1. 引言
MARCH (Membrane Associated, RING-CH)家族是一个结构上相关联的蛋白家族，其成员结构特点为由N端的RING-CH结构域和紧连的C端两个或多个跨膜区组成[1]。这种跨膜RING-CH finger蛋白具有多种生物学功能，如免疫调节、蛋白质控和膜运输[1]。
目前，MARCH家族有11个成员(MARCH-I-XI)。2022年，Luo团队[2]研究发现，高温条件下E3泛素连接酶MARCH-IX能够使ATG9A发生K63位泛素化修饰，ATG9A进而与维持高尔基体片层结构的蛋白GRASP55互作，并抑制GRASP55的寡聚化，抑制了GRASP55连接高尔基体片层的作用，最终引起高尔基体片段化。
MARCH-II基因是Bartee课题组在2004年发现[1]，定位于19p13.2，基因全长25746 bp，其开放读码框编码246个氨基酸，相对分子量26995 Da。MARCH-II是二次跨膜蛋白，由N端RING domain、中间的二次跨膜区和C端的PDZ domain构成。最近，Umthong课题组[3]揭示了人类MARCH2用于限制HIV-1的抗病毒机制，这对所有具有抗病毒功能的MARCH蛋白都有潜在的意义。Yu研究团队[4]在GUT (IF 25)发表的研究揭示了胰腺导管腺癌血浆细胞外囊泡长链RNA (exLR)表达谱，并鉴定了8个exLRs (FGA, KRT19, HIST1 H2BK, ITIH2, MARCH2, CLDN1, MAL2, TIMP1)用于诊断胰腺导管腺癌，MARCH2是诊断标志物之一，并且诊断标志显示出很高的准确性。为了更好地研究MARCH2的功能及其与肿瘤的相关性，本研究制备了MARCH2多克隆抗体，并用RT-PCR检测MARCH2在细胞系中的表达情况，用Western blot检测MARCH2在正常组织及肿瘤组织中的表达情况。用免疫荧光法及激光共聚焦显微镜分析检测MARCH2在亚细胞结构中的定位，为进一步研究MARCH2的生物学功能奠定基础。
2. 材料与方法
2.1. MARCH2多克隆抗体的制备
用化学合成的MARCH2肽段KDPGPRTEKRTL和SEWRKTNQKVR (杭州中肽生化有限公司)，偶联KLH后免疫动物。选用成年雄性新西兰兔，初次免疫将300 μg的抗原用PBS稀释至1 ml后与等体积的弗氏完全佐剂充分混合，于两足部各0.25 ml皮下注射，其余后背部皮下多点注射。之后每3周加强免疫一次，用量同前，全部后背部皮下多点注射。最后一次加强免疫后10天取兔耳缘静脉血样检测效价，至效价达1:105以上，将家兔处死心脏取血，获取血清。
2.2. MARCH2多克隆抗体的纯化与鉴定
用CNBR活化的Sepharose 4B (胜创生物科技有限公司)偶联肽段KDPGPRTEKRTL和SEWRKTNQKVR制备的亲和层析柱。然后加入抗MARCH2的兔免疫血清4℃旋转混合过夜，用PBS冲洗柱料，然后使用0.1 M甘氨酸缓冲液洗脱(pH 2.4)洗脱。每毫升洗脱液中加入50 μl 1 M Tris (pH 9.0)中和后，置于4℃用pH 7.4 PBS大体积透析，更换三次，每次间隔8小时，浓缩后备用。
MARCH2多克隆抗体的Western blot鉴定：将MARCH2表达质粒或空载体转染HeLa细胞24小时后收取细胞，提取总蛋白并进行Western blot检测，MARCH2多克隆抗体的使用终浓度为1 μg/μL。
MARCH2多克隆抗体的细胞免疫荧光鉴定：将MARCH2-MYC表达质粒转染HeLa细胞24小时后，4%多聚甲醛固定，4℃，30分钟，然后用0.2%的Triton X-100渗透化处理，室温30分钟，10% BSA室温封闭30分钟，然后同时加入10% BSA稀释的鼠抗MYC抗体和兔抗MARCH2抗体进行细胞免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察。
2.3. 细胞培养及转染
HeLa、U2OS、HCT116、A549、HEK293T和COS7等32种细胞来源于本实验室，均培养于含10% FBS的DMEM培养基中，常规传代。
质粒转染用Megatran 1.0，按产品说明书所述进行。操作步骤如下：
1) 细胞培养：将HeLa、U2OS、HEK293T和COS7等细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基铺在细胞培养板中，在5% CO2、37℃的培养箱中培养24小时。
2) 制备DNA-Megatran 1.0复合物：用Opti-MEM稀释DNA，缓慢混合均匀；加入3 μL Megatran 1.0对应每μg质粒，混合均匀，在室温下放置10分钟后，以形成DNA-Megatran 1.0复合物。使用相同总量的pEGFP-N1质粒表达绿色荧光蛋白以检测转染效率。
3) 转染：将DNA-Megatran 1.0复合物缓慢滴入细胞培养板，轻微摇匀。在5% CO2、37℃的培养箱中培养，孵育后的4~6小时内更换培养基。转染24小时后于荧光显微镜下观察pEGFP-N1孔的转染效率。
2.4. RT-PCR
从RNA (或mRNA)反转录合成cDNA第一链，于95℃加热5~10 min，灭活反转录酶，使RNA-cDNA杂交体变性，然后迅速冰浴冷却，PCR扩增。cDNA第一链合成方法：20 ul反应液中含10 × PCR扩增缓冲液，2 ul；四种dNTP (10 mmol/L) 2 ul；RNA酶抑制剂20 U；mRNA，l~2 ug (或RNA 5~10 ug)；AMV，20 U；引物，1 u；最后用灭菌水补至20 ul。以上溶液充分混匀后，于42℃反应60 min，反应完毕后将反应管在95℃下加热5 min，使反转录酶失活和RNA-cDNA杂合物变性。其后反应液则可置于−20℃下保存备用。
2.5. 组织芯片免疫组化
具体步骤如下：
1) 脱蜡：组织芯片置于二甲苯中浸泡20分钟，换新鲜二甲苯重复一次。
2) 再水化：将脱腊后的组织切片于100%乙醇中浸泡5分钟2次，95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸馏水各浸泡5分钟 × 1次。
3) 抗原修复：抗原修复液为柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液，将抗原修复液微波高温加热至沸腾，将切片放入，再用微波高火加热5分钟，补加蒸馏水恢复体积后再用微波高温加热5分钟，自然冷却至室温。
4) 去除内源性过氧化物酶：新鲜配制3% H2O2，滴片，室温下避光孵育10分钟。
5) 封闭：用正常羊血清工作液室温封闭20分钟。
6) 一抗反应：用10 μg/mL兔抗人MARCH2一抗(以PBS稀释)滴片，37℃孵育1小时，对照组以PBS代替一抗；PBS洗5分钟 × 3次。
7) 二抗反应：HRP-羊抗兔抗体1:200稀释(以PBS稀释)，室温反应30分钟。
8) PBS洗5分钟 × 3次。
9) 二氨基联苯氨(DAB)显色，滴片，镜下观察反应结果。
10) 苏木精复染细胞核，自来水蓝化。
11) 乙醇上行脱水：50%乙醇5分钟，75%乙醇5分钟，95%乙醇5分钟，100%乙醇5分钟 × 2次。
12) 中性树胶封片，于光学显微镜下观察并记录结果。
2.6. 激光共聚焦显微镜观察
HeLa细胞铺入共聚焦小皿中大约长至60%~80%密度，使用Megatran 1.0转染带荧光蛋白标签或不带标签的相应蛋白表达质粒，转染24小时后，细胞用4%多聚甲醛固定或进一步进行免疫荧光染色，Hoechst33342染核，PBS冲洗三次，置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
2.7. 统计学分析
以上数据的标准差代表实验中不同分组之间的差异，以上实验均至少重复三次；Student’s t检验分析各组之间是否存在显著性差异，p < 0.05认为差异具有统计学意义。
3. 结果与分析
3.1. MARCH2多克隆抗体的制备、鉴定和纯化
利用DNAstar软件对MARCH2蛋白的抗原性、亲疏水性、表面暴露性等进行分析(图1(A))。在此基础上，化学合成MARCH2两条短肽：KDPGPRTEKRTL和SEWRKTNQKVR (图1(A)，两个方框内的序列)，并用这两个肽段与载体蛋白KLH制备成完全抗原免疫家兔，ELISA分析抗体的效价，结果发现，KDPGPRTEKRTL肽段的抗原性较好，能够刺激家兔产生高效价的抗体(效价达1:105以上)，将家兔处死，心脏取血，获取血清。血清用偶联KDPGPRTEKRTL肽段的Sepharose 4B亲和柱进行纯化，获得的抗MARCH2兔多克隆抗体进行分析鉴定。该抗体既能检测内源性MARCH2表达，也能检测外源性MARCH2表达。在HeLa细胞中转染Vector或MARCH2-MYC质粒，24 h后收集细胞，Western blot检测MARCH2表达水平。结果发现，MARCH2-MYC质粒转染组MARCH2蛋白水平显著升高，表明该抗体能够用于MARCH2的Western blot检测(图1(B))。我们也进行了免疫荧光分析，在HeLa细胞中转染MARCH2-MYC质粒，24 h后收集细胞，利用MARCH2和MYC抗体染色，结果两者分布完全重叠，表明该抗体能够用于MARCH2的免疫荧光检测(图1(C))。这些结果说明我们制备的MARCH2抗体既能识别线性决定簇，也能识别空间决定簇。
Figure 1. Identification of MARCH2 rabbit anti-human antibody: (A) Analysis of antigenicity, hydrophilicity, hydrophobicity, and surface exposure of proteins; (B) Western blot identification of rabbit anti-MARCH2 polyclonal antibody; (C) Immunofluorescence identification of rabbit anti-MARCH2 polyclonal antibody
图1. 兔抗人MARCH2抗体的鉴定：(A) 蛋白的抗原性、亲疏水性、表面暴露性等分析；(B) 兔抗MARCH2多克隆抗体的Western blot鉴定；(C) 兔抗MARCH2多克隆抗体的免疫荧光鉴定
3.2. MARCH2在组织及细胞系中的表达
为了分析MARCH2的表达谱，我们利用半定量RT-PCR方法，在32种细胞系中检测了MARCH2 mRNA的表达水平，结果显示，MARCH2呈广泛表达，在HeLa、U2OS、HCT116、COS7细胞中表达最高，在SKBR3、HGC-27、MGC-803细胞中低表达(图2)。
Figure 2. RT-PCR analysis of MARCH2 mRNA expression in 32 cell lines
图2. RT-PCR分析MARCH2 mRNA在32种细胞系中的表达
我们购买了组织芯片，利用免疫组织化学方法进一步分析了其在正常组织中的表达情况，染色结果显示MARCH2呈广泛表达，在前列腺、肝组织中呈高表达，在横纹肌、甲状腺组织中呈低表达，主要在胞浆中呈现弥漫均匀细颗粒状分布(图3)。
注：组织芯片免疫组化分析MARCH2在前列腺(A)、肝脏(B)、骨髓(C)、皮肤(D)、肾(E)、横纹肌(F)、肺(G)、乳腺(H)、大脑(I)、结肠(J)、食管(K)、胰腺(L)、脾(M)、胃(N)、甲状腺(O)、子宫内膜(P)中的表达(图像400×)。
Figure 3. Expression of MARCH2 in normal tissues
图3. MARCH2在正常组织中的表达
除此之外，我们还发现，MARCH2表达因肿瘤类型的不同有差异。与对应的正常组织相比，MARCH2在某些肿瘤(如前列腺癌、肝癌)组织中表达降低(图4(B)和图4(A)，图4(D)和图4(C))，而在某些肿瘤(如食管癌、结肠癌)组织中表达增高(图4(F)和图4(E)，图4(H)和图4(G))。MARCH2在不同类型肿瘤的差异表达及临床意义有待进一步研究。
Figure 4. Immunohistochemical analysis of MARCH2 expression in tissues using tissue microarray: (A) Normal prostate tissue; (B) Prostate adenocarcinoma tissue; (C) Normal liver tissue; (D) Hepatocellular carcinoma tissue; (E) Normal squamous epithelium of esophagus; (F) Esophageal squamous cell carcinoma; (G) Normal colon tissue; (H) Colon cancer (image 400×)
图4. 组织芯片免疫组化分析MARCH2在组织中的表达：(A) 前列腺正常组织；(B) 前列腺腺癌组织；(C) 肝脏正常组织；(D) 肝细胞性肝癌组织；(E) 食管正常鳞状上皮；(F) 食管鳞状细胞癌；(G) 结肠正常组织；(H) 结肠癌(图像400×)
3.3. MARCH2蛋白的亚细胞器定位
为了明确MARCH2在细胞内的定位，我们将GFP-MARCH2与DsRed-ER (DsRed标记的内质网定位序列)、DsRed-Golgi (DsRed标记的高尔基体定位序列)、表达质粒共转染HeLa细胞，24小时后用4%多聚甲醛固定，然后在激光共聚集显微镜下观察。结果显示，GFP-MARCH2能够与DsRed-Golgi和DsRed-ER发生非常明显的共定位(图5(A)和图5(B))，而与LAMP1-Cherry (溶酶体marker)、EEA1 (内体marker)呈部分共定位(图5(C)和图5(D))，而与MitoTracker (线粒体marker)没有明显共定位(图5(E))。除此以外，我们发现内源性MARCH2与Calnexin (ER的marker)及TGN46 (Golgi的marker)也呈现明显的共定位现象(图5(F))。上述结果证明MARCH2与内质网、高尔基体共定位，与溶酶体、内体部分共定位，与线粒体没有共定位。
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Figure 5. Laser confocal microscopy analysis of overexpression and localization of endogenous MARCH2 in HeLa cells: (A) GFP-MARCH2 or GFP-Vector and DsRed-ER plasmids were co-transfected into HeLa cells, and the localization of overexpression of MARCH2 and ER was observed under confocal microscopy; (B) GFP-MARCH2 or GFP-Vector and DsRed-Golgi plasmids were co-transfected into HeLa cells, and the localization of overexpression of MARCH2 and Golgi was observed under confocal microscopy; (C) GFP-MARCH2 or GFP-Vector and LAMP1-cherry plasmids were co-transfected into HeLa cells, and the localization of overexpression of MARCH2 and LAMP1 was observed under confocal microscopy; (D) GFP-ARCH2 or GFP-Vector plasmids was transfected into HeLa cells, and the overexpression of MARCH2 and localization of endogenous EEA1 were detected using EEA1 polyclonal antibodies; (E) HeLa cells were transfected with GFP-MARCH2 or GFP-Vector plasmids, stained with mitotracker after 24 hours, and the localization of overexpression of MARCH2 and mitotracker was observed under confocal microscopy; (F) In HeLa cells, the localization of endogenous MARCH2 and Calnexin or TGN-46 was detected using MARCH2 and Calnexin or TGN-46 polyclonal antibodies
图5. 激光共聚焦显微镜分析过表达与内源性MARCH2在HeLa细胞中的定位：(A) GFP-MARCH2或GFP-Vector和DsRed-ER质粒共同转染HeLa细胞，共聚焦显微镜观察过表达MARCH2与ER的定位情况；(B) GFP-MARCH2或GFP-Vector和DsRed-Golgi质粒共同转染HeLa细胞，共聚焦显微镜观察过表达MARCH2与Golgi的定位情况；(C) GFP-MARCH2或GFP-Vector和LAMP1-cherry质粒共同转染HeLa细胞，共聚焦显微镜观察过表达MARCH2与LAMP1的定位情况；(D) GFP-MARCH2或GFP-Vector质粒转染HeLa细胞，EEA1多抗检测过表达MARCH2与内源性EEA1的定位情况；(E) GFP-MARCH2或GFP-Vector质粒转染HeLa细胞，24小时后用mitotracker染色，共聚焦显微镜观察过表达MARCH2与mitotracker的定位情况；(F) 在HeLa细胞中，用MARCH2和Calnexin或TGN-46多抗检测内源性MARCH2和Calnexin或TGN-46的定位情况
4. 讨论
MARCH (Membrane Associated, RING-CH)家族是一个结构上相关联的蛋白家族，其成员结构特点为由N端的RING-CH结构域和紧连的C端两个或多个跨膜区组成[1]。这种跨膜RING-CH finger蛋白具有多种生物学功能，如免疫调节、蛋白质控和膜运输[1]。
目前，MARCH家族有11个成员(MARCH-I-XI)。其中，MARCH-I可介导MHC-II泛素化，是胸腺中T细胞发育的重要调节子。MARCH-VIII泛素化CD86，参与免疫调节。MARCH-IV和MARCH-IX能有效减少MHC-I的表面表达，与病毒免疫逃逸相关。MARCH-V是线粒体外膜泛素化连接酶，通过调节线粒体融合蛋白MFN2、Drp1，增加长管状线粒体。MARCH-VI (TEB-4)和它的酵母同源物SSM4/DOA10都是内质网的跨膜泛素连接酶，参与内质网相关降解和内质网质量控制。MARCH-VII参与胚胎干细胞神经分化，并与胸腺发育有关[5]-[8]。MARCH-X和MARCH-XI参与精子的形成和发育[9] [10]。MARCH-III是MARCH-II最相近的同源物，能与MARCH-II和STX6相互作用，参与内体中囊泡运输调节。2022年，Luo团队[2]研究发现，高温条件下E3泛素连接酶MARCH-IX能够使ATG9A发生K63位泛素化修饰，ATG9A进而与维持高尔基体片层结构的蛋白GRASP55互作，并抑制GRASP55的寡聚化，抑制GRASP55连接高尔基体片层的作用，最终引起高尔基体片段化。
MARCH-II基因是Bartee课题组在2004年发现[1]，定位于19p13.2，基因全长25746 bp，其开放读码框编码246个氨基酸，相对分子量26995 Da。MARCH-II是二次跨膜蛋白，由N端RING domain、中间的二次跨膜区和C端的PDZ domain构成。MARCH-II能降解细胞表面受体如转铁蛋白受体和共刺激分子B7.2 (CD86)；MARCH蛋白与内质网以及溶酶体共定位。随后，Nakamura和他的同事发现，MARCH-II能与STX6直接结合，参与高尔基体和内体之间的运输。Xavier研究团队在HEK293T细胞中证实MARCH-II也能定位在细胞膜上，通过其PDZ motif与DLG1相互作用促进DLG1泛素化，减弱DLG1在细胞连接点的表达，影响细胞的极性。Han课题组证实MARCH-II能与β2AR相互作用，β2AR拮抗剂卡维地洛能够增强MARCH-II与β2AR的相互作用，促进β2AR的内吞和溶酶体降解。MARCH-II也能促进β2AR的泛素化，调节细胞表面的β2AR水平。Guggino科研团队研究发现，在CFBE细胞中，MARCH-II通过与CAL和STX6结合，能够泛素化并降解CFTR。
最近，Umthong课题组[3]揭示了人类MARCH2用于限制HIV-1的抗病毒机制，这对所有具有抗病毒功能的MARCH蛋白都有潜在的意义。Du等人[11]报道了MARCH2通过靶向tbk1负调控草鱼的抗病毒免疫反应。Zeng团队[12]的研究结果显示，膜相关泛素连接酶MARCH2和MARCH3靶向IL-5受体α负调控嗜酸性气道炎症。Yoo课题组[13]的研究表明，E3泛素连接酶MARCH2调节内质网–高尔基间室蛋白ERGIC3依赖的分泌蛋白运输。Chathuranga研究团队[14]报道了E3连接酶MARCH2是细菌或病毒感染时NEMO介导的信号传导的新型负向调节因子，MARCH2在感染后期直接与NEMO相互作用，并催化NEMO上Lys326的K-48连接泛素化，从而导致其降解。MARCH2的缺失导致对细菌/病毒感染的抵抗力及体内外先天免疫反应的显著增强。此外，由于细胞因子的大量产生，MARCH2-/-小鼠更易接受LPS挑战。总之，这些发现为NEMO的分子调控提供了新的见解，并表明MARCH2在先天免疫反应的稳态控制中发挥着重要作用。Sandow等人[15]报道的蛋白质组学分析表明，免疫整合素是膜相关环-CH (MARCH)蛋白MARCH2、3、4和9调节的主要靶标。2024年，复旦大学张英梅、葛均波及中国科学院分子细胞科学卓越创新中心胡荣贵共同通讯在Cell Discovery (IF 34)发表的研究[16]表明，E3泛素连接酶MARCH2通过负调控PGAM5/MAVS/NLRP3轴抑制心肌焦亡，保护心肌缺血再灌注损伤。Babon等人[17]报道了小鼠中单个MARCH蛋白的遗传删除对IL6Rα水平没有影响或影响很小，但MARCH2、3和4的联合删除显示选定的造血细胞亚群(包括CD8+和CD4+ T细胞)中IL6Rα的稳态水平升高。此研究扩展了MARCH蛋白的潜在免疫抑制作用，包括下调IL6炎症反应。Zhang等人[18]报道了膜相关的RING-CH (MARCH) 1和2是抑制HIV-1感染的MARCH家族成员。Seo课题组[19]的研究显示，MARCH家族E3泛素连接酶选择性靶向降解钙粘蛋白家族蛋白。近来，Yu研究团队[4]在GUT (IF 25)发表的研究揭示了胰腺导管腺癌血浆细胞外囊泡长链RNA(exLR)表达谱，并鉴定了8个exLRs (FGA, KRT19, HIST1 H2BK, ITIH2, MARCH2, CLDN1, MAL2, TIMP1)用于诊断胰腺导管腺癌，MARCH2是诊断标志物之一，并且诊断标志显示出很高的准确性。Yu等人[20]报道了MARCH1、2和8通过靶向弗林蛋白酶P结构域阻断埃博拉病毒包膜糖蛋白裂解。
我们的研究成功制备了MARCH2多克隆抗体，为进一步研究MARCH2的生物学功能打下了基础，在利用半定量RT-PCR方法分析MARCH2的表达谱时，我们发现MARCH2在32种肿瘤细胞系中呈广泛表达，在HeLa、U2OS、HCT116、COS7细胞中表达最高，在SKBR3、HGC-27、MGC-803细胞中低表达，提示MARCH2在肿瘤发生发展中有潜在作用。我们购买了组织芯片，利用免疫组织化学方法进一步分析了其在正常组织中的表达情况，染色结果显示，MARCH2呈广泛表达，在前列腺、肝组织中呈高表达，在横纹肌、甲状腺组织中呈低表达，主要在胞浆中呈现弥漫均匀细颗粒状分布。除此之外，我们还发现，MARCH2表达因肿瘤类型的不同有差异。与对应的正常组织相比，MARCH2在某些肿瘤(如前列腺癌、肝癌)组织中表达降低，而在某些肿瘤(如食管癌、结肠癌)组织中表达增高。MARCH2在不同类型肿瘤的差异表达及临床意义是什么？这个问题有待进一步研究。为了明确MARCH2在细胞内的定位，我们将GFP-MARCH2与DsRed-ER (DsRed标记的内质网定位序列)、DsRed-Golgi (DsRed标记的高尔基体定位序列)、表达质粒共转染HeLa细胞，24小时后用4%多聚甲醛固定，然后在激光共聚集显微镜下观察。结果显示，GFP-MARCH2能够与DsRed-Golgi和DsRed-ER发生非常明显的共定位，而与LAMP1-Cherry (溶酶体marker)、EEA1 (内体marker)呈部分共定位，而与MitoTracker (线粒体marker)没有明显共定位。除此以外，我们发现内源性MARCH2与Calnexin (ER的marker)及TGN46 (Golgi的marker)也呈现明显的共定位现象。上述结果证明MARCH2与内质网、高尔基体共定位，与溶酶体、内体部分共定位，与线粒体没有共定位。而近年研究揭示了高尔基应激、内质网应激是有效自噬诱导因素，且自噬在肿瘤发生发展中发挥着促进或抑制的双刃剑作用。而最近有研究报道了MARCH2是诊断胰腺导管腺癌的标志物之一。那么，MARCH2在高尔基应激、内质网应激、自噬及肿瘤中的作用到底是什么？这个问题有待进一步研究。
通过本研究发现了两个国际上亟待解决的科学问题。接下来，我们将在前期研究的基础上通过项目实施，解决这两个科学问题，以实现肿瘤细胞命运相关的理论突破。
基金项目
本研究由国家自然科学基金项目(81702776)、山东省医药卫生科技项目(202304010866)、临沂市重点研发计划(医学类) (2023YX0096)、山东省自然科学基金项目(ZR2020QH041)、山东省医药卫生科技项目(20230206735)、徐州医科大学附属医院发展基金项目(XYFM202348)资助。
NOTES
*通讯作者。