单细胞测序技术在癫痫疾病中的应用进展

Progress in the Application of Single Cell Sequencing Technology in Epilepsy Disease

摘要: 癫痫(epilepsy)是一种由多种病因导致的大脑神经元高度同步化异常放电所致的慢性脑功能障碍综合征，未经过系统治疗的癫痫患者生活质量普遍较低。单细胞测序是在单个细胞分辨率下对遗传信息进行测序，相比于传统测序更加准确，可以对细胞进行无偏见地分类、构建细胞图谱，为癫痫疾病的研究提供新途径。本文主要介绍单细胞测序技术的发展及在癫痫疾病中的应用现状，并对其发展前景进行展望。

Abstract: Epilepsy is a chronic brain dysfunction syndrome caused by highly synchronized abnormal discharge of brain neurons caused by various causes. The quality of life of epilepsy patients without systemic treatment is generally lower. Single cell sequencing is to sequence genetic information at the resolution of a single cell, which is more accurate than traditional sequencing, and can classify cells without bias and construct cell maps. It can provide a new way for the study of epilepsy disease. In this paper, the development of single cell sequencing technology and its application in epilepsy are introduced, and its development prospect is prospected.

1. 引言

癫痫(epilepsy)是一种由多种病因导致的大脑神经元高度同步化异常放电所致的慢性脑功能障碍综合征，具有反复性、突发性和暂时性等特点[1]。最新流行病学数据显示，据统计全球约7000万的癫痫患者，我国患病率为4.6‰~7.0%，每年以(28.8~35.0)/10万的速度增长[2]。癫痫的病因多种多样与多种因素相关，如遗传、代谢、结构、免疫等等。目前癫痫的治疗手段主要以药物治疗为主，以控制发作和预防复发，对于有明确的癫痫灶、抗癫痫药物治疗无效或效果不佳者可以进行癫痫的外科治疗。虽然癫痫的诊疗已经经过多年的研究，但对于癫痫病因的研究和治疗耐药等问题仍然存在。随着单细胞测序(single cell sequencing, sc-Seq)技术飞速地发展并且广泛应用于各个医学领域，为我们研究疾病发病机制，探索新的治疗方法提供新途径。不同于传统大量细胞样品测序方法，sc-Seq是在单个细胞分辨率下对遗传信息进行测序，可以测得细胞样品中每一个细胞的各种组学数据，明确样本中包含的细胞类型，为明确癫痫疾病病因、发病机制，设计靶向药物提供新途径。

2. 单细胞测序技术的概况

2.1. sc-Seq的发展

单细胞测序技术是在单个细胞分辨率下对生物遗传物质测序，相比于传统的测序技术，单细胞测序在探索细胞的异质性方面具有独特的优势。从上世纪70年代开始，科学家们就开始尝试研究单个细胞的核酸信息，但限制于当时的技术，很难进行高通量、高精度的单细胞分析，直至2009年，科学家们首次提出了sc-Seq [3]。单细胞技术以其在单个细胞分辨率下进行测序的特点在医学、生物学、化学、物理学等多个领域有着广泛的应用。目前sc-Seq主要包括单细胞转录组学、基因组学、蛋白质组学、表观基因组学和相互作用组学测序[4]，以单细胞转录组测序(single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq)应用最为广泛。以下就scRNA-seq的一般步骤进行简单的描述，scRNA-seq方法遵循相同的一般工作流程：样本的分离和捕获、细胞裂解、条形码逆转录和cDNA扩增、文库制备和测序以及下游分析[5] [6]。单细胞分离和捕获显然是最关键的，因为它们决定了扩增材料的准确性和数量[4]；由于单个二倍体细胞的遗传物质核酸含量极低，不足以进行sc-Seq [7]，因此条形码逆转录和cDNA扩增也是进行scRNA-seq的关键一步。

2.2. sc-Seq在神经病学研究中的作用

sc-Seq作为一种新型的测序技术，自从2009年提出后就被广泛应用于医学领域，sc-Seq在单个细胞分辨率下进行测序，对于单个细胞特点的描述更有优势，近年来sc-Seq在肿瘤学、免疫学和神经病学研究中应用广泛，同时在器官移植方面的应用报道也有[8]。在单细胞测序中scRNA-seq是运用最广泛的，故这里主要列举scRNA-seq在神经病学研究中的一些运用。

2.2.1. 构建细胞图谱

scRNA-seq可以进行脑细胞细胞图谱的构建，对研究脑细胞功能和脑部疾病有极大的帮助。Polioudakis [9]对大量脑皮质细胞进行了RNA测序，创建了发育中的人皮层的高分辨率单细胞基因表达图谱，首次对以前未表征的细胞类型进行单细胞表征，包括人亚板神经元、与块状组织的比较以及技术因素的系统分析，将细胞周期进程与神经发生过程中的早期细胞分化联系起来，证明分化发生在转录组连续体上；分化细胞不仅表达少数驱动细胞分化的转录因子，而且在末期之前表达广泛的混合细胞型转录组。Su [10]等人用单细胞测序对人类海马体中神经胶质细胞在整个出生后生命周期中的转录组图谱，对星形胶质细胞、少突胶质细胞谱系和小胶质细胞的详细分析确定了具有不同分子特征的亚群，并揭示了它们与特定生理功能、年龄依赖性丰度变化和疾病相关性的关联。Yaqubi [11]对小胶质细胞进行了详细的单细胞RNA测序分析，表明产前小胶质细胞相对于其出生后小胶质细胞具有独特的转录和调节特征，其中包括吞噬途径的上调。轨迹分析表明，小胶质细胞在整个发育过程中采用的转录特征是对不断变化的微环境的响应，并不反映预定的发育状态。该分析为人类小胶质细胞的发展提供了独特的见解，并为了解小胶质细胞对发育和与年龄相关的人类疾病的贡献提供了参考。

2.2.2. 探索脑肿瘤异质性

在脑肿瘤疾病中，scRNA-seq为癌症异质性、肿瘤微环境、治疗耐药性和侵袭模式也提供了宝贵的见解[12]。Ochocka [13]团队运用scRNA-seq揭示了神经胶质瘤相关脑巨噬细胞的功能异质性，他们展示了幼稚和GL261胶质瘤小鼠中CD11b髓样细胞的单细胞RNA测序，揭示了小胶质细胞、浸润单核细胞/巨噬细胞和中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)边界相关巨噬细胞的不同特征，发现神经胶质瘤激活的男性小胶质细胞中MHCII编码基因的表达较高，而神经胶质瘤激活的小胶质细胞中的性别特异性基因表达可能与神经胶质瘤患者的发病率和结果有关。

3. sc-Seq在癫痫疾病中的应用

3.1. sc-Seq在癫痫疾病发病机制研究中的应用

癫痫的病因复杂多样，往往是多种因素共同作用的结果，经典的流行病学研究表明，在大约四分之一的癫痫病例中，存在明显的潜在获得性病因；常见原因包括中风、脑肿瘤、头部受伤、脑部感染和退行性疾病。在其余四分之三的病例中，潜在的病因尚不清楚[14]。近年来，在越来越灵敏的磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)、自身免疫性病因和孟德尔癫痫中可检测到的细微脑部病变已被证明占未解决病例的一部分，但在大多数癫痫患者中，潜在的病因仍然不明显[14]。单细胞测序技术的出现势必会给癫痫病因探索带来新的发现。

Fang [15]等人利用sc-Seq对创伤性癫痫(post-traumatic epilepsy, PTE)和遗传性癫痫(hereditary epilepsy, HE)的发病分子机制进行了研究，他们分别从一名PTE患者和一名HE患者中分离出海马组织，并对样本进行单细胞转录测序，确定了PTF和HE脑皮质细胞分组的差异以及不同细胞的转录组，PTE和HE在细胞分组上的差异主要如下：HE较PTE中的少突胶质细胞和星形胶质细胞数量更多，小胶质细胞和神经元数量更少，而星形胶质细胞和小胶质细胞的神经胶质细胞在癫痫中得到了深入研究，结果揭示了神经胶质细胞功能与兴奋性突触与抑制性突触的功能失衡之间的关联。这主要与神经胶质细胞参与中枢谷氨酸代谢有关，故神经胶质细胞减少是PTE的重要特点之一；此外小胶质细胞和星形胶质细胞中的DEGs (differentially expressed genes, DEGs)还参与细胞损伤后的炎症反应，主要涉及IL-17信号通路。最终fang等人推测IL-17信号通路可能是小胶质细胞和星形胶质细胞中PTE的治疗靶点和生物标志物。研究炎症和免疫功能可能是研究神经元PTE的最佳方法。Aimeida [16]在分析NOX2 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 2, NOX2)和MyD88 (myeloid differentiation primary response 88, MYD88)在癫痫发病中的作用时讨论了采用单细胞RNA测序转录组学分析、转基因技术和携带具有特定启动子的载体的病毒血清型来揭示与氧化应激和神经炎症相关的基因在癫痫中的作用。利用scRNA-seq评估细胞类型特异性的转录组学谱，他们同样得出小胶质细胞和星形胶质细胞在癫痫发生和发展中发挥着重要作用的结论，这与多数学者得出的结论一致[17] [18]，除此之外他们还分析了用scRNA-seq研究动物模型和手术提取的神经组织癫痫发生的不同时间点的NOX2和MyD88转录组通路，表明了用该技术研究氧化应激调节和炎症反应的可能性。Gao等[19]人利用单细胞测序技术研究皮层发育不良所致癫痫的发病机制，构建了人脑皮层细胞的细胞图谱，并对其进行详细地分组，同时研究了患者和对照组星形胶质细胞信号通路的差异。最终推测脑皮层的发育与星形胶质细胞亚群4有关，对患者和对照组差异基因对比，推测GNA01、GABRA2和SLC38A1基因及基因相关产物基因可能通过GABA能信号通路影响星形胶质细胞的增殖从而导致皮层发育不良所致癫痫的发生。

以上学者通过scRNA-seq数据对癫痫疾病的研究表明癫痫的发病与小胶质细胞和星形胶质细胞以及GABA能信号通路有关，同时也发现许多相关基因，这与先前研究结果是一致的，但对于细胞亚群的分类及研究更加的精细。

3.2. sc-Seq在癫痫治疗药物研究中的应用

目前癫痫的一线治疗仍然为药物治疗，目的是控制癫痫患者的症状，预防复发，传统抗癫痫药物(antiseizure medication, ASM)包括苯妥英钠、丙戊酸钠、卡马西平、苯二氮卓类等，但仍有三分之一的患者会转归为难治性癫痫，即两种以上传统ASM治疗无效。对于难治性灶性性癫痫患者外科手术也治疗手段之一，反应性神经刺激(Responsive neurostimulation, RNS)亦是一种新型的治疗手段，也是不适于手术治疗的药物难治性癫痫患者的一种新的姑息疗法[20] [21]。故对于抗癫痫药物的抗癫痫机制和新药物的研究是刻不容缓的。Michael R. Johnsonz [22]在《抗癫痫药物发现的系统级框架》一文中分析了sc-Seq用于抗癫痫药物研究中的可行性。Xv [23]等人用Magama软件及整合单细胞测序数据验证奥卡西平的抗癫痫机制，他们先后对比了奥卡西平的药物靶点基因和癫痫的致病基因，发现奥卡西平的药物靶点中SCN1A、SCN7A、CN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3B与癫痫GWAS关联性最强，除此之外还分析了奥卡西平靶基因和稀有变异癫痫危险基因的相关性，最后还进行了奥卡西平靶基因EWCE分析和奥卡西平靶向通路富集途径分析。最终得出结论，奥卡西平主要富集于下丘脑GABA能神经元和MSN。在中枢神经系统，GABA受体在神经元和胶质细胞中均有表达。GABA能系统是脑内神经元兴奋性的主要抑制因子，突变会干扰GABA受体的离子通道运输特性。GABA与GABA受体结合导致通道开放，允许氯离子流入，突触后膜超极化，导致神经元电活动的快速抑制，而奥卡西平通过增加GABA受体表达发挥作用。该研究对奥卡西平抗癫痫机制有了更进一步的认识，为临床用药提供了理论依据。

4. 总结及展望

人类的大胆创新，反复实验所带来的科技变革，推动着现代医学的不断发展，科技发展提升了人们的健康福祉，单细胞测序(single cell sequencing, sc-Seq)技术亦是科技进步的产物。sc-Seq相比于传统的多细胞水平的测序更加准确，可以无偏见地对细胞进行分类，可以应用于神经病学，免疫学，肿瘤学和遗传学等各个领域，为现代医学研究提供新技术、新路径。目前sc-Seq更多地是应用于肿瘤学的研究中和生殖胚胎方向，虽然该技术可以用于神经病学的研究，但国内在癫痫疾病的研究中还是少见的，单细胞测序技术仍然在发展革新中，未来sc-Seq在癫痫疾病相关基因、发病机制、信号通路以及靶向药物的研究中将会是不可或缺的技术。

基金项目

课题1：内蒙古医科大学面上项目：蒙药朝伦雄胡-5对难治性癫痫大鼠模型干预作用机制研究(项目编号：YKD2022MS032)；课题2：内蒙古医科大学青年项目：蒙药朝伦雄胡-5对难治性癫痫大鼠模型中VEGF表达影响的研究(项目编号：YKD2024QN002)；课题3：国家自然科学基金项目：癫痫大鼠模型中sema3F与VEGF相关性研究(项目编号：8226050455)。

NOTES

^*通讯作者。