1. 引言
膀胱癌是我国泌尿外科最常见的肿瘤，且呈逐年上升趋势[1]。其具有容易复发，且复发后肿瘤分期明显增加等特点[2]。对于非肌层浸润的膀胱癌，保留膀胱的肿瘤局部切除术为治疗的金标准[3]。在该类肿瘤患者中，定期膀胱腔内灌注化疗，仍有10%~40%的患者出现肿瘤复发，且出现肿瘤分期、分级进展[4]。而对于肌层浸润性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer, MIBC)，新辅助化疗联合根治性膀胱切除术(radical cystectomy, RC)是标准的治疗方案[5]。尽管最初的一线治疗是基于顺铂的新辅助化疗，然后是根治性膀胱切除术和淋巴结清扫术，但多达50%的患者可能在手术干预后的两年内发生转移[6]。因此，探讨一种膀胱癌的生物疗法，可对现有的膀胱癌药物提供新的补充。
KAI1基因是一种肿瘤转移抑制基因[7]。最早是在鼠前列腺癌细胞株中分离出来的，发现它具有抑制前列腺癌细胞转移的功能[8]。据目前报道其在多种肿瘤中表达低下。如胰腺癌，肺癌，宫颈癌，卵巢癌，乳腺癌等[9]-[11]。
KAI1基因在膀胱癌中的表达也受到关注。但是其对膀胱癌细胞株的增殖及凋亡的影响却鲜有研究。前期我们研究了该基因在肾癌中的表达及其对肾癌细胞株786-O的增殖，凋亡，侵袭转移的影响。为进一步阐明该基因在膀胱移行细胞癌中的相关作用，本研究团队以人膀胱癌移行细胞株T24为研究对象。探讨该基因在膀胱癌细胞株中的相关作用及可能机制。
2. 材料和方法
2.1. 细胞及主要试剂
膀胱移行细胞癌细胞株T-24由重庆医科大学检验教研室罗春丽教授馈赠。KAI1过表达慢病毒(重庆威斯腾)，RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS) (Gibco)，胰蛋白酶(Hyclone)，DMSO、MTT试剂盒(Sigma)，Trizol试剂盒(Invitrogen公司)、PCR试剂盒(Takara公司)。兔抗人cyclin D1抗体、兔抗人caspase-3抗体(Santa Cruz)。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG (北京中杉金桥公司)。PVDF膜(美国Millipore 公司) 5 × SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL荧光检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)。
2.2. 细胞培养
膀胱移行细胞癌细胞株T-24，接种于含5%胎牛血清RPMI 1640培养基中(含50 × 103 U/L青霉素、50 mg/L链霉素)，于37℃、5% CO2条件下进行常规传代培养。
2.3. KAI1过表达慢病毒感染
具体感染步骤参见参考文献，简言之：重悬细胞，在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5 × 104个目的细胞，铺板时细胞的密度为50%左右，每孔培养基体积为500 μl；进行病毒感染时细胞的密度率约为70%左右。24小时后更换为正常培养液。感染48小时后，用荧光倒置显微镜观察荧光强度。
2.4. QPCR技术
按Trizol试剂盒说明书提取T24胞总RNA，定量后逆转录，逆转录产物进行PCR反应，以β-actin为内参照。KAI1的引物序列：上游为5'-GGCGGCATCGTGACTGAG-3'，下游为5'-TCGCAGGAACAGGGGTAGG-3'，产物长度179 bp。反转录反应条件的设置：25摄氏度10分钟42摄氏度50分钟，85摄氏度5分钟。荧光定量PCR扩增条件的设置：94摄氏度4分钟；94摄氏度20秒60摄氏度30秒72摄氏度30秒循环35次，72摄氏度检测信号。
2.5. Western Blotting分析
收集T24细胞株，4℃条件下加入裂解液中作用30 min，超声碎化后加入5 × SDS上样缓冲液，煮沸5 min。取10 μg蛋白样品于上样孔内，电泳3 h，250 mA恒流条件下转蛋白质至PVDF膜。在TBS-T中封闭1 h，按1:400稀释一抗，将膜与一抗置于塑料袋中封闭，4℃过夜。TBS-T缓冲液洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温缓摇1 h，ECL法显色，于凝胶图像分析系统曝光。
2.6. MTT实验
收集对数生长期的T24细胞。细胞数量调整为1 * 105，将其接种于96孔板，每孔的100 ul，在细胞培养箱中培养24 h。按照MTT试剂盒操作步骤，继续静止培养24 h，加入10 mg/ml的MTT试剂，培养3 h后加入DMSO，在酶标仪540 nm波长处检测吸光度值A。
2.7. 流式细胞技术
收集过表达组，空载组及空白对照组T24细胞，加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS。加入1毫升冰浴预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时。1000 g左右离心5分钟，沉淀细胞；加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清；参考凋亡试剂盒及细胞周期试剂盒说明，根据待检测样品的数量配制适量的碘化丙啶染色液，每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液。缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟，随后可以4℃避光存放。染色完成后宜在24小时内完成流式检测。
2.8. 细胞组化实验
收集过表达组，空载组及空白对照组T24细胞，制作细胞爬片，PBS漂洗2次，每次2 min，4%多聚甲醛20 min，0.5%Txiton X-100 20 min，PBS漂洗，3% H2O2 15 min，山羊血清20 min，甩干封闭液，一抗(1:200)孵育4℃过夜；PBS清洗标本3次各5 min。二抗工作液孵育37℃ 30 min。PBS清洗，免疫组化试剂盒处理37℃ 30 min；PBS清洗，DAB显色。
2.9. 统计学分析
实验数据使用SPSS 17.0进行分析处理，并利用平均值±标准差(M ± SD)进行表示。定量资料使用方差分析，样本间的两两比较采用LSD方法。P < 0.05表示差异显著。
3. 结果
3.1. 成功构建慢病毒过表达KAI1膀胱癌细胞株
在慢病毒感染膀胱癌细胞株48 h后，收集细胞在荧光显微镜下可见，慢病毒成功感染膀胱癌细胞株T24 (图1)。
Figure 1. Overexpression of KAI1 was successfully transfected into T24 cell lines (KAI1: KAI1-lentiviral infection group; GFP: no-load group; Blank group: uninfected lentivirus group)
图1. 过表达KAI1成功转染T24细胞株(KAI1：KAI1-慢病毒感染组；GFP：空载组；空白组：未感染慢病毒组)
3.2. 过表达组T24细胞株KAI1表达量上调
QPCR显示KAI1-慢病毒感染组KAI1的RNA表达量明显升高，与空载组以及空白对照组比较差异具有显著性(P < 0.01)。同时，细胞组化及Western-blot结果显示在蛋白水平，KAI1-慢病毒感染组KAI1的蛋白表达量明显升高，与空载组以及空白对照组比较差异具有显著性(P < 0.01) (图2)。
3.3. 过表达组KAI1蛋白对T24细胞增殖的影响
MTT结果显示，在24 h，48 h及72 h各时间点KAI1-慢病毒感染组与GFP组以及空白对照组比较均显示，增殖活性低于其他两组，差异具有显著性(P < 0.01)。在各时间点，GFP组以及空白对照组比较增殖活性没有显著区别(P > 0.05) (图3)。
Figure 2. The expression level of KAI1 in T24 cell line in the overexpression group was up-regulated. (A) showed that the RNA expression of KAI1 in each group was significantly higher than that in the noload group and the blank control group, and the difference was statistically significant (P < 0.01). (B) and (C) showed that the protein expression of KAI1 in each group was significantly higher than that in the no-load group and the blank control group, and the difference was significant (P < 0.01)
图2. 过表达组T24细胞株KAI1表达量上调.(A)显示各组的KAI1的RNA的表达量，KAI1组表达量明显高于空载组以及空白对照组，差异具有统计学意义(P < 0.01)。(B)及(C)显示各组的KAI1的蛋白表达量，KAI1组蛋白表达量明显高于空载组以及空白对照组，差异具有显著性(P < 0.01)
Figure 3. There was no significant difference in cell proliferation between the groups at 0 h, and the cell proliferation activity of the KAI1-lentivirus infection group was significantly lower than that of the GFP group and the blank control group at 24 h, 48 h and 72 h. The difference is significant (P < 0.01)
图3. 在0 h各组细胞增殖情况没有显著区别，在24小时，48小时以及72小时，KAI1-慢病毒感染组细胞增殖活性显著低于GFP组以及空白对照组。差异具有显著性(P < 0.01)
3.4. 过表达组KAI1蛋白对T24细胞凋亡的影响
流失细胞技术显示KAI1过表达组和GFP组以及空白对照组比较，细胞凋亡明显增多，差异均具有显著性(22.3% vs 10.5%; 22.3% vs 7.9%) (P < 0.01)。GFP组和空白对照组比较，细胞凋亡数量GFP组较空白对照组明显增多，差距具有显著性(P < 0.05) (图4)。
Figure 4. The number of apoptosis in the KAI1 overexpression group was significantly higher than that in the blank control group and the GFP group (22.3% vs 10.5%; 22.3% vs 7.9%), the difference was significant (P < 0.01). The difference between the blank control group and the GFP group was not significant (P > 0.05)
图4. KAI1过表达组细胞凋亡数量和空白对照组以及GFP组比较，细胞凋亡数量明显增多(22.3% vs 10.5%; 22.3% vs 7.9%)，差异具有显著性(P < 0.01)。空白对照组与GFP组比较差异不具有显著意义(P > 0.05)
3.5. 过表达组KAI1蛋白对T24细胞周期的影响
过表达KAI1蛋白组，T24细胞G0/G1期细胞数量明显增多，而S期细胞数量明显减少。区别具有显著性(P < 0.01)。GFP组和空白对照组比较，T24细胞G0/G1期细胞数量以及S期细胞数量无显著区别，差距不具有显著性(P > 0.05) (图5)。
Figure 5. The number of cells in G0/G1 phase of T24 cells in the KAI1 overexpression group increased significantly, while the number of cells in S phase decreased significantly. The difference was significant (P < 0.01)
图5. KAI1过表达组T24细胞G0/G1期细胞数量明显增多，而S期细胞数量明显减少。区别具有显著性(P < 0.01)
3.6. 过表达组KAI1蛋白对T24细胞CyclinD1及Caspase-3蛋白表达的影响
过表达KAI1蛋白组，T24细胞的CyclinD1蛋白表达明显下调，和空白对照组以及GFP组比较差异具有显著性(P < 0.01)；而caspase-3蛋白表达量明显上调，和空白对照组以及GFP组比较差异具有显著性(P < 0.01) (图6)。
4. 讨论
KAI 1蛋白最早是在前列腺癌中发现，认为其可以抑制前列腺癌的转移[12]。而在泌尿系统其他肿瘤中的研究也证实了其存在相似的功能。我们课题组前期完成了该基因对肾癌恶性演变的研究，认为
Figure 6. The expression of caspase-3 protein in T24 cells in the KAI1 overexpression group was significantly up-regulated, and the difference was significant compared with the blank control group and the GFP group (P < 0.01). The expression of CyclinD1 protein was significantly down-regulated, and the difference was significant compared with the blank control group and the GFP group (P < 0.01). The difference between the blank control group and the GFP group was not significant (P > 0.05)
图6. KAI1过表达组T24细胞caspase-3蛋白表达量明显上调，和空白对照组以及GFP组比较，差异具有显著性(P < 0.01)。CyclinD1蛋白表达明显下调，和空白对照组以及GFP组比较，差异具有显著性(P < 0.01)。空白对照组与GFP组比较差异不具有显著意义(P > 0.05)
过表达该基因可以抑制肾癌细胞株的增殖，以及降低肾癌细胞株的侵袭转移能力。但是其在膀胱癌中的作用如何，目前尚没有广泛的研究。目前有学者就KAI1基因在膀胱癌的标本中的表达做了相关研究，认为其基因及蛋白的表达下调与膀胱移行细胞癌分化、浸润及淋巴转移有关，可作为评判膀胱肿瘤恶性程度、转移潜能及预后的有效指标[13]。为进一步证实该基因在膀胱癌中的作用，本实验拟采用KAI1-慢病毒载体感染膀胱癌细胞株T24，使之过表达该基因，再从功能学的角度探讨了过表达该基因后，细胞增殖能力，凋亡能力等的变化，最后初步探讨了可能的机制。
研究结果显示过表达KAI1基因可以显著地抑制膀胱癌细胞株的增殖，促进细胞的凋亡，使得细胞周期停留在G0/G1期，减少S期细胞数量。证实了在膀胱癌中KAI1的功能和其在肾癌中类似，和国内其他研究结果类似。那么，KAI1蛋白引起膀胱癌细胞株增殖能力减弱，凋亡增加以及细胞周期阻滞的可能机制又是什么呢？
肿瘤的发生发展与细胞的增殖凋亡失平衡关系密切，细胞的异常增生，或者细胞出现凋亡减退，均可以导致细胞的异常增生，促使肿瘤的发生。caspase-3是Caspase家族中的重要一员，属天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶，是细胞发生凋亡的关键效应分子[14]。当细胞发生凋亡时，caspase-3由无活性的酶原形式裂解而活化成为酶，促使凋亡的发生[15]。在大量的肿瘤或者正常细胞中均有表达，其表达量的上调可以明显地促进凋亡的发生[16]。在本研究中，过表达的KAI1蛋白使得膀胱癌细胞株T24的caspase-3表达量明显增高，可能是KAI1引起膀胱癌细胞凋亡的可能机制。
细胞周期蛋白(Cyclin)对细胞周期的调控起着关键的作用，目前已知的和肿瘤发生发展密切相关的细胞周期蛋白由三个压型，分别为CyclinD1、CyclinD2和CyclinD3。其中CyclinD1和CyclinD3具有相似的氨基酸个数，同时在功能方面也具有互补性[17]。cyclin D1是细胞周期调节的重要因子，为G1期细胞周期素。其可以在细胞增殖时发生基因扩增或重排，此时，周期素依赖性激酶复合物(cyclin D1-CDK)增多，使靶蛋白磷酸化，驱动细胞进入S期，促进细胞增殖，导致肿瘤的发生发展[18]。在本实验中，过表达KAI1蛋白的T24膀胱癌细胞株的细胞周期蛋白CyclinD1表达量明显减退。导致膀胱癌细胞株T24阻滞在G0/G1期。可能是KAI1引起膀胱癌细胞株增殖能力减弱的可能机制。
总之，过表达KAI1可显著降低膀胱癌细胞株T24的增殖能力，增强细胞凋亡。而这种作用是通过降低细胞内CyclinD1蛋白表达以及上调caspase-3蛋白实现的。可能为膀胱癌的生物治疗提供新的选择。尽管目前实验认为CyclinD1以及caspase-3是KAI1引起肿瘤细胞增殖减弱，凋亡增加的目标蛋白。但是CyclinD1以及caspase-3与KAI1的作用究竟是直接作用还是受其他关键蛋白的影响还有待于进一步研究。
NOTES
*通讯作者。