难治性免疫性血小板减少症与T细胞相关的机制

Mechanisms Associated with T Cells in Refractory Immune Thrombocytopenia

摘要: 难治性免疫性血小板减少症经过一、二线药物治疗均无效，或脾切除无效/术后复发。难治性患者血小板计数低，出血风险高，常规治疗手段效果有限，其机制尚不清楚。本文从T细胞的通路、异常活化及受体三方面展开，通路方面我们发现T细胞的特异性克隆导致细胞毒性增加，并触发血小板活化和凋亡，甲基化诱导一些敏感基因的表达，导致免疫的失衡，使得基因下游的细胞因子释放异常，从而影响血小板的增殖及凋亡，MDSC (髓源性抑制细胞)会释放一些抑制性配体阻碍T细胞的增殖，挽救LKB1-AMPK信号通路分子和抑制性细胞因子的表达缺陷，增强了T细胞增殖。T细胞异常活化导致一些细胞因子的持续表达或相对消除，致使对一线治疗无反应。受体方面发现CD8+ T细胞毒性高的人群中Neu1易位程度高，抗GPIb/IX抗体似乎会导致更多的血小板凋亡，抑制其活性，血小板的唾液酸化会减少。通过这三方面来总结导致难治性ITP可能发生的机制，为诊断难治性ITP的新型标志物或为治疗靶点提供更多的信息。

Abstract: Refractory immune thrombocytopenia is ineffective after first- and second-line drug therapy, or splenectomy is ineffective/relapsed after surgery. Refractory patients have low platelet counts, high bleeding risk, and limited response to conventional treatments, and the mechanism is unclear. This article focuses on the pathways, abnormal activation, and receptors of T cells. In this paper, we found that the specific cloning of T cells leads to increased cytotoxicity and triggers platelet activation and apoptosis, methylation induces the expression of some sensitive genes, resulting in an imbalance of immunity, which makes the cytokine release downstream of genes abnormal, thereby affecting the proliferation and apoptosis of platelets, and MDSCs (myeloid-derived suppressor cells) will release some inhibitory ligands to hinder the proliferation of T cells and rescue LKB1-AMPK Defective expression of signaling pathway molecules and inhibitory cytokines enhances T cell proliferation. Aberrant T cell activation results in sustained expression or relative elimination of some cytokines, resulting in non-response to first-line therapy. In terms of receptors, it was found that the degree of Neu1 translocation was high in people with high CD8+ T cytotoxicity, and anti-GPIb/IX antibodies appeared to cause more platelet apoptosis, inhibit their activity, and reduce platelet sialylation. Through these three aspects, we summarize the mechanisms that may lead to the occurrence of refractory ITP, and provide more information for new markers for diagnosing refractory ITP or for therapeutic targets.

1. 引言

免疫性血小板减少症(ITP)是一种复杂的自身免疫性疾病，其特征是血小板计数低，伴皮肤粘膜出血，可能表现为瘀点、紫癜、尿路或胃肠道和/或口腔粘膜出血、鼻出血以及生活质量下降，在最坏的情况下，可能会发生致命的颅内出血，但这只发生在大约0.2%的病例中[1]。大多数患者通常可以通过常规治疗进行管理，然而，有部分ITP患者经过一、二线药物治疗均无效，或脾切除无效/术后复发，称之为难治性ITP [2]。免疫性血小板减少症的发病率从每ITP的发病率为4~6/100,000人年，并随着年龄的增长而增加，患病率约为12/100,000人年[3]。根据Psaila等人的研究，大约10%的ITP患者在1年内变得难以治疗。难治性ITP的诊断主要是通过排除其他疾病来进行，并基于临床医生的专业知识。然而，它显著增加了药物相关毒性和出血的风险，包括危及生命的事件[4]。Mahévas等人的分析中，35%的多难治性患者被诊断为继发性ITP，初始血小板计数极低且在疾病第一年反复出现湿性出血的男性似乎有较高的难治性病程风险。发展为慢性难治性ITP和慢性非难治性ITP的患者之间初始临床差异在个体基础上很弱，既不能让临床医生准确预测长期预后，也不能允许在新药试验中进行早期分层或患者选择或早期免疫调节治疗策略。需要新的难治性标志物，可以帮助在早期阶段区分疾病，改善治疗和长期结果，并减少患者对皮质类固醇的长期需求，尤其是青少年[5]。本篇综述将重点关注与T细胞相关的最新研究进展，将相关机制及可能发展为标志物的文章归纳，为治疗方案的选择及尽早诊断出难治性ITP提供更多的信息。

多年来T细胞参与ITP的发病机制已为人所知，例如，T细胞的极化、辅助T细胞促进B细胞的分化和抗血小板抗体的发生、细胞毒T细胞及调节T细胞的作用等诸多机制，与非难治性ITP相比，难治性ITP参与炎症和免疫激活的T细胞比例更高，例如：约翰·森普尔等人检测了11例急性ITP和23例难治ITP患者的细胞因子，发现前者很少有患者细胞因子增加，而后者中的许多(53%)患者血清IL-2、IFN-γ和/或IL-10水平升高，其根本原因在于难治性ITP患者群体体内T细胞活化异常，导致血清细胞因子积累[6]；还有阿姆娜·马利克等人发现ITP患者的T细胞克隆扩增，并且证明在难治性疾病患者中更为突出[7]。T细胞的平衡失调被认为是驱动因素ITP发展和持续的因素[8]。下面将围绕T细胞展开导致难治性ITP的多种机制。

2. T细胞的信号通路异常

2.1. T细胞的特异性克隆

阿姆娜·马利克等人通过TCR的深度测序显示ITP患者的T细胞克隆扩增。CD8+ T细胞的单细胞RNA和TCR联合测序证实，扩增的克隆是TEMRA细胞。并且证明在难治性疾病患者中更为突出，并在血小板计数低时扩增，并且没有表现出生理衰竭的迹象。使用体外模型系统，发现来自ITP患者的CD8+ T细胞与自体血小板形成聚集体，导致克隆扩增的CD8+ T细胞导致细胞毒性增加，并触发血小板活化和凋亡。这些T细胞还释放干扰素γ，并通过TCR介导的细胞毒性颗粒释放触发血小板活化和凋亡[7]。伊戈尔·菲利波夫等人也同样发现在TEMRA细胞表现出与细胞毒性相关的基因的高表达和共刺激和趋化因子基因的低表达。Temra细胞上调富含细胞毒性相关途径的基因，通过实时荧光定量PCR证实了共刺激分子CD27和CD28以及趋化因子受体CCR7的下调以及Temra细胞中与NK细胞相关的基因(XCL1、KLRD1、GZMB)的上调。在TEMRA细胞中NCR1基因的启动子区域表达更高且染色质更容易获得，该基因编码NKp46蛋白是NK细胞激活细胞毒性受体，促进Temra细胞获得更多NK样表型和细胞毒性功能，NKp46信号转导在NK细胞中引发IFN-γ分泌和肿瘤细胞毒性。[9]这些克隆扩增的CD8+ T细胞导致细胞毒性增加，并触发血小板活化和凋亡，并且释放一些细胞因子促进这一过程，这为难治性ITP提供了新的机制，那么靶向治疗特异性T细胞克隆很可能是难治性ITP患者的一种新治疗方法。

2.2. T细胞与DNA甲基化

DNA甲基化是调节基因转录和染色质结构的基本表观遗传修饰。许多疾病显示异常甲基化模式，导致疾病表型，包括癌症和自身免疫。近来的研究表明，DNA甲基化的异常与免疫性血小板减少症的发病有关，甲基化缺陷诱导了IL-4、IFN-γ、CD 70和FOXP 3等甲基化敏感基因的过度表达，这些基因参与淋巴细胞的自身反应性免疫应答。正常情况下，Th1/Th2细胞因子呈现动态平衡，维持机体处于相对稳定的状态。一旦这种平衡被破坏，一方就不能有效地制约另一方，导致Th1/Th2极化，导致自身免疫性疾病[10]。陈振平等人研究不同ITP患者FOXP3区域CpG位点的甲基化水平，结果显示，慢性ITP组和持续性ITP组CpG6甲基化水平均显著高于初诊ITP组，那么CpG6甲基化可能是新诊断ITP发展为持续性ITP的指标[11]。

杜汉志等人研究原发性难治性ITP外周血CD4+ T淋巴细胞的DNA甲基化差异。结果发现，CASP9、C1orf109和AMD1的mRNA表达水平与健康对照组不同。难治性ITP组CASP9的mRNA表达低于对照组，导致CD4+ T细胞亚群凋亡抑制失衡，激活细胞免疫应答。C1orf109的低表达与其在ITP中的高甲基化有关，并推测该水平会影响CD4+ T淋巴细胞的增殖和活化，从而影响细胞免疫反应。与正常对照组相比，AMD1的表达要高得多。AMD1主要影响巨核细胞的分化，进而影响血小板的产生。并且发现显著差异化的甲基化基因主要富集在免疫相关通路以及Arp2/3复合物介导的肌动蛋白成核调控、Th1和Th2细胞分化、Notch信号通路、囊泡转运过程和组蛋白H3-K36去甲基化等免疫相关通路和血小板产生和活化过程中[12]。

一些研究也发现高甲基化的NOTCH1通过Th1和Th2细胞分化途径调节许多下游细胞因子来影响ITP。与正常对照组相比，ITP组NOTCH1及其下游Th2细胞因子(IL-4、IL-10和GATA3)表达水平显著降低，Th1细胞因子(IFN-γ、IL-12、TNF-α)表达水平显著升高，地西他滨处理的ITP组中NOTCH1及其相关细胞因子的表达明显逆转[13]。

综上所述，那么甲基化是否也可以成为难治性ITP的生物标志物，用于诊断或者预测预后价值，或者地西他滨可以成为潜在的治疗方案。

2.3. T细胞与MDSC (髓源性抑制细胞)

有研究表明MDSC表达抑制性配体，例如PD-L1和PD-L2，有助于T细胞抑制，同时它们能够产生高水平的抑制性细胞因子，例如白细胞介素(IL)-10和转化生长因子β (TGF-β)，可导致Treg细胞扩增和随后的效应T细胞抑制[8]。韩盼盼等人发现低剂量去甲基化剂地西他滨被证明可以恢复CD8T细胞上PD-1的甲基化水平和表达，并降低ITP患者CTLs的细胞毒性[14]。王玲军等人发现血小板α颗粒富含转化生长因子β1 (TGF-β1)与髓源性抑制细胞(MDSC)生物学有关，证明了TPO-RAs通过阻断浆细胞分化、减少细胞毒性T细胞上Fas配体的表达和重新平衡T细胞亚群来增强MDSCs的抑制活性。并且转录组分析证实了TGF-β/Smad通路参与TPO-RA校正的MDSCs，TGF-β1通过TGF-β/Smad通路诱导MDSC的扩增和功能重编程[15]。倪晓飞等人发现ITP患者的外周血MDSCs比例明显低于健康对照组，免疫抑制功能受损。于是他们探讨了地西他滨作用对ITP患者MDSC的潜在机制，发现LKB1的破坏导致MDSC代谢异常。通过LKB1缺失使用ITP小鼠模型，确定了LKB1信号的上调是低剂量地西他滨恢复MDSCs正常有氧代谢的分子靶点。这反过来又增强了MDSCs的抑制功能，缓解了血小板减少症。对于ITP患者，地西他滨纠正了MDSC中受损的线粒体呼吸，增强了它们对T细胞增殖和CTL细胞毒性的抑制，MDSC在ITP患者中的有氧代谢和免疫抑制功能之间存在关联。地西他滨还可以挽救LKB1-AMPK信号通路分子和抑制性细胞因子的表达缺陷，慢病毒干扰试验显示，LKB1敲低牺牲了地西他滨诱导的MDSC代谢和抑制功能的改善。因此，LKB1在调节ITP患者的MDSC代谢和抑制功能方面发挥核心作用[16]。因此，MDSC的异常可能与ITP的复发和难治性有关，低剂量的地西他滨可能成为难治性ITP的潜在治疗方案。

2.4. 辅助T细胞

李马等人建立了类固醇治疗的主动(免疫脾细胞植入)和被动(抗体注射)小鼠模型。结果提示，在这两种模型中，CD8+ T细胞限制了血小板减少症的严重程度，并且是类固醇治疗有效反应所必需的。相反，CD8+ T细胞耗竭导致更严重的血小板减少症，而CD8+ T细胞输注改善了血小板减少症。检测到CD8+ T调节细胞(Treg)亚群，有趣的是，地塞米松(DEX)治疗选择性地扩增了CD8 Treg，同时降低了CTL。体外共培养研究表明，CD8 Tregs抑制CD4和CD19增殖、血小板相关免疫球蛋白G生成、CTL细胞毒性、血小板凋亡和清除率。此外，我们发现在类固醇治疗后的共培养研究和体内抗炎白细胞介素-10的产生增加。因此，我们发现了CD8 Tregs的亚群，并证明了它们在实验诱导的血小板减少症中具有强大的免疫抑制和保护作用。这些数据进一步阐明了类固醇治疗的机制，并表明CD8 Tregs在免疫性血小板减少症中的治疗潜力[17]。那么难治性ITP是否缺失CD8+ T调节细胞(Treg)或者该细胞的调节通路异常导致对激素反应差。

3. T细胞的异常活化

3.1. T细胞与细胞因子

约翰·森普尔等人发现患有慢性AITP的儿童群体可能具有异常的体内CD4+ T细胞活化，导致血清细胞因子的积累。通过检测急性AITP患者与慢性AITP患者外周血中的细胞因子发现，后者的许多(53%)患者血清IL-2、IFN-γ和/或IL-10水平升高。慢性AITP患者的血清中，主要是IL-2分泌，内源性IL-2的过度分泌可能通过绕过T细胞共刺激的需要，通过上调B细胞上的共刺激CD8分子，或通过诱导其他细胞因子，如IFN-γ和IL-10。血清细胞因子增加，以及体外血小板刺激的IL-2产生，可能有助于预测哪些急性AITP患儿会发展为慢性形式的疾病[6]。

3.2. IL-10的相对相除和IL-17的持续表达在无反应患者

难治性ITP对一线激素治疗无反应，那么难治性ITP的免疫环境中是否存在异常的T细胞，导致激素无效。玛德琳·斯汀普森等人考虑难治性ITP患者对皮质类固醇治疗无反应可能与CD4+ T细胞所释放的细胞因子有关，故将ITP患者的CD4T细胞在存在或不存在地塞米松的情况下培养，然后通过流式细胞仪定量细胞内细胞因子的表达，结果提示，对皮质类固醇治疗无反应患者的IL-10:IL-17比率降低，这反映了IL-10的相对相除和IL-17的持续表达在无反应患者中[18]。他们了解到地塞米松上调IL-10的CD4T细胞通常共同产生Th17相关细胞因子，包括IL-17、IL-22和IFN-γ [19]。这些产生IL-10的Th17细胞被称为“非致病性”Th17细胞，在限制炎症和自身免疫方面很重要[20]。相比之下，共表达IL-17和IFN-γ的CD4T细胞亚群(即所谓的“致病性”Th17细胞)已被证明对皮质类固醇无反应。这些细胞不表达IL-10并且它们的增殖不受地塞米松的抑制。因此，在通过上调IL-10而无法对皮质类固醇产生反应的患者中，致病性Th17细胞可能优先生长，导致持续的皮质类固醇难治性疾病[18]。

4. T细胞对受体的影响

T细胞与血小板去唾液酸化

在邱继华等人研究中，发现CD8+ T细胞毒性阳性的ITP患者新鲜血小板的去唾液酸化显着高于非细胞毒性ITP患者和对照组，这表明去唾液酸化可能在ITP中CD8+ T细胞介导的血小板清除中发挥作用。实验发现与来自非细胞毒性ITP患者和对照组CD8+ T细胞相比，来自细胞毒性阳性的ITP患者的CD8+ T细胞诱导血小板表面的Neu1表达。此外，在培养基中加入神经氨酸酶抑制剂DANA以抑制Neu1的活性，发现DANA成功抑制了CD8+ T细胞引起的血小板脱唾液酸化增加，但不影响ITP中CD8+ T细胞的细胞毒性[21]。郑诗莹等人也发现抗GPIIb/IIIa抗体导致Neu1易位程度更高，抗GPIb/IX抗体似乎会导致更多的血小板凋亡，在具有抗GPIIb/IIIa抗体的ITP患者中，去唾液酸化和凋亡都依赖于FcγRIIa信号传导而非血小板活化[22]。这些结果表明CD8+ T细胞在血小板表面引起Neu1表达。抑制血小板去唾液酸化或阻断去唾液酸化血小板通过肝脏的清除可能是ITP患者的新治疗策略，尤其难治性ITP。

5. 总结

综上所述，难治性ITP围绕T细胞的异常增殖或者活化与多种机制都有关，而且异常的T细胞释放的抑制性因子也可能导致难治性ITP的发生，难治性ITP机制的不确定性，增加了临床医生的诊断的困难、治疗的滞后性及患者出血的风险，更使生活质量下降，由于治疗的滞后性，导致患者反复发作，频繁住院治疗，增加了患者的经济负担，如果能找到难治性ITP与非难治性ITP的异同标志物，尽早发现原发性ITP发展为难治性ITP的预测因子，及时予以正确的治疗方案，或者根据分子生物学机制发现难治性ITP的靶点，并予以靶向药物，能够准确精准的治疗，将会明显减少患者的出血致死风险及经济负担。

NOTES

^*通讯作者。