靶向APOE的神经退行性疾病研究进展

Research Progress of Neurodegenerative Diseases Targeting APOE

摘要: 载脂蛋白E (Apolipoprotein, APOE)基因是阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)公认的主要遗传风险因子。与APOEε3等位基因相比，APOEε4等位基因增加AD风险，ε2等位基因降低风险，在AD发病机制研究和治疗中受到重要关注。越来越多的证据表明APOE影响β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)和tau病理，参与神经系统疾病中的脂质代谢和神经炎症等脑内途径过程。因此，阐明APOE与AD之间联系，以AOPE为靶标，对于相关神经退行性疾病的治疗进展具有积极的意义。现以APOE在AD治疗中的最新研究进展及讨论未来靶向APOE的其他神经系统疾病治疗机会与策略进行综述。

Abstract: Apolipoprotein E (APOE) gene is a major genetic risk factor of Alzheimer’s Disease (AD). Compared with APOEε3 allele, APOEε4 allele increases the risk of AD, while APOEε2 allele decreases the risk, which has attracted great attention in the pathogenesis and treatment of AD. More and more evidences show that APOE affects the pathology of β-amyloid (Aβ) and tau, and participates in the brain pathways such as lipid metabolism and neuroinflammation in nervous system diseases. Therefore, it is of positive significance to clarify the relationship between APOE and AD and take AOPE as the target for the treatment of related neurodegenerative diseases. In this paper, the latest research progress of APOE in the treatment of AD and discusses the treatment opportunities and strategies of other nervous system diseases targeting APOE in the future.

1. 引言

衰老是生物体内一系列复杂的长期过程，不可避免。衰老与疾病密切相关，因为衰老是多种慢性疾病的最大风险因素。越来越多的证据表明寿命具有一定的遗传性。经过多项大规模全基因组关联研究(genome-wide association studies, GWAS)和GWAS荟萃分析，1993年发现的APOE基因的多态性是晚发性阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)的最强遗传风险因素[1]。AD是由多种因素引起的慢性神经退行性疾病，是最常见的痴呆症类型，β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)的沉积和tau过度磷酸化形成的神经原纤维缠结是其典型病理特征[2]。晚发性AD占总AD人口的95%以上，努力阐明APOE与AD病理生理关系，对于寻求新疗法的AD患者具有积极的意义。APOE对AD风险的改变长期以来一直被归因于其对Aβ的影响，但对大型尸检队列的系统神经病理学检查表明，APOE各基因型也与其他蛋白质病的存在和严重程度相关，神经炎症和脂质代谢目前被认为是该疾病发生和进展的重要因素[3]。此外，参与脂蛋白代谢的APOE是人类中唯一被证实的与年龄相关的基因。APOE是一种34kDa的脂质结合蛋白，1973年由Shore在极低密度脂蛋白(VLDL)中首次发现，主要分布在VLDL、乳糜微粒(CM)及其残骸中。APOE在脂蛋白代谢中起重要作用，APOE的功能是在多种组织中运输甘油三酯和胆固醇，它不仅能与LDL受体结合，还能与肝细胞膜乳糜微粒(CM)、VLDL残骸和一些HDL (其中含有APOE)受体结合。基于APOE蛋白在脑及外周脂蛋白代谢中的关键作用，其表达调控和表达类型与阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、多发性硬化症(MS)、血管性痴呆(VD)、心血管疾病(CVD)、2型糖尿病(T2DM)等疾病有着重要的联系(图1)。在这篇综述中，我们讨论了APOE参与AD病理生理学及开发APOE靶向AD疗法的最新研究进展，最后，我们讨论了APOE与其他神经系统疾病的的新联系，为靶向APOE治疗神经系统提供新的见解与策略。

2. APOE的生物学特性

APOE是一种由299个氨基酸组成的分泌糖蛋白，分子量34kDa，通过C-末端结构域结合胆固醇和磷脂，并通过N-末端结构域结合其受体。APOE具有三种异构体，第112位(APOE2和APOE3中的Cys, APOE4中的Arg)和158位(APOE2中的Cys，以及APOE3和APOE4中的Arg)处的两个氨基酸残基不同(如图2) [4]。这些多态性导致APOE异构体脂质结合特性和受体亲和力存在差异，其中与APOE3和APOE2相比，APOE4是低脂的[5]。它通过与细胞表面APOE受体结合，在血浆和中枢神经系统运输和输送胆固醇和其他脂质。受体是LRP1、LDL受体和APOE2受体，所有这些受体也是Aβ受体[6]，它在大脑整体健康和AD进展发展中发挥着不可或缺的作用。

Figure 1. Diseases associated with APOE

图1. APOE与疾病的联系

了解大脑中表达APOE的细胞类型非常重要，因为APOE是一种分泌性糖蛋白，具有自分泌功能，可能对分泌细胞和邻近细胞的旁分泌影响。中枢神经系统之外，APOE主要由肝脏产生，而大脑中APOE主要在星形胶质细胞、小胶质细胞、血管壁细胞和脉络丛中表达，但小胶质细胞和神经元应激或损伤条件下也会产生APOE。尽管星形胶质细胞是正常大脑中APOE的主要来源，但据报道，在AD患者脑中，Aβ斑块周围的大脑反应性星形胶质细胞缺乏APOE，而Aβ斑块相关的小胶质细胞则表达高水平的APOE [7]。神经病理学研究还报告了锥体神经元中的APOE染色在海马等神经退行性区域，锥体神经元中APOE的存在表明APOE脂质颗粒通过APOE受体LRP1从细胞间隙内化在其他细胞类型中的神经元中高度表达。对人类AD患者和对照大脑的单核RNA测序研究证实，反应性星形胶质细胞中的APOE表达下调[8]，而活化的小胶质细胞中的APOE表达上调[9]。了解APOE的风险变化有可能进一步阐明APOE与AD病理机制联系，对于AD具有极大的治疗价值。

Figure 2. The structure model diagram of APOE subtypes

图2. APOE各亚型结构模型图

3. APOE与AD的病理生理学功能

3.1. APOE与Aβ

APOE与Aβ共同沉积在淀粉样斑块中，APOE与病理性Aβ沉积的相互作用似乎是APOE参与AD风险的中心机制。在淀粉样模型小鼠中敲除内源性APOE可将Aβ斑块的形态由致密改变为弥散状态[10]，这表明APOE在Aβ斑块负荷中发挥重要作用。重要的是，APOE以异构体依赖的方式影响AD的Aβ病理。相对于APOEε3基因型，APOEε4基因型携带者具有较高的Aβ斑块负荷和更严重的脑淀粉样血管病，而APOEε2基因型携带者具有较低的Aβ斑块负荷，这些差异效应已通过PET成像在临床前和临床阶段得到证实[11]。在生理条件下，APOE参与Aβ的形成过程，因为APOE和Aβ可以竞争相同的受体，即参与神经元、星形胶质细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、周细胞清除Aβ的LRP1受体[12]。在死亡AD患者脑组织中发现APOE4会加剧Aβ在神经内的积聚而引起神经毒性[13]。在APOE过表达的小鼠中转入APOE4的小鼠产生的Aβ量是APOE2和APOE3过表达小鼠模型的2~4倍。在学习记忆功能方面，Aβ和APOE4联合作用也会使非痴呆老年人的记忆力下降[14]。

除了可以促进Aβ斑块的形成外，APOE4还通过受体介导的清除和蛋白降解等多种机制参与Aβ的清除。由于Aβ是淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)处理在大脑中持续产生Aβ的结果，因此有效清除Aβ对于防止Aβ积聚至关重要。可溶性Aβ从脑间质液中的清除是以APOE异构体依赖的方式进行的，神经元上的LRP1受体被证明通过摄取Aβ来介导APOE的清除，APOE4与Aβ形成的络合物稳定性降低，这一摄取过程受到损害，受体结合的改变和APOE对Aβ受体结合位点的竞争进一步加剧了这种清除障碍，导致存在APOE4的情况下受体介导的Aβ清除显著减少[15]。此外，可溶性Aβ可被蛋白水解酶清除，如金属内肽酶、纤溶酶原激活剂、基质金属蛋白酶和溶酶体多肽酶[16]。已有研究表明，APOE通过胞外间隙中的内啡肽和胰岛素降解酶促进小胶质细胞内Aβ的降解。脂化APOE的表达增强也通过LXRs和ABCA1刺激蛋白水解性Aβ的降解[17]。鉴于APOE4是一种不如APOE2和APOE3有效的脂类转运体，APOE4介导的蛋白水解物影响Aβ清除。这是因为APOE4与Aβ结合会抑制降解Aβ通路，导致Aβ无法及时清除，因此加剧了Aβ的聚集并损伤神经系统功能[18]。这些结果表明，APOE4是促进Aβ在体内聚集的关键因素，干扰APOE4可以有效影响AD中的Aβ病理过程。

3.2. APOE与tau

细胞内tau蛋白过度磷酸化造成的神经纤维缠结是AD病理的另一个标志。APOE4在Aβ寡聚体的存在下可以增加tau的磷酸化。人的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)衍生的高表达APOE4的神经元比APOE3表达的神经元有更高水平的tau磷酸化与突触的丢失[19]。在过度表达tau的P301S突变形式的转基因APOE基因敲除小鼠研究表明，APOE影响tau下游病理[20]。与APOE3相比，APOE4促进tau诱导的神经变性和萎缩，最近的一项研究表明，APOE2明显调节蛋白磷酸酶2A的活性，这是人脑中的一种主要的tau磷酸酶，可以提供对AD风险的保护[21] [22]。这些结果证明了APOE在AD的tau发病机制中的作用以及tau介导的神经毒性，APOE可能以一种异构体依赖的方式影响tau在细胞内的运输。

早期的研究表明，APOE结合到tau区域，被认为是聚集成致病神经纤维缠结的原因。推测APOE可能直接与tau结合并阻断其磷酸化位点，这种相互作用也是异构体特异性的，APOE3与tau的微管结合区的结合亲和力比APOE4强得多[23]。APOE4与tau结合的亲和力降低可能会增加GSK3介导的tau过度磷酸化的可能性和可用性，从而导致神经纤维缠结的形成增加[24]。另一种假设是，APOE4通过增加GSK3活性，导致tau磷酸化增加，从而抑制通过LRP5/6受体的Wnt信号通路[25]。为了更好地了解APOE在tau发病机制中的作用，这些潜在的机制仍在继续研究。了解APOE对tau的作用机制有助于抗tau治疗的发展。综上所述，这些发现表明APOE影响tau病理，甚至独立于Aβ病理，后者有助于疾病进展。因此，在tau病的背景下了解APOE的分子机制可能会为开发治疗AD和其他tau相关神经退行性疾病的策略提供关键信息。

3.3. APOE与脂质代谢

作为大脑中主要的脂质转运体，APOE以异构体依赖的方式调节脂质和胆固醇代谢[26]。大脑脂质含量非常丰富，脂质功能会随着年龄和疾病变化而发现改变，因此，脂质代谢紊乱与AD密切相关，早期发现干预脂质代谢对于AD具有指导意义[27]-[29]。APOE是外周和中枢神经系统的脂质载体，通过调节多种途径参与AD的发病，包括Aβ蛋白的代谢，脂质的转运等。在促进胆固醇外流方面的不足可能会导致其在细胞内积聚，从而导致细胞毒性[30]。在大鼠原代星形胶质细胞和神经元中，重组APOE2更有效地促进胆固醇和磷脂酰胆碱的外流，其次是APOE3，然后是APOE4。在人类观察性队列研究中，不同APOE基因型个体表现不同的血脂谱。与APOE3携带者相比，APOE2和APOE4携带者的总胆固醇和血浆甘油三酯水平较高[31]。APOE4与较低的胆固醇转运能力和增加的脂滴堆积可能是APOE4导致AD的主要机制之一。APOE在细胞层面调节多种生理或病理过程，包括细胞骨架的组装和稳定、线粒体的完整性和功能以及树突的形态和功能。因此，阐明APOE对生理和病理生理作用具有重要意义。

3.4. APOE与神经炎症

越来越多研究表明，神经炎症在神经退行性变过程中发挥重要关键作用，并受到APOE的调节。小胶质细胞常见于死亡脑组织周围的斑块周围，证实可介导炎症反应和淀粉样斑块的吞噬。有趣的是，APOE缺陷小鼠对斑块的小胶质细胞反应性降低，APOE可以通过影响小胶质细胞的正常免疫活动来调节神经炎症。在大脑中APOE4可以刺激小胶质细胞增生分泌炎症介质，加剧大脑的神经炎症[32] [33]。APOE4刺激小胶质细胞分泌细胞因子的同时，也损害了小胶质细胞的吞噬功能[34]。在AD患者调查研究显示，与无慢性炎症的APOE4携带者相比，APOE4合并慢性炎症会增加AD的风险[35]。总之，APOE4可以通过激活小胶质细胞及增加小胶质细胞分泌的细胞因子来调节神经炎症，加速AD的发生发展(如图3)。因此，靶向APOE介导的炎症反应可以减轻AD的病理改变和神经变性，是一种有待探索的有效治疗方法。

Figure 3. APOE and pathophysiology of AD

图3. APOE与AD病理生理学

4. 靶向APOE的AD治疗

APOE一直被认为是AD最强的遗传风险因素，但目前还没有针对APOE的FDA批准的治疗AD的疗法。虽然APOE在AD发病机制方面已经得到了广泛的研究，但仍有更多的机制需要了解。在这里，重点介绍该领域的一些最新研究进展(如表1)，可能有助于指导新的APOE靶向治疗策略。

4.1. 调控APOE量和酯化水平

由于APOE在Aβ斑块形成中起主要作用，可集中于调节APOE水平以防止或减少AD的病理发展。大脑中的APOE4比APOE2和APOE3的脂化水平低且稳定，因此，增加大脑中的APOE4与脂质结合，可能加速Aβ的清除。目前研究方向主要针对于肝X受体和类视黄醇X受体的激动剂，即贝沙罗汀通过诱导 ABCA1和ABCG1基因表达，增强APOE的脂质化，并增加APOE的表达水平，可快速降低AD小鼠脑内的Aβ斑块负荷，改善认知能力。目前贝沙罗汀正在进行针对于AD治疗的临床试验[36]。但是该药的中枢神经透过性很差，还会导致系统毒性，比如肝脏特定代谢通道被激活引起的高甘油三酯血症。目前增加APOE脂化对于Aβ病理的影响还不能完全确定。APOE靶向治疗已成为考虑新疗法的一个有吸引力的途径。

4.2. 靶向APOE结构与Aβ的结合

对于清除脑中由Aβ沉积形成的斑块是治疗AD的一条前途的途径，努力开发阿杜卡努单抗，这是目前FDA新批准的一种针对淀粉样蛋白聚集物的治疗方法。一项临床试验结果报告另一种抗Aβ药物来卡尼单抗可能会在18个月内将早发AD患者的认知能力下降速度减缓27%，已获批准治疗AD [37]。然而，这种新疗法的长期安全性和有效性仍有待探索。而基于Aβ病理发生和APOE脂化的APOE基因型依赖性作用，用腺病毒转染使APOEε2基因在小鼠模型中过表达，能够有效降低Aβ水平。HJ6.3，一种针对APOE的单抗，利用一种与APOE结合的合成多肽Aβ12-28P干扰APOE和Aβ的结合，可显著降低APP/PS1转基因记忆缺陷小鼠脑内不溶性Aβ水平、Aβ斑块负荷和APOE水平，改善空间学习能力，并且不改变血浆胆固醇水平[38]。利用基因编辑将APOE4的氨基酸序列转换成APOE3或APOE2，能够通过增强胶质细胞内吞Aβ减少Aβ沉积改善AD，降低APOE4水平可能有助于减轻AD的病理。对于以上研究，APOE基因是否会进一步改变该药物的安全性和有效性，还需要进一步的研究。

4.3. 靶向APOE受体

CRISPR/Cas9编辑技术用于编辑转换APOE等位基因的应用已在细胞培养层面获得成功，在iPSCs技术来源的神经元中，CRISPR/Cas9将APOE4修正为APOE3基因型，结果显示可降低细胞毒性、tau分泌和tau磷酸化，但仍有待在小鼠敲除实验中验证[39]。根据这样的思路，将APOE4基因转化为APOE3或APOE2，似乎是最理想的治疗方法。应用基因治疗来表达APOE2并提高APOE4携带者(甚至是APOE3纯合子)中的APOE2表达水平已成为可能，该方法正在进行临床试验。目前主要停留在动物甚至是细胞或分子层面，较少能真正进入临床试验。近期，施一公团队靶向APOE4发现其受体LilrB3，揭示AD最强风险因子致病原因[40]，该靶点仍有巨大潜力，希望在不久的将来能看到新的突破。

Table 1. The AD research of targeting APOE

表1. 靶向APOE的AD研究

类型(Type)	途径(Route)	模型(Model)	年龄(Age)	结果(Results)
提高APOE水平
贝沙罗汀	口服	APP/PS1小鼠	7~8月	APOE、ABCA1、ABCG1和高密度脂蛋白升高；减少可溶性和不溶性Aβ和Aβ斑块；记忆力提高

续表

贝沙罗汀	口服	Tg2576小鼠	12~14月	改善社会行为，嗅觉
普罗布考	口服	野生大鼠	26月	海马APOE、APOEmRNA、HMGCoAR、LRP和SNAP25增加；未改变胆固醇、低密度脂蛋白受体和突触素；减少胶质纤维酸性蛋白
普罗布考	腹腔注射	小鼠	90天	降低血浆胆固醇；改善记忆和突触
阻止APOE与Aβ作用
HJ6·3 anti-APOE antibody	腹腔注射	APP/PS1	7月	减少可溶性和不溶性Aβ、Aβ斑块、脑APOE、CD45+小胶质细胞，增加血浆Aβ；脑淀粉样血管病、血浆APOE和血浆胆固醇无变化
Aβ12-28P	腹腔注射	APP/PS1转/APOE2 APP/PS1转APOE4	6月	可溶性和不溶性APOE、Aβ斑块、营养不良神经突起和血清胆固醇减少；记忆力提高(仅APOE4敲入小鼠)；血清APOE不变
APOE4转化APOE2/3
AAV4 and APOE2，APOE3，or APOE4	腹腔注射	APP/PS1小鼠	7月	AAV4-APOE2-APOE3：可溶性和不溶性Aβ、Aβ斑块和营养不良神经突起减少，血浆Aβ无变化；突触增多。AAV4-APOE4 -APOE3；可溶性和不溶性Aβ、Aβ斑块、营养不良性神经突起和血浆Aβ增加；突触减少
AAV4 and APOE2，APOE3，or APOE4	腹腔注射	Tg2576小鼠	16~18月	AAV4-APOE2-APOE3：间质液Aβ和寡聚Aβ减少，不溶性Aβ不变。AAV4-APOE4-APOE3：间质液Aβ、寡聚Aβ和不溶性Aβ增加

5. APOE与其他神经退行性疾病

5.1. APOE与帕金森

尽管帕金森(PD)有一些与AD相似的临床和神经病理学特征，但仍有许多不一致的特征。与AD相比，PD在大多数人中进展缓慢，对65岁以上人群的影响较小(PD 2%对AD 13%)。至今，APOE与PD之间的关联仍存在争议。Hardy的研究注意到APOEɛ4等位基因与AD之间存在很强的关联，但APOEɜ4等位基因与PD之间没有关联[41]。此外，APOEɛ4不会加重PD患者的AD病变。然而，Li和Pulkes的研究证明了APOE与中枢神经系统PD之间的关联[42]。另一项研究表明，APOE2与帕金森病发展的风险较高有关[43]，除此之外，强有力的证据表明APOE4携带基因是构成帕金森痴呆(PDD)-APOE2的危险因素，而APOE3可能不会改变PDD的风险[44]。到目前为止，APOE在PD中的作用仍然没有定论，仍是需要解决的问题。

5.2. APOE与血管性痴呆

血管性痴呆(VD)是一种严重的认知障碍，通常发生在缺血性中风、出血性中风和脑血管疾病之后。VD是仅次于阿尔茨海默病的痴呆症的第二大常见原因之一，导致约15%的病例[45]。临床表现为淀粉样斑块、神经原纤维缠结、白质病变等病理特征，与AD相同。VD的危险因素很多，包括高血压、缺血性卒中、出血性卒中、动脉粥样硬化和其他代谢紊乱；除此之外，APOE也被认为是VD的重要危险因素，但结论是相互矛盾的。一些研究表明，APOE4等位基因与VD风险增加之间存在正相关[46]；相反，Kawamata的研究发现APOE4等位基因与日本人VD之间没有明显的关联[47]。

5.3. APOE与缺血性中风

中风是一种由于脑部血流不畅导致细胞死亡的疾病。中风主要有两种类型：缺血性中风(IS)，由于血流不足，以及出血性中风(HS)，由于出血。由于APOEɛ4等位基因与LDL和胆固醇水平升高有关，APOE可能会影响IS的发生；几项荟萃分析报告称IS与APOEɛ4等位基因之间存在显著关联，已证明APOEɛ4携带者患者发生IS的风险显著增加[48]。此外，APOEɛ4等位基因与颈动脉内膜中层厚度增加有关，这与IS有关。IS是环境因素和各种遗传因素(mthfr, APOE, pon1, pde4d等)相互作用的结果，每种基因的影响不如AD中那么大，但预计影响不大[49]。遗传因素的影响可能被IS中的后天风险因素所掩盖。然而，APOE基因似乎是研究遗传和后天风险因素之间相互作用的有力候选基因。

5.4. APOE与多发性硬化症

多发性硬化症(MS)是中枢神经系统最常见的脱髓鞘疾病。MS通常发生在20至50岁之间，女性比男性更常见。病变的特征是视神经、脊髓和脑干的多发性病变、缓解和复发[50]。到目前为止，一些研究表明载脂蛋白E4等位基因或2等位基因与MS之间存在负相关关系或MS患者的认知障碍，而一些研究表明，患有MS的APOEɛ4携带者的认知缺陷进展比非携带者更严重[51]。总之，APOEɛ4等位基因与MS患者认知功能障碍之间的可能关系很小，总体上表明存在联系。

6. 结论与展望

APOE是一种与神经系统密切相关的载脂蛋白，其基因多态性不仅与脂类代谢密切相关，而且与多种神经系统或神经退行性疾病及心血管疾病密切相关，如AD、PD、VD、MS、IS等。本文着重介绍APOE与神经退行性疾病的关联。APOE(尤其是APOE4)与AD的关联性很强，并且已为人所知数十年；关于APOE如何在Aβ依赖性和Aβ非依赖性途径中发挥作用，已提出了多种理论。相反，APOE与其他神经系统或神经退行性疾病的关联性不如AD那么强，APOE表达及APOE多态性的影响也存在争议，这可能是由于遗传因素和环境因素(获得性因素)的复合影响所致。综上所述，APOE与发病风险之间的关联尚不明确，但APOE是人类疾病诊断、风险评估、预防和治疗不可或缺的因素。

越来越多的证据证实APOE在AD的发病机制中起着关键作用。APOE4通过获得毒性功能和失去保护功能来传递风险，而APOE2通过重叠和不同的机制保护AD。APOE影响Aβ、tau蛋白和其他神经病理，同时也影响神经退行性变的脂质代谢和神经炎症反应。APOE在神经退行性变和认知功能减退的复杂通路中扮演上游中介的角色，使其成为治疗AD和相关神经疾病的理想靶点。随着我们对APOE的结构与功能关系以及APOE与AD机制关系更深入了解，可以通过多种技术调节APOE的水平、结构、脂化、寡聚化以及相关指标来改变病理进展。

通过多组学分析、细胞类型特异性功能和新APOE变体探索系统变化的进一步研究可能会进一步为AD治疗开发的未来产生关键的见解。此外，采用新的研究和治疗技术将被证明对开发AD的新治疗方案至关重要。由于APOE由大脑和外周的多种细胞类型表达，因此还需要研究APOE在AD发育的不同阶段的细胞自主和细胞非自主效应的具体贡献，可能需要使用特定小鼠模型和人脑器官结合人类研究。基于APOE靶向疗法的建立是一个相当大的挑战但也为AD的预防和治疗提供了巨大的希望。

NOTES

^*通讯作者。