葫芦素B、E的抗肿瘤作用和机制研究进展

Research Progress on the Anti-Tumor Effects and Mechanisms of Cucurbitacin B and E

摘要: 癌症是世界各国首要的死亡原因，也是影响预期寿命的重要障碍，癌症防治形势严峻，因此亟需探索出好的治疗途径和有效的药物。葫芦素B、E是从葫芦科植物甜瓜、黄瓜、西瓜、丝瓜等植物中提取出来的一类高度氧化的葫芦烷型四环三萜类物质。在抗癌研究中显示出对多种癌细胞具有增殖抑制和抗转移的活性，其机制可能与破坏细胞骨架、干扰F-肌动蛋白、诱导细胞周期阻滞、诱导凋亡自噬、促进DNA损伤、诱导活性氧(ROS)形成以及诱导铁死亡有关，本文就葫芦素B、E的抗肿瘤作用和机制做一综述。

Abstract: Cancer is the leading cause of death and a major obstacle to life expectancy in all countries of the world, and the situation of cancer prevention and treatment is grim, so there is an urgent need to explore good therapeutic avenues and effective drugs. Cucurbitacin B and E are a class of highly oxidized cucurbitane-type tetracyclic triterpenoids extracted from cucurbit plants such as melon, cucumber, watermelon, loofah, and so on. In anticancer studies, they have shown proliferation inhibition and antimetastatic activity against a variety of cancer cells, and their mechanisms may be related to the destruction of the cytoskeleton, interference with F-actin, induction of cell cycle arrest, induction of apoptosis and autophagy, promotion of DNA damage, induction of reactive oxygen species (ROS) formation, and induction of ferroptosis. This article provides a review of the antitumor effects and mechanisms of cucurbitacin B and E.

1. 引言

2020年，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布了全球癌症数据的统计结果，全球新发癌症病例约1930万例，近1000万人死于癌症。女性乳腺癌已超过肺癌，成为最常诊断的癌症，估计有230万新发病例(11.7%)，其次是肺癌(11.4%)、结直肠癌(10.0%)、前列腺癌(7.3%)和胃癌(5.6%)。肺癌仍然是癌症死亡的主要原因，估计有180万人死亡(8%)，其次是结直肠癌(9.4%)、肝癌(8.3%)、胃癌(7.7%)和女性乳腺癌(6.9%) [1]，因此癌症防治形势严峻。

葫芦素(cucurbitacins)是从葫芦科植物中提取得到的苦味苷元成分，是一类高度氧化的四环三萜类化合物，至今已发现几十种[2]-[5]。主要分类包括葫芦素A、B、C、D、E、F、I、J、K、L以及23,24-二氢葫芦素和葫芦素葡萄糖苷等，它们在抗癌、抗炎等方面展现出不同的生物活性[6]-[8]。既往研究报道了葫芦素对多种人类癌细胞的抗癌作用，包括肝癌、骨肉瘤、喉鳞癌、肺癌、结肠腺癌、神经母细胞瘤和白血病[9]-[13]。其中葫芦素B (Cucurbitacin B)和葫芦素E (Cucurbitacin E)是葫芦素家族中的两种重要成员，它们在抗癌研究中显示出对多种癌细胞具有增殖抑制、凋亡诱导和转移抑制等活性[14]-[20]。葫芦素B、E的结构见图1，本文就其抗肿瘤作用和机制做一综述。

Figure 1. The chemical structure formula of Cucurbitacin B, Cucurbitacin E

图1. 葫芦素B、葫芦素E化学结构式

2. 抗肿瘤作用

2.1. 对各种肿瘤的细胞毒作用

葫芦素B对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用具有明显的时间和浓度依赖关系，作用48小时的IC₅₀为248.1 nM [21]。葫芦素B对非小细胞肺癌H1975细胞有一定的增殖抑制作用[22]，对人前列腺癌DU145细胞的增殖抑制作用呈剂量、时间依赖性[23]。葫芦素B能显著抑制人结肠癌细胞HCT-116增殖，半数抑制浓度(IC₅₀)是64.48 nM [24]。

葫芦素B对多种人类乳腺癌细胞系具有抗增殖活性，葫芦素B作用于乳腺癌细胞系MDA-MB-231、ZR-75-1、MCF-7、T47D、BT474、MDA-MB-453 48小时后，对以上细胞系抑制50%生长的平均有效剂量(ED₅₀)从3.03 × 10⁻⁸到4.18 × 10⁻⁷ M不等[25]。

Yang BB等[26]在对葫芦素类化合物的抗癌活性研究中发现葫芦素E具有较强且广泛的抗肿瘤作用，能显著抑制包括雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系MCF-7，前列腺癌细胞系PC-3，胃癌细胞系NCI-N87和三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468、MDA-MB-231、HCC1806、HCC1937和SW527在内的人类癌细胞系的增殖。Liu Y等[27]通过MTT实验评估了葫芦素E对肝癌细胞Huh7的增殖抑制作用，结果显示葫芦素E以浓度和时间依赖性的方式显著抑制了细胞增殖。

Wang X等[28]研究发现葫芦素B、E和I对人宫颈癌细胞系Hela、人乳腺癌细胞系MCF-7、人骨肉瘤癌细胞系U2OS三种细胞系均表现出更强的细胞毒性，IC₅₀值在6.43 nM至64.67 nM之间。

因此葫芦素对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用。

2.2. 对肿瘤侵袭和转移的作用

肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤转移过程中的一个关键步骤，抑制这一步骤是抗肿瘤治疗的一个有效途径[29]。Sun Y等[9]研究发现葫芦素B (0~100 nM)处理MDA-MB-231细胞2小时后观察到了浓度依赖性的显著形态变化，在0.5~12小时内对MDA-MB-231细胞没有显著的细胞毒性，即使处理时间长达24小时，100 nM葫芦素B处理组的细胞活力仍保持在80%以上。这种低浓度剂量依赖性的形态变化特性提示：葫芦素B在低浓度时展现出作为抗癌转移药物的潜力。

付康等[21]研究发现在细胞划痕实验中，5 μM浓度的葫芦素B能显著抑制人肝癌细胞HepG2的迁移能力。Zhang Tao等[30]研究发现：葫芦素E在体内外对乳腺癌的转移都有抑制作用，在动物实验中，腹腔注射葫芦素E可显著抑制乳腺肿瘤向肺的转移，而不影响接种的4T1和MDA-MB-231乳腺癌细胞的凋亡和增殖；在体外，葫芦素E通过靶向Arp2/3复合体来抑制乳腺癌细胞的肌动蛋白聚合，这对于维持细胞迁移所需的细胞骨架结构至关重要，葫芦素E还抑制了Src/FAK/Rac1/MMP等蛋白参与的信号通路，这些蛋白在细胞粘附、迁移和侵袭过程中起着关键作用。Luo WW等[17]研究发现：葫芦素B显著抑制了MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭和对基底膜、纤维连接蛋白、I型胶原及内皮细胞的粘附。

Liu Y等[27]研究发现葫芦素E对肝癌细胞Huh7的侵袭转移具有显著的抑制作用。葫芦素E通过干扰细胞骨架的重组，减少了侵袭性细胞的迁移和侵袭能力。实验中，使用创伤愈合实验和transwell侵袭实验观察到葫芦素E显著减少了Huh7细胞的迁移和侵袭。此外，葫芦素E还显示出了强大的抗血管生成活性，减少了HUVECs的管状结构形成，并在CAM实验中抑制了新血管生成。研究发现葫芦素E通过调节包括MAPKs和JAK-STAT3在内的多种药理信号通路发挥作用。特别是，葫芦素E抑制了ERK和p38的磷酸化，同时增加了JNK的表达，表明其通过正向调节JNK途径和负向调节ERK/p38途径来抑制细胞迁移和侵袭。

总之，葫芦素可能通过抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭来抑制乳腺癌的转移。

2.3. 体内抗肿瘤活性

为了确定葫芦素B在体内抑制肿瘤生长的能力，Wakimoto Naoki等[25]评估了葫芦素B对雌性裸鼠乳房中原位生长的MDA-MB-231人乳腺癌细胞的抗肿瘤活性。植入后第二天开始治疗，每周腹腔注射三次，通过卡尺测量监测肿瘤体积。葫芦素B有效抑制MDA-MB-231肿瘤的生长(与对照相组比抑制率为50.1%)，葫芦素B处理的小鼠中解剖的肿瘤重量显著低于媒介物处理的小鼠，因此葫芦素B抑制裸鼠MDA-MB-231肿瘤生长。

沈杭等[31]研究发现，葫芦素E能够诱导裸鼠体内人原位移植的肝癌细胞(HepG2)发生凋亡。体内实验显示，葫芦素E通过提高Bax蛋白的表达，促进了裸鼠人原位移植肝癌细胞的核酸断裂。

3. 抗肿瘤的机制

3.1. 对细胞骨架的影响

细胞骨架是由微管蛋白、肌动蛋白和中间丝蛋白这三种蛋白质组成的复杂网络结构，它不仅是细胞的内部支撑结构，还在细胞的运动、黏附、形态改变、有丝分裂和凋亡等多种生命活动中发挥关键作用。细胞骨架的动态重塑对细胞行为的调控至关重要，它通过参与信号转导和与细胞黏附、凋亡等细胞活动的相互作用，影响肿瘤细胞的侵袭性和转移能力[32]。

在光学显微镜下，MDA-MB-231、ZR-75-1、MCF-7、T47D、BT474、MDA-MB-453上述所有乳腺癌细胞系在暴露于葫芦素B后都表现出快速的形态变化，包括细胞质体积减少和细胞表面伪足损失。时程实验表明，MCF-7添加葫芦素B (5 × 10⁻⁷ M)后3分钟内发生F-actin蛋白网络破坏，随后在葫芦素B处理后15分钟发生微管破坏。葫芦素B对细胞骨架的破坏可能导致细胞失去迁移和侵袭的能力，显示出潜在的抗转移效果[25]。

葫芦素B处理MCF-7和MDA-MB-231细胞后，观察到细胞萎缩和形状变圆等快速而显著的形态变化，这表明微管网络可能受到了干扰。为了研究葫芦素B对细胞微管结构的影响，研究人员用葫芦素B处理细胞15分钟后，使用抗α-微管蛋白抗体和DAPI分别进行微管蛋白和细胞核染色，并通过共聚焦显微镜分析。结果显示，与对照组相比，处理过的细胞中α-微管蛋白出现了明显的聚集。研究人员后续在无细胞体系中使用微管聚合试验试剂盒，进一步确定葫芦素B是否能抑制微管组装。实验中，将牛脑微管蛋白与不同浓度的葫芦素B混合，并监测其对微管蛋白聚合的影响。结果显示，即使在最高浓度下，葫芦素B也没有破坏微管蛋白的聚合，这表明它与直接作用于微管组装的药物(如紫杉醇和长春新碱)的作用机制不同。综上所述，葫芦素B导致α-微管蛋白聚集，但并不直接影响微管的组装过程[33]。

Wang X等[28]系统地研究了葫芦素在与细胞骨架微管和肌动蛋白丝相关的生物过程中的作用。数据表明，葫芦素B、E和I与人宫颈癌细胞系Hela和人骨肉瘤癌细胞系U2OS细胞骨架的相互作用主要通过解聚和聚集影响肌动蛋白丝，这提供了证据表明肌动蛋白可能是葫芦素的关键靶点之一。

Sörensen PM等[34]研究发现葫芦素E是一种天然产物，能够抑制肌动蛋白解聚，特别是它通过与丝状肌动蛋白(F-actin)中的半胱氨酸257 (Cys257)形成共价键来特异性结合F-actin，而不与单体肌动蛋白(G-actin)结合。在活细胞中，葫芦素E能够抑制肌动蛋白解聚，从而影响细胞骨架的动态变化。此外，葫芦素E对细胞骨架的影响是不可逆的，这表明它可能通过改变肌动蛋白丝的稳定性来长期影响细胞结构和功能。这些特性使得葫芦素E成为一个有用的工具，用于研究细胞内肌动蛋白动态以及肌动蛋白基础过程，如细胞分裂。

综上，葫芦素可能通过干扰微管的稳定性和组织来影响癌细胞的形态和细胞骨架，这可能与其抗增殖和抗转移的活性有关。微管是细胞骨架的重要组成部分，对维持细胞形态、分裂和迁移等关键生物学过程至关重要。

3.2. 对细胞周期的干预作用

葫芦素能诱导肿瘤细胞周期G2/M期阻滞。葫芦素B能够诱导人前列腺癌DU145细胞的G2/M期阻滞，使DU145细胞的细胞周期调节蛋白Cyclin B1蛋白表达降低[23]。葫芦素B可以诱导乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7的细胞周期停滞在G2/M期，且葫芦素B处理的MDA-MB-231细胞中G2/M期的百分比高于MCF-7细胞[33]。

Yang L等[35]研究发现23,24-二氢葫芦素B以剂量和时间依赖的方式抑制了包括Bcap37、HeLa、SW620、SMMC-7721、K562和MCF-7在内的人乳腺癌等癌细胞系的增殖。其中最敏感的细胞是乳腺癌Bcap37细胞。23,24-二氢葫芦素B对人乳腺癌细胞Bcap37的增殖抑制作用是通过诱导细胞周期G2/M期停滞和线粒体依赖性细胞凋亡来实现的。

Yang BB等[26]为了测试葫芦素E是否调节三阴性乳腺癌细胞中的细胞周期，用几种不同剂量(0、50、100和200 nM)的葫芦素E处理MDA-MB-468和SW527细胞24小时，然后检测细胞周期分布。结果表明，在MDA-MB-468和SW527细胞系中，葫芦素E以剂量依赖性方式显著增加了处于G2/M期的细胞百分比，葫芦素E诱导的G2/M期阻滞达到了其峰值为100 nM。进一步增加葫芦素E剂量(200 nM)似乎并未显着增加MDA-MB-468和SW527系中G2/M期细胞的百分比。

Liu Y等[27]研究发现葫芦素E处理导致肝癌细胞Huh7细胞周期的G2/M期阻滞，这可能是通过调节细胞周期相关蛋白，如cyclin A、cyclin B1和CDK1的表达实现的。

3.3. 诱导肿瘤细胞发生凋亡或自噬

黄擎擎等[36]研究发现葫芦素B对乳腺癌MCF-7细胞的凋亡和自噬具有显著影响。使用20 μM的葫芦素B处理MCF-7细胞后，通过Hoechst33258染色实验在荧光显微镜下出现：细胞核染色质的浓缩、聚集，部分细胞核碎裂，以及凋亡小体的形成，且随着葫芦素B浓度的增加，凋亡效果变得更加明显。这些观察结果表明葫芦素B能够以浓度依赖性的方式诱导乳腺癌细胞的凋亡。Western Blot实验检测LC3蛋白，发现20 μM葫芦素B可明显升高LC3-II与LC3-I的比值，降低P62含量，提示葫芦素B可诱导MCF-7细胞自噬。

葫芦素B处理后，人前列腺癌DU145细胞核出现染色质浓缩、核固缩、核碎裂等凋亡典型形态变化。流式细胞仪检测结果显示，葫芦素B诱导DU145细胞凋亡，且呈现剂量依赖性[20]。葫芦素B抑制STAT3/Bcl-2的表达诱导非小细胞肺癌H1975细胞凋亡[16]。

Hsu HL等[37]研究表明葫芦素E通过促进依赖p62的自噬来诱导人类非小细胞肺癌A549细胞周期阻滞在G2/M和subG1阶段，从而导致DNA损伤和凋亡，对A549细胞具有显著的抑制增殖和促进凋亡的活性。首次观察到葫芦素E诱导的不完全自噬，其特征是LC3B-II表达增加和p62积累。p62的敲低可以挽救细胞免受葫芦素E介导的抗增殖效应、凋亡、DNA损伤和ROS产生的影响。这些发现表明葫芦素E是一个有前途的药物候选物，可能对非小细胞肺癌(NSCLC)患者提供新的治疗选择。

何小燕等[38]研究发现葫芦素E通过下调白细胞介素1受体相关激酶1 (IRAK1)的表达，促进肺癌H1299细胞的凋亡和自噬。研究发现，葫芦素E处理后，H1299细胞的凋亡率和自噬水平显著提高，与凋亡和自噬相关的蛋白如Bcl-2、Bax、Beclin1、ATG5以及LC3II/I的表达水平发生变化，同时，IRAK1的表达水平降低。此外，通过siRNA技术敲低IRAK1或使用pcDNA提高IRAK1的表达，可以进一步证实IRAK1在葫芦素E诱导的凋亡和自噬中起着关键调控作用。这些结果表明，葫芦素E可能通过调控IRAK1影响肺癌细胞的凋亡和自噬过程，为葫芦素E作为潜在的抗肺癌药物提供了新的机制见解。

3.4. 诱导活性氧(ROS)的产生

Luo WW等[17]研究发现葫芦素B可诱导细胞内活性氧的产生，而N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)可降低活性氧的产生。NAC预处理可逆转葫芦素B诱导的迁移粘附抑制以及粘着斑激酶(Focal Adhesion Kinase, FAK)的表达变化。提出葫芦素B可能通过FAK途径抑制ROS介导的乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭和粘附。

Ren G等[5]研究发现葫芦素B以浓度依赖性方式显著抑制MCF-7细胞的增殖。此外，葫芦素B处理可导致活性氧(ROS)形成增加。NAC处理后葫芦素B诱导MCF-7细胞的DNA损伤、自噬以及ROS的产生均可被逆转。提示葫芦素B诱导MCF-7细胞中的DNA损伤和自噬可能是由ROS介导的。综上所述，这些结果表明葫芦素B诱导MCF-7细胞中的DNA损伤和自噬可能由ROS介导，这为葫芦素B的抗癌分子机制提供了新的见解。

Ma G等[39]研究发现，葫芦素E能够通过浓度依赖性方式增加肺癌细胞95D内的活性氧(ROS)生成，这种增加的ROS能够诱导细胞凋亡和自噬。葫芦素E降低了细胞活力，抑制了克隆形成，并通过Bcl-2家族蛋白和caspases诱导了凋亡。此外，葫芦素E还通过AKT/mTOR途径诱导了保护性自噬，这一过程同样受到ROS的调控。NAC的预处理部分逆转了葫芦素E诱导的caspase-3、caspase-7和PARP的裂解，以及自噬标记蛋白LC3II的表达，表明葫芦素E诱导的细胞死亡和自噬过程与ROS的形成密切相关。这些发现为葫芦素E的抗癌效果提供了新的视角，并揭示了ROS在葫芦素E诱导的细胞凋亡和自噬中的重要作用。

3.5. 诱导铁死亡

刘致远等[24]研究发现葫芦素B可以降低人结肠癌细胞HCT-116内GSH的含量、促进总铁离子的积累和LDH的释放，并且铁死亡抑制剂Fer-1能够逆转葫芦素B诱导的LDH释放。网络药理学分析和代谢组学分析结果指出，葫芦素B抑制结肠癌的作用机制与铁死亡密切相关的谷胱甘肽代谢途径有关。因此本研究指出葫芦素B在人结肠癌细胞HCT-116中可能通过诱导铁死亡来发挥抗癌作用。

洪婷等[40]研究表明，葫芦素B能够通过促进肝癌细胞Huh-7谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)的泛素化和降解，降低细胞内GPX4的mRNA和蛋白水平，进而导致细胞内活性氧(ROS)、脂质过氧化水平和细胞内Fe²⁺浓度显著增加，同时减少细胞内谷胱甘肽(GSH)水平，破坏Nrf2/HO-1抗氧化系统，最终诱导肝癌Huh-7细胞发生铁死亡，从而抑制其增殖。这些发现揭示了葫芦素B作为一种潜在的抗肝癌药物，通过诱导铁死亡发挥作用的新机制。

4. 结语

这些结果可以更全面地了解癌细胞对葫芦素的反应变化。为了更好地理解这些结果并在化疗中使用葫芦素，需要进行更多的分子水平研究。

基金项目

国家自然科学基金项目(82360797、81960739)；云南郎靖瑜专家工作站(202305AF150054)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。