生存率相较于受体高表达的患者更高。这些研究表明，NK细胞的活化受体极有可能与AML的发病及预后相关。

激活受体的配体在AML中的表达也受到相关机制的调控。Nowbakht等[29]证明AML细胞表面NKG2D配体(NKG2DL；MICA/MICB和ULBPs1-3)缺失或低水平表达。这是AML细胞避免免疫识别的一种途径，这些配体以可溶性的形式从细胞表面释放出来，通过金属蛋白酶切割或进入外泌体。Sailh、Hilpert等人研究表明[30] [31]这些NKG2D配体常出现在AML患者的血清中，促进NKG2D的下调，从而使NK细胞丧失经由NKG2D途径激活的细胞毒能力。因此，可溶性MICA、MICB和ULBP1水平低的AML患者更有可能达到缓解，且生存期更长。Sanchez-Correa等[25]研究发现，DNAM-1配体，例如CD112、CD155等，在AML患者中高表达。我们现在仍需要进一步的研究来证实此假设，并且需要进一步的实验及试验来确定这些激活受体高表达是否可以提高AML细胞的免疫识别能力。

Sandoval等[24]研究证实，在AML患者中CD158b (KIR2KL2/L3)和NKG2A等抑制性受体的表达均高于健康人，这会导致NK细胞的细胞毒性作用减弱，分泌细胞因子(如IFN-γ，TNF-α)的能力下降。由此说明，在AML患者体内，NK细胞的抑制性受体表达也发生了改变。

4. NK细胞抗AML的临床应用

4.1. 自体NK细胞扩增治疗

20世纪80年代，研究发现白介素-2 (interleukin-2, IL-2)能在体外显着增强NK细胞的功能，通过体外培养后回输至肿瘤患者体内后，可以取得一定的抗肿瘤作用，但同时大剂量IL-2也会对人体产生不可耐受的毒性[32]。有临床前研究[33]表明，低剂量IL-2可以通过恢复NK细胞受体的表达和提高NK细胞的细胞毒性来达到治疗AML的效果，但临床效果评估不佳。这可能是由于IL-2在诱导自体NK细胞扩增的同时还能引起调节性T细胞的扩增，而后者可抑制NK细胞的增殖和功能[34]。种种限制让同种异体NK细胞在人们探索中成为了一个新方向。

4.2. 异体NK细胞输注治疗

4.2.1. 造血干细胞移植联合异基因NK细胞输注治疗

免疫细胞中的NK细胞在移植后早期T细胞耗尽时最先恢复，使其在抗白血病方面发挥了独特的作用[12]。Ruggeri研究[35] 112例接受移植后的高风险AML患者发现，异基因NK细胞在HSCT中介导了强大的移植物抗白血病效应(graft-versus-leukemia, GVL)，并能够降低移植物抗宿主病(graft-versus-host-disease, GVHD)的发生率。在临床前的初步研究表明，在预先植入人类AML细胞的NOD/SCID小鼠中输注人同种异体NK细胞，能够清除小鼠白血病细胞并提高存活率。关于供体NK细胞的GVL效应在接受异基因HSCT的AML患者中得到证实[36]。

4.2.2. 非移植环境中异体NK细胞输注治疗

Miller等[37]人在21世纪初首先证实了单独使用同种异体NK细胞治疗白血病的疗效和安全性。这项研究表明，在19名预后不良的AML患者中，在KIR错配时，5名体内输入扩增的NK细胞是可行且有效的，而缓解率则上升至80%。Achanova等[38]人也证实了受者免疫反应中某些成分对NK细胞的抗白血病活性的重要影响、NK细胞扩增与化疗后血清细胞因子的浓度有关、调节性T细胞数量的扩大及严重影响输注的杀伤作用。这些研究成果给AML患者在临床治疗中带来了新的希望。

4.3. CAR-NK细胞治疗

AML中两个主要靶点是CD123与CD33，尤其是CD33表达于80~90%的AML患者原始细胞，这为免疫疗法提供了一个有吸引力的靶标。作为一种天然免疫细胞，NK细胞为CAR修饰细胞免疫治疗研究提供了新的方向，其特点是不需要预先致敏的自发性毒性，不受限制的MHC和独特的ADCC功能。一项针对CD33的CAR-NK的I期临床研究可证明注射CD33-CAR-NK的安全和耐受良好。研究[39]证实，杀伤细胞抑制受体(killer cell inhibitory receptor, KIR)与供体不匹配的NK细胞可通过异基因造血干细胞移植治疗AML，可减少免疫耐受并不会出现GVHD。已有靶向AML的CAR-NK在体外实验和动物模型中均取得显著效果，能明显延长AML小鼠的存活时间[40] [41]。上述研究表明，CD4 + CAR-NK细胞治疗CAR-NK细胞作为一种新型针对AML的免疫疗法具有较好的前景。

4.4. NK细胞的联合治疗

随着人们对于AML分子生物学及免疫治疗机制的探讨，联合用药取长补短逐步成为人们提高AML治疗效果的新思路。NK细胞可通过其细胞毒能力导致肿瘤细胞的溶解。然而，肿瘤细胞也可以通过不同的机制逃逸NK细胞的杀伤，导致肿瘤细胞对于NK产生耐药。这些挑战使得人们探索基于NK细胞的联合治疗，旨在改变NK细胞及肿瘤细胞表面有关分子的表达。

4.4.1. 联合单克隆抗体治疗

在对AML的研究中，目前已鉴定多种与AML相关的抗原，包括CD33、CD123等[42]。而单克隆抗体能选择性地靶向AML特异性抗原，以破坏肿瘤的增殖途径或传递药物毒性，并且不会激活或增强宿主对白血病的免疫系统。基于NK细胞独特的ADCC作用，研究发现Fc优化的抗体将AML相关抗原与NK细胞靶向结合起来，有效地增强ADCC作用[43]。AML相关抗原的多样性，为各种Fc带来多种可能性。

4.4.2. 联合PD-1/PD-L1阻断剂治疗

程序性死亡受体-1 (programmed death-1, PD-1)/程序性死亡受体1的配体(programmed death ligand 1, PD-L1)免疫疗法通过阻断PD-1/PD-L1信号通路，使肿瘤细胞死亡，给病人带来新的希望。其治疗肿瘤的潜力多种多样。除T细胞外，NK细胞也介导PD-1/PD-L1免疫疗法。Hsu等研究[44]表明，活化的NK细胞表达PD-1，而当肿瘤细胞表达PD-L时，两者的相互作用导致NK细胞反应降低，从而使肿瘤发生免疫逃逸。进一步研究结果证实，通过对PD-1/PD-L1的阻断，有效恢复了NK细胞的杀伤功能。因此，阻断PD-1/PD-L1可通过激活NK细胞在AML中显示出较好的治疗效果[45]。这些研究结果表明，该途径值得进一步研究。

4.4.3. 联合靶向化疗药物治疗

近年来，由于免疫学、细胞遗传学和分子生物学在白血病的诊断和治疗中的广泛应用，人们对AML发病起驱动作用的关键信号分子失调机制有了深入的认识，小分子药物、单克隆抗体和许多靶向免疫治疗越来越成为新型的抗肿瘤治疗手段。

1) FMS样酪氨酸激酶3 (FMS-like tyrosine kinase 3, FLT3)抑制剂

FLT3是受体酪氨酸激酶家族成员，广泛表达于造血祖细胞表面，在大多数AML原始细胞上过表达，在多能造血干细胞增殖、生存、分化中起关键作用。FLT3基因突变是AML中最常见的基因组突变，在AML中的突变率约30% [46]。目前针对FLT3突变已开发出多种靶向抑制剂，包括Lestaurtinib、索拉非尼、吉瑞替尼、Quizartinib等[47]。研究发现，吉瑞替尼不仅可以上调肿瘤细胞NKG2DL的表达，还可以上调NK细胞NKG2D的表达，从而阻断肿瘤免疫逃逸[48]。同时也有研究表明，分子靶向药物舒尼替尼(Schunitini)和索拉非尼(Solafini)具有诱导肿瘤细胞表达NKG2D的免疫调节功能，从而提高NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力。

2) Bcl-2抑制剂

Venetoclax是一种选择性的、口服生物利用度高的Bcl-2抑制剂，在多种血液肿瘤中具有治疗潜力。Bcl-2在白血病干细胞表面高表达，应用Bcl-2抑制剂可以增强AML细胞对低甲基化药物的敏感性[49]。Wu等研究证实[50]，Venetoclax可通过NFK-β信号通路选择性诱导AML细胞表面NK激活性受体相对应配体NKG2DL的增加。这说明Venetoclax联合NK细胞可协同作用于AML细胞，诱导细胞溶解。

3) 去甲基化药物

对于不能耐受强烈化疗的AML患者，采用低强度的去甲基化药物或低剂量阿糖胞苷的化疗方案对延长患者的生存率也有很大作用。地西他滨是一种代表性的去甲基化药物，Vasu等发现[51]地西他滨能诱导NKG2D的上调从而增强NK细胞对AML细胞的杀伤。另外，在异种移植的AML小鼠模型中，地西他滨还可通过NKp44的上调增强NK细胞介导的AML细胞杀伤[52]。这些研究表明地西他滨可以通过多种机制增强NK细胞的活性，达到抗肿瘤作用。

4) 其他药物

目前处于临床试验阶段或已用于临床的治疗AML的常用药物除上述讨论的药物外，还包括IDH抑制剂、mTOR抑制剂、蛋白酶体抑制剂、细胞毒药物(蒽环类、生物碱)等[6]。但NK细胞与这些药物的联合应用的研究目前仍较少，效果与机制尚不明确，有待进一步研究确定。

5. 总结

AML患者近年来在个性化和替代性治疗上有了一定的进步，但是对于AML患者的治疗需求仍然不能得到满足。因此，针对AML患者的治疗热点仍然是寻找复发率低、生存期长、不良反应较轻的治疗方法。NK细胞输注的治疗策略具有广阔的前景，但上述研究结果对于晚期患者如复发性或难治性AML患者来说只是暂时性和非治愈性的。因此，如何寻求一条能让患者得到长久舒缓的自然之路，就变得格外重要。这促使我们需要更好地了解NK细胞对于AML的作用机制及肿瘤免疫逃逸机制，了解NK细胞的发育过程和它在疾病中的作用，探寻在AML患者治疗上的新机会。

NOTES

^*通讯作者。