1. 引言
乙基丙二酸脑病(EE)是一种罕见的常染色体隐性遗传的代谢性疾病，其发病机制与ETHE1基因的突变密切相关。ETHE1基因编码硫双加氧酶，该酶在细胞内参与硫化物代谢过程，维持细胞内硫化物的平衡。ETHE1基因突变会导致酶活性的丧失，进而引发乙基丙二酸(EMA)在体内的异常积累[1]。乙基丙二酸的异常积累可导致中枢神经系统的损害，其特征为进行性脑病、复发性瘀点、肢端发绀和慢性腹泻，在生命早期具有致死性结局。本病的主要神经病理特征是基底节和脑干的对称性坏死病变[2]。并且该病在全球报道不超过100例[3]，本文报道一对兄弟患有轻型乙基丙二酸脑病，并结合国内外文献复习，旨在加深对该疾病的认识，并为未来的研究和临床实践提供参考。
2. 临床资料
2.1. 病史
患者1，18岁男性，3岁时因“劳累后出现双下肢无力”就诊，其症状随后恶化，表现为持续的肌肉僵硬、萎缩，以及下肢明显畸形。情绪波动或寒冷环境时症状加重，出现肌肉震颤及皮肤发紫。特别是膝关节出现强直，不能屈伸，并伴有膝内翻。行走困难，脚跟无法触地，支具辅助行走。
患者2，22岁男性，18岁时因“劳累后出现下肢无力及僵硬”就诊，此后病程中，患者在进行体力活动或处于寒冷环境时，下肢无力症状加重，并在情绪紧张时症状明显，常表现为下肢无力并伴随肌肉震颤。未伴有畸形或疼痛。
2.2. 既往史、个人史、家族史
患者1为早产儿，患者2足月顺产。两者在孕期胎动和羊水量均处于正常范围，无出生时缺氧记录。在发育上，两名患者在1岁前开始说话，6个月时能坐，1岁半时能行走。患者1在3岁时开始表现出运动发育异常，12岁外院诊断“脑性瘫痪”，14岁时行臀部萎缩肌肉切除术并行康复治疗。患者2在18岁前的精神运动发展未见异常，无其他病史。父母体健，近亲婚配。
2.3. 体格检查
患者1：意识清楚，言语流利，记忆力、计算力减退，正常面容，双侧瞳孔等大，直接、间接对光反应正常。双眼视力正常，眼球各方向运动正常，眼震未引出，双耳听力正常，闭目闭唇肌力正常，咀嚼与吞咽功能正常，余脑神经检查未见异常。四肢肌力正常，肌张力轻度升高，下肢膝盖内翻畸形，无法屈伸，下肢腱反射活跃，踝阵挛未引出，双侧病理征阴性，脑膜刺激征阴性，指鼻、快复轮替试验正常，跟膝胫试验不合作，支具辅助行走，闭目难立征不合作。心、肺、腹查体未见明显异常。患者2：意识清楚，言语流利，记忆力、计算力正常，正常面容，双侧瞳孔等大，直接、间接对光反应正常。双眼视力正常，眼球各方向运动正常，眼震未引出，双耳听力正常，闭目闭唇肌力正常，咀嚼与吞咽功能正常，余脑神经检查未见异常。四肢肌力正常，肌张力轻度升高，下肢腱反射活跃，踝阵挛阳性，双侧病理征阳性，脑膜刺激征阴性，指鼻、快复轮替试验正常，跟膝胫试验欠稳准，宽基步态，闭目难立征阴性。心、肺、腹查体未见明显异常。
2.4. 实验室常规检查
患者1血、尿、粪便常规、肝、肾功能、血脂、血糖以及电解质均无明显异常。患者2血、尿、便常规、肝、肾功能、血脂、血糖以及电解质均无明显异常。
3. 影像学
对两位患者进行颅脑磁共振成像检查，结果显示两例患者均存在脑部异常表现(见图1、图2)。
Figure 1. Symmetrical high signal intensity on T2-weighted imaging (T2WI) and symmetrical low signal intensity on diffusion-weighted imaging (DWI) in the bilateral caudate nucleus and lentiform nucleus of Patient 2. (A) T1 FLAIR; (B) T2; (C) T2 FLAIR; (D) DWI
图1. 患者2双侧尾状核、豆状核T2WI呈对称性高信号，DWI呈对称性低信号。(A) T1 FLAIR; (B) T2; (C) T2 FLAIR; (D) DWI
Figure 2. Patchy ischemic demyelinating changes in the periventricular white matter of the posterior limbs of the lateral ventricles in Patient 1. (A) T1; (B) T2; (C) T2 FLAIR
图2. 患者1双侧侧脑室后脚脑白质内斑片状缺血性脱髓鞘改变。(A) T1；(B) T2；(C) T2 FLAIR
4. 尿液有机酸检查
在之前的文献复习中，我们注意到有关于患者尿液中有机酸代谢异常的报道[4]，高水平的乙基丙二酸是EE的生化标志物以及高乳酸血症。因此我们从两名患者中收集了尿液样本，并通过液相色谱–串联质谱(LC-MS)技术进行有机酸含量的详细分析。具体地，采用Waters XEVO TQ-S Micro串联四级杆质谱系统进行质谱分析。数据的定量分析采用了TargetLynx定量软件，通过设定一系列不同浓度(5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10,000 ng/mL)的标准品，我们构建了相应的标准曲线(见图3、图4、图5)。基于这些标准曲线，我们准确计算出尿液样本中有机酸的浓度(表1)。
结果表明，两名患者的尿液有机酸分析中呈现显著不同的谱图。尤其是乙基丙二酸和乳酸浓度的增高，证明病理状态的有机酸代谢紊乱。
Figure 3. Standard curve for lactate
图3. 乳酸标准曲线
Figure 4. Standard curve for pyruvate
图4. 丙酮酸标准曲线
Figure 5. Standard curve for ethylmalonic acid
图5. 乙基丙二酸标准曲线
Table 1. Concentrations of organic acids in patient urine
表1. 患者尿液中有机酸浓度
|
乳酸ng/mL |
丙酮酸ng/mL |
草酸ng/mL |
富马
酸盐ng/mL |
琥珀
酸盐ng/mL |
苹果酸ng/mL |
草酰
乙酸ng/mL |
α-酮戊二酸ng/mL |
柠檬
酸盐ng/mL |
丙二酸乙酯ng/mL |
苯乙酸ng/mL |
丙二酸ng/mL |
患者2 |
17581.71738 |
10848.38353 |
20543.47073 |
214.2968305 |
3259.532443 |
587.6271017 |
34.06995063 |
31575.60207 |
401822.2022 |
179808.4301 |
315.1440454 |
532.1039908 |
患者1 |
13292.73276 |
5560.39669 |
20158.23756 |
99.12313205 |
1691.416219 |
268.9957626 |
26.42950597 |
12821.02932 |
137878.1482 |
41802.01608 |
193.1186226 |
1005.398864 |
5. 基因检测
为明确诊断，本次就诊经患者及家属知情同意，并经伦理委员会批准后，采集包括患者及其父母的外周全血标本，EDTA抗凝，进行全外显子测序，采用血液基因组DNA提取试剂盒(QIAampDNABloodMiniKit, Qiagen)提取DNA，用HiseqX10进行高通量测序，测序数据经评估合格后，使用BWA软件对全外显子测序结果与参考基因组序列进行比对，再通过GATK识别变异位点，并用Annovar软件对变异位点进行注释获取原始变异位点数据。ETHE1基因检测结果：两例患者具有c.586G>A (p.D196N)纯和突变、其父母具有c.586G>A (p.D196N)杂和突变(见图6、图7、图8、图9)。
患者1与患者2 ETHE1外显子区域存在一处c.586G>A (鸟嘌呤 > 腺嘌呤)的杂合变异(反义链)，导致氨基酸改变p.D196N (天冬氨酸 > 天冬酰胺)，为致病变异。
两例患者均携带ETHE1基因c.586G>A纯和变异，遗传自他们表型正常的父母(图12)。根据ACMG
Figure 6. Genetic testing results of Patient 1
图6. 患者1基因检测
Figure 7. Genetic testing results of Patient 2
图7. 患者2基因检测
Figure 8. Genetic testing results of the patient’s mother
图8. 患者母亲基因检测
指南，该突变可评级为致病变异PS1 + PM1 + PM2 + PP3。
(PS1：与先前已确定为致病性的变异有相同的氨基酸改变；PM1：位于热点突变区域；PM2：ESP数据库、千人数据库、EXAC数据库中正常对照人群中未发现的变异；PP3：多种统计方法预测出该变异会对基因或基因产物造成有害的影响，包括保守性预测、进化预测、剪接位点影响等。)
以“乙基丙二酸脑病”、“ETHE1”作为关键词，在中国知网、万方数据库、维普数据库、中国
Figure 9. Genetic testing results of the patient’s father
图9. 患者父亲基因检测
Figure 10. Mutation Taster software predicts that the treatment of this point is pathogenic
图10. Mutation Taster软件预测该点位治病具有致病性
Figure 11. Polyphen-2 software predicted the pathogenicity of the mutation, with a score of 0.994, a sensitivity of 0.69, and a specificity of 0.97
图11. Polyphen-2软件预测该突变致病性，得分为0.994，敏感性0.69；特异性：0.97
生物医学文献数据库、PubMed进行文献检索，我们发现了一篇文献中报道与本研究相同突变位点(c.586G>A)的病例报道[2]。在人类基因突变数据库(HGMD)中搜索ETHE1基因，发现共有37个突变位点与乙基丙二酸脑病相关。使用Polyphen-2和Mutation Taster等生物信息学软件对ETHE1基因c.586G>A突变进行致病性预测，结果表明其具有致病性(图10、图11)。根据患者的临床表现、检验检查以及突变生物信息学分析，两位患者被诊断为EE。
6. 家系调查
Figure 12. Family genetic pedigree
图12. 家系遗传系谱图
7. 讨论
乙基丙二酸脑病的发病机制是氧化应激、线粒体功能受损和细胞能量代谢紊乱。研究表明硫化氢和乙基丙二酸引起的生物能及氧化还原稳态紊乱是神经系统损伤的重要病理机制，并且该机制被广泛报道在其他遗传性代谢性疾病中。
ETHE1基因编码的硫双加氧酶是线粒体基质中的关键酶，参与乙基丙二酸的代谢过程。硫双加氧酶的主要功能是分解硫代醚酯为酰辅酶A和硫醇，维护细胞内硫化物的平衡，并在硫化氢的线粒体代谢中起到重要作用[5]。硫双加氧酶可以防止有毒的硫化氢(H2S)积累，从而维持细胞的代谢稳态。细胞色素c氧化酶(COX)的正常活性对于线粒体的能量生成至关重要，而硫化氢的积累可导致COX活性抑制，影响线粒体功能和细胞能量代谢。此外硫双加氧酶通过与特定的细胞信号分子相互作用，参与细胞凋亡，影响诱导的细胞凋亡过程[6]。
首先，氧化应激在乙基丙二酸脑病的发展中扮演重要角色。氧化还原稳态的破坏是由于代谢物积累引起的，硫化氢可以在线粒体内与谷胱甘肽(GSH)结合，降低细胞内GSH水平，而GSH可以防止氧化损伤，这样就导致细胞内氧化损伤和炎症反应的增加[7]。另外研究表明乙基丙二酸(EMA)在大鼠大脑皮层中引发脂质、蛋白质氧化损伤以及活性氧(ROS)的增加，ROS在高浓度下或抗氧化能力下降时，会导致氧化应激，从而破坏细胞的正常功能[8]。
其次，线粒体功能受损也被认为是乙基丙二酸脑病的重要机制之一。乙基丙二酸的异常积累干扰线粒体的正常功能，进而影响细胞的能量代谢和正常的生物学过程。线粒体功能受损不仅导致细胞内能量供应不足，还可以导致线粒体肿胀以及影响细胞内的钙离子平衡。线粒体是细胞中ROS的主要来源，生理水平上参与调控许多细胞过程的关键信号通路，钙离子在细胞中作用广泛，尤其作为信号离子，线粒体调节其代谢，当钙离子内流超出线粒体缓冲能力时以及ROS的高浓度，会导致线粒体的肿胀。在细胞凋亡过程中，线粒体肿胀也是加快其进程的因素之一。其他线粒体过程的破坏，如线粒体动力学及ER-线粒体通讯也曾被证实[7]。
此外，硫化氢的积累导致细胞能量代谢的紊乱。硫化氢是一种呼吸链细胞色素c氧化酶的强效抑制剂，干扰脑和其他组织中的线粒体呼吸，乙基丙二酸通过损害琥珀酸和苹果酸转运来抑制线粒体呼吸，并且会扰乱呼吸链电子传递，破坏三羧酸循环，导致糖酵解激活，造成进一步乳酸的堆积，可能造成患者乳酸酸中毒[9]。细胞能量代谢的紊乱可能对各个组织和器官产生广泛的影响。中枢神经系统是高度依赖能量供应的组织，对能量代谢紊乱尤为敏感。乙基丙二酸在中枢神经系统的异常积累可能导致神经元功能受损、细胞凋亡以及神经传导紊乱，进而导致乙基丙二酸脑病的临床表现。
本文结合文献报道，乙基丙二酸脑病的主要神经影像学特征进行了分析。根据已有报道，乙基丙二酸脑病的典型神经影像学特征主要包括基底神经节和脑干中的斑片状双侧坏死性病变、脑皮质和胼胝体的变薄，以及半卵圆中心的白质营养不良性变化[10]。我们的研究中，患者2展现了一系列与乙基丙二酸脑病相符的影像学表现。患者2的双侧尾状核和豆状核在T2WI序列中呈对称性高信号，而在DWI序列中呈对称性低信号。这种T2WI和DWI序列的对比显示了患者2中基底神经节区域的异常信号变化，且在过去的文献也有报道[3] [4]，另外患者1在影像学检查中显示的双侧侧脑室后脚脑白质内斑片状缺血性脱髓鞘改变。这种缺血性脱髓鞘改变可能是ETHE1损失后组织中硫化物浓度增加，尤其硫化氢(H2S)，具有血管活性和血管毒性作用[11]，这可能解释脑部影像中的缺血性病变，且有病例报道中出现类似的影像学表现，主要为脑半球内存在急性缺血性损伤的多个病灶[11]。因此两例患者在影像学上的改变进一步支持了这些典型影像学特征的存在。
Figure 13. 3D image of 196 amino acids in PolyPhen-2
图13. PolyPhen-2中196氨基酸3D图
乙基丙二酸脑病的主要临床特征是硫化氢(H2S)介导的，并且包括弥漫性微血管损伤，其由瘀点性紫癜、直立性肢端发绀、间皮表面和肠粘膜的出血性渗血与慢性腹泻组成，其中3~4月出现腹泻，7~8月出现神经运动发育迟缓，一般2岁之前病情恶化死亡[12]。两例患者慢性腹泻相比其他文献报道为轻，且均未见长时间站立后肢端发绀，但均可见双下肢反射活跃及肌张力的异常，患者1存在下肢受冷后瘀斑，没有发现典型的神经系统外EE标志性特征，我们报道的两例病例，发现均携带p.D196N突变(见图13)。该突变在既往文献中已被证明与较温和的临床表现和较晚的发病时间相关[2]。这种突变改变ETHE1蛋白的结构，从而间接影响其催化活性。并且携带这一突变的患者通常表现出较轻的表型，同时也进一步支持了轻度表型的发病机制较晚、进程较缓的理论。这类临床表现与硫化氢(H2S)蓄积有关，硫化氢(H2S)是哺乳动物中的内源性信号传导分子，调节血管张力、心肌收缩性、神经传递、胰岛素分泌和多种病理[13]，且在一些研究中ETHE1突变导致多种蛋白质在骨骼肌中发生了改变[1]，并且ETHE1编码的硫双加氧酶是线粒体特有的代谢途径，导致骨骼肌中线粒体呼吸复合物IV的活性降低[14]，并且神经功能的恶化也会存在骨骼的畸形[3]这与两例患者的肌肉及力量的异常有密切的关系。在生化特点上，乙基丙二酸脑病患者表现为持久性乳酸酸中毒、典型的乙基丙二酸尿症及血液丁酰肉碱及异戊酰肉碱浓度显著增高[2] [15]。本例患者尿液中乙基丙二酸、乳酸升高，血乳酸均正常。
在比较患者1和患者2的尿液有机酸水平时，我们显著发现患者2的尿液中有机酸含量高于患者1，更高的有机酸水平也印证了其病情较为严重。由于EE的临床症状与有机酸代谢异常的程度密切相关，因此这种尿液中的变化揭示了疾病的进展及严重性，为临床评估和疾病管理提供了关键信息。这对于EE的早期诊断极具价值。
由于没有特效药物，EE预后不佳，严重神经系统损伤导致大部分患者在年幼时死亡。国内外文献报道中，尽管给予左卡尼汀、维生素B1、B2、辅酶Q10、核黄素等治疗，但其临床症状没有得到改善[16]。国外的研究中，通过减少肠道硫化物的产生，如联合使用N-乙酰半胱氨酸与甲硝唑，可以缓解患者的部分症状[17]。此外，通过基因治疗和肝移植的方法，在小鼠模型中恢复了硫化氢水平，并在8个月大的EE患儿中观察到脑磁共振和生化指标的改善[12]。
本次报道中发现的ETHE1基因突变(c.586G>A)在国外报道中较为罕见，仅出现1例病例中[18]，说明c.586G>A是的ETHE1基因罕见的致病突变点位。乙基丙二酸脑病早期很难根据临床表现、实验室检查、影像学等来判断，全面的评估对于帮助疾病诊断具有重要意义，基因检测及有机酸分析在该类疾病重要诊断工具，这也可能在未来为建立精确的医学治疗方法并防止这种罕见疾病的发展提供研究基础。
致 谢
向所有为本研究作出贡献的作者致以最诚挚的感谢。
声 明
该病例报道已获得病人的知情同意。
NOTES
*通讯作者。