摘要: 目的：基于网络药理学及分子对接技术探讨银翘散“异病同治”小儿急性上呼吸道感染(AURIC)与川崎病(KD)的共同潜在靶点及作用机制。方法：通过TCMSP数据库中查找银翘散中药物的潜在的活性化合物及靶点，通过Drug Bank，Gene Cards，TTD，OMIM和Pharm GKB数据库得到与AURIC、KD相关的靶基因。构建“药物–成分–靶点”网络，对交集靶蛋白进行GO和KEGG分析。最后对预测靶标和化合物进行分子对接验证。结果：获得108个活性成分，对应靶点257个，筛选疾病药物共同靶标142个，KEGG通路富集显示IL-17、PI3K/Akt、TNF是AURIC、KD相关的疾病通路。分子对接结果表明银翘散与BCL2、ESR1、TP53、MAPK1、AKT1均具有较强的结合活性。结论：银翘散对治疗AURIC、KD的异病同治作用具有多成分、靶点、多通路的特点。
Abstract: Objective: To investigate the common potential targets and mechanisms of action of Yin Qiao San in the treatment of paediatric acute upper respiratory tract infection (AURIC) and Kawasaki disease (KD) based on network pharmacology and molecular docking technology. Methods: The potential active compounds and targets of Yin Qiao San were identified in TCMSP database, and the target genes related to AURIC and KD were obtained from Drug Bank, Gene Cards, TTD, OMIM and Pharm GKB databases. A drug-component-target network was constructed, and GO and KEGG analyses were performed on the intersecting target proteins. Finally, the predicted targets and compounds were verified by molecular docking. Result: The results showed that 108 active ingredients were obtained, corresponding to 257 targets, and 142 common targets were screened. KEGG pathway enrichment showed that IL-17, PI3K/Akt, and TNF were the disease pathways related to AURIC and KD. The molecular docking results showed that Yin Qiao San had strong binding activity with BCL2, ESR1, TP53, MAPK1, AKT1. Conclusion: The heterogeneous and homoeopathic effects of Yin Qiao San on the treatment of AURIC and KD are characterised by multiple components, targets and pathways.
1. 引言
小儿上呼吸道感染(acute upper respiratory infection in children, AURIC)是最常见的儿科疾病，由各种病原体所引起，其中病毒感染可占原发性上呼吸道感染的90%以上[1]。西医治疗一般以抗感染、解热镇痛等对症处理为主[2]。川崎病(Kawasaki disease, KD)，是一种以全身急性血管炎性病理改变为主的自身免疫性疾病，发病机制及病因尚不清楚，是儿童后天性心脏病主要病因[3]。近年来认为KD的发病与感染、遗传易感性及免疫反应显著相关[4]。病毒感染[5]、CD40、BLK基因变异[6]、免疫异常活化[7]都与KD息息相关。西医治疗上以丙球蛋白联合大量阿司匹林为治疗为主[8]。AURIC在中医上称为“感冒”，以“疏风解表”为基本治疗原则[9]。KD在中医学上没有与之对应的中医疾病，但根据其临床特征，KD在中医上应属“温病”范畴，多数医家认同温毒之邪蕴于肺卫的观点，多采用气营血辩证理论进行治疗[10]。目前临床治疗AURIC和KD的所采用的西药有造成胃肠道损害和增加心血管疾病风险等副作用。银翘散治疗AURIC和KD有很长的历史，具有良好疗效。
银翘散由金银花、连翘、牛蒡子、薄荷、荆芥穗、淡豆豉、桔梗、芦根、竹叶、甘草组成，具有辛凉透表、清热解毒的功效[11]。《中医儿科学》[12]治疗风热型AURIC和邪在卫气型KD时选用银翘散。研究表明银翘散治疗AURIC具有良好的疗效[13]。西医治疗KD的疗效尚不满意，KD对冠状动脉损伤仍然存在。研究发现银翘散联合西药治疗KD可减轻临床症状，减少对冠状动脉损害[14]。综上可见银翘散不仅可以治疗AURIC也可治疗KD。但银翘散同治两种疾病的机制尚不明确。网络药理学从整体角度分析药物和疾病之间的关系和我国传统医学中的整体观念高度重合[15]。本研究旨在“药物–成分–靶点”互作网络的基础上，揭示银翘散治疗AURIC、KD的“异病同治”机制。
2. 材料与方法
2.1. 筛选银翘散的药物成分和靶点
通过TCMSP数据库检索银翘散中中药相关活性，根据OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18进行筛选。检索确定竹叶成分，选用类药性至少两个为YES的成分作为其活性成分得到相应靶点。筛选结束后将靶点基因全部导入Uniprot数据库。
2.2. 银翘散治疗AURIC和KD的共同靶点筛选
分别以“Acute upper respiratory infection in children”、“Kawasaki Disease”和“Mucocutaneous Lymph Node Syndrome”为关键词，分别输入GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD及DrugBank数据库检索靶点去重，导入Venny得到银翘散治疗AURIC和KD的交集，并绘制韦恩图。
2.3. “药物–成分–靶点”网络构建
用Cy-toscape3.10.1软件构建银翘散治疗AURIC、KD的“药物–成分–靶点”网络，进行拓扑分析。
2.4. 蛋白互作PPI网络构建及关键靶点筛选
将交集靶点上传至STRING数据库构建PPI网络，进行可视化，拓扑分析后选取度值前10的靶点，即银翘散异病同治的核心靶点。
2.5. GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
对靶点进行GO分析，绘制成柱状图，再进行KEGG分析，绘制柱状图。将得到的前20条KEGG通路信息导入Cytoscape3.10.1中绘制KEGG通路–基因网络图。
2.6. 分子对接
通过Autodock Vina进行分子对接，分子对接过程中其结合能越低代表受体与配体的亲和力越好，结合能 ≤ 0 kcal/mol，表明化合物与靶点能结合并发生相互作用，将核心靶蛋白与活性化合物结合力较好的对接结果进行3D图展示。
3. 结果
3.1. 筛选银翘散的药物成分和靶点
TCMSP中获得靶点数量：金银花386、连翘437、牛蒡子120、薄荷141、荆芥穗125、淡豆豉20、桔梗83、芦根27、甘草368、竹叶26，去重后得到靶点257个。
3.2. 银翘散治疗AURIC和KD的共同靶点筛选
银翘散与AURIC、KD交集靶点142个，见图1。
Figure1. Venn diagram of the intersecting targets of Yin Qiao San and AURIC and KD
图1. 银翘散和小儿急性上呼吸道感染及川崎病交集靶点韦恩图
3.3. “药物–成分–靶点”网络构建
利用Cy-toscape3.10.1构建药物–成分–靶点网络，见图2。筛选核心成分，结果见表1。
Figure 2. Network drug-ingredient-targets
图2. 药物–成分–靶点图
Table 1. Top 10 active ingredients
表1. 前10位活性成分
Mol ID |
化合物 |
度值 |
来源 |
MOL000098 |
quercetin (槲皮素) |
181 |
金银花、连翘 |
MOL000422 |
kaempferol (山奈酚) |
94 |
金银花、连翘、牛蒡子 |
MOL000358 |
beta-sitosterol (β-谷甾醇) |
46 |
金银花、连翘、牛蒡子 |
MOL001689 |
acacetin (金合欢素) |
39 |
荆芥穗、桔梗 |
MOL000449 |
Stigmasterol (豆甾醇) |
37 |
荆芥穗、芦根 |
MOL002773 |
beta-carotene (β-胡萝卜素) |
37 |
金银花、牛蒡子 |
MOL000471 |
aloe-emodin (芦荟大黄素) |
33 |
薄荷 |
MOL005573 |
Genkwanin (芫花素) |
31 |
薄荷 |
MOL000173 |
wogonin (汉黄芩素) |
30 |
连翘 |
MOL000006 |
luteolin (木犀草素) |
28 |
金银花、连翘、薄荷、桔梗、荆芥穗 |
3.4. 蛋白互作PPI网络构建及关键靶点筛选
Figure 3. (a) PPI network diagram; (b) (c) Protein interaction network of the Yin Qiao San
图3. (a) PPI网络图；(b)、(c) 蛋白互作图
通过STRING进行网络分析，导入Cy-toscape3.10.1构建网络图，图3(a)示。进行第一次拓扑分析，得图3(b)，再次拓扑分析，得图3(c)，最后得到前10靶点，结果见表2。
Table 2. Targets and topology analysis plot (top 10)
表2. 靶点及拓扑分析图结果(前10)
靶点名称 |
靶点信息 |
BC |
CC |
DC |
EC |
BCL2 |
Apoptosis regulator Bcl-2 |
0.9000 |
0.7500 |
12 |
0.3062 |
ESR1 |
Estrogen Receptor 1 |
4.2333 |
0.8181 |
14 |
0.3217 |
TP53 |
Cellular Tumor Antigen P53 |
7.5333 |
1.0000 |
18 |
0.4008 |
MAPK1 |
Mitogen-activated protein kinase 1 |
4.2000 |
0.9000 |
16 |
0.3743 |
AKT1 |
RAC-alphaserine/threonine-protein kinase |
4.0333 |
0.9000 |
16 |
0.3738 |
HSP90AA1 |
Heat shock protein HSP 90-alpha |
0.4000 |
0.6923 |
10 |
0.2644 |
FOS |
Proto-oncogene c-Fos |
0.000 |
0.6429 |
8 |
0.2124 |
MAPK3 |
Mitogen-activated protein kinase 3 |
2.6333 |
0.8181 |
14 |
0.3399 |
CTNNB1 |
Catenin beta-1 |
0.4000 |
0.6429 |
8 |
0.2068 |
CASP3 |
Caspase-3 subunit p12 |
1.6667 |
0.7500 |
12 |
0.2983 |
3.5. GO功能富集分析与KEGG通路富集分析
Figure 4. GO functional enrichment analysis
图4. GO功能富集图
Figure 5. KEGG pathway enrichment analysis
图5. KEGG通路富集结果图
Figure 6. Network of KEGG signaling pathway-Gene
图6. KEGG通路–基因网络图
选取前10绘制GO柱状图，见图4。选出基因数前30的通路制作柱状图，见图5。并绘制KEGG通路–基因网络图，见图6。
3.6. 分子对接
注：(a) BCL2-汉黄芩素；(b) ESR1-芫花素；(c) TP53-木犀草素；(d) MAPK1-木犀草素；(e) AKT1-芦荟大黄素。
Figure 7. Molecular docking view
图7. 分子对接可视图
利用AutoDock Vina进行分子对接。其中，化合物和靶蛋白受体间的结合活性度越高，则两者结合能越低。如“表3”。将5个靶点所对应结合能较高的化合物的分子对接结果进行展示(图7)。
Table 3. Molecular docking results (top 10)
表3. 分子对接结果(前10)
靶点 |
靶点编号 |
蛋白编号 |
分子对接能/(kcal/mol) |
槲皮素 |
山奈酚 |
β-谷甾醇 |
金合欢素 |
豆甾醇 |
β-胡萝卜素 |
芦荟 大黄素 |
芫花素 |
汉黄 芩素 |
木犀 草素 |
BCL2 |
6O0M |
P10415 |
−9.0 |
−8.9 |
−9.3 |
−8.7 |
−9.3 |
−8.6 |
−8.9 |
−9.1 |
−9.5 |
−8.9 |
ESR1 |
1X7R |
P03372 |
−8.9 |
−8.8 |
−7.1 |
−7.9 |
−8.0 |
−7.2 |
−8.8 |
−9.2 |
−8.7 |
−9.0 |
TP53 |
2VUK |
P04637 |
−7.4 |
−7.3 |
−6.9 |
−7.7 |
−7.7 |
−7.8 |
−7.7 |
−7.3 |
−7.1 |
−7.9 |
MAPK1 |
1TVO |
P28482 |
−8.4 |
−8.1 |
−8.1 |
−7.9 |
−8.4 |
−8.7 |
−8.0 |
−8.2 |
−8.2 |
−8.6 |
AKT1 |
4GV1 |
P31749 |
−8.2 |
−8.1 |
−7.8 |
−8.1 |
−8.8 |
−8.9 |
−8.6 |
−7.9 |
−7.8 |
−8.2 |
4. 讨论
近年来，AURIC和KD的患病率呈日益增长趋势。西医认为病毒感染可导致AURIC、KD的发病[16]。中医认为AURIC、KD的病机为邪犯肺卫，常因感受热毒之邪致病，二者具有相同的致病因素。“异病同治”理论起源于《黄帝内经》，是中医辩证论治的特色。即不同的疾病，若促使发病的病机相同，可用一种方法治疗。故银翘散可用于治疗风热型AURIC以及邪在卫气型KD。
银翘散治疗AURIC、KD有效成分包括槲皮素、山奈酚、芦荟大黄素。Domiciano [17]等发现槲皮素可以通过防止ASC寡聚化来抑制NLRP3和AIM2炎症小体，可作为川崎病血管炎潜在候选治疗药物。山奈酚可发挥抗炎、抗氧化作用抑制NF-κB信号通路，进而对上呼吸道感染具有作用[18]。Li [19]等发现芦荟大黄素可以抑制A型流感的复制，起到抗病毒的作用，并且通过抑制血管紧张素II诱导的内皮NLRP3炎症小体活化来保护内皮细胞[20]。BCL2、TP53是银翘散治疗AURIC、KD的潜在靶点。在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞内，BCL-2的表达已被证明可以阻断正粘病毒诱导的细胞凋亡并减少感染后代的产生[21]。TP53能够抑制脂多糖诱导巨噬细胞M1型极化，阻断NF-κB信号通路传导，缓解炎症反应[22]。
KEGG分析发现银翘散与AURIC、KD的密切相关通路有3条。IL-17信号通路对宿主防御、炎症疾病的发病机制进展有重要作用[23]。Th17、IL-6是IL-17的下游因子，Th17细胞及其产生的免疫调节因子在呼吸道感染过程中参加炎症反应[24]。KD急性期产生的IL-6与疾病过程中血管壁损伤以及冠状动脉病变密切相关[25]。TNF信号通路参与细胞增殖、炎症反应以及免疫应答，释放TNF-α，而TNF会影响KD的易感性[26]。另外激活的PI3K/Akt信号通路可以减轻TNF-α对血管内皮组织细胞增殖的抑制作用，从而保护KD冠状动脉内皮细胞的损伤[27]。
本研究发现银翘散可能通过BCL2、TP53、AKT1等关键靶点干预IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、TNF信号通路调节免疫、抑制炎症从而达到“异病同治”AURIC、KD的作用。这为揭示银翘散治疗AURIC、KD的机制提供了参考价值，也为中医“异病同治”的理论提供新思路。但本研究还存在一些不足，研究结论还需要通过体内实验、体外实验和临床试验进一步验证。