1. 引言
子痫前期(Preeclampsia, PE)不仅仅是一种妊娠期高血压疾病，还是一种“严重的产科综合征”[1]。它影响了全球2%至8%的孕产妇，并导致了严重的孕产妇和围产期发病率和死亡率[2]。高血压和蛋白尿是该疾病的发病基础，后续可能会导致全身器官功能障碍[3]。重度子痫前期的母体可能并发肾、心、肺、肝和神经功能障碍，以及血液系统紊乱，造成胎儿生长受限、死产以及孕产妇死亡[4]。有效的先兆子痫预测检测将有助于早期诊断和有针对性地监测分娩[5]。然而，目前存在的诊断和预测因子有限。心血管疾病是全球范围内妊娠并发症的主要原因之一[6]。而且，子痫前期和心血管病具有共同的危险因素，子痫前期患者的心血管病发病率比正常妊娠女性更高[7] [8]。有研究表明，与正常妊娠女性相比，子痫前期患者产后3年内急性心肌梗死发生风险增加13倍，心力衰竭发生风险增加8.3倍，主要心血管事件发生风险增加12.6倍，主要心血管事件相关死亡率增加2.3倍[9]。有研究表明，与期待治疗相比，先兆子痫患者的计划分娩可降低孕妇发病率[10] [11]。近年来，研究者对先兆子痫的预测生物标志物越来越感兴趣。有效的预测性测试将有助于早期诊断、有针对性地监测和及时生产。
本研究在分析GSE234729数据集的基础上，发现了FAS和B7-H4 (VTCN1)在子痫前期中的异常表达。我们收集了本机构的病例，确认了PE患者和健康孕妇之间B7-H4和FAS的表达，评估了其在PE诊断中的效力。记录了PE患者围产期心肌病和不明原因心动过速的发生情况，以评估其对心血管不良结局的预测潜力。此外，还研究了PE孕妇血清对心肌细胞中因子表达水平的影响。
2. 对象与方法
2.1. 数据库挖掘
检索GEO数据库，使用在线GEO2R工具分析GSE234729数据集中异常表达的基因。GSE234729是不同血统的非高血压对照组和重度子痫前期胎盘RNA的总RNA-seq。分析结果下载后使用生信平台进行火山图绘制。
2.2. 研究对象及分组
本研究纳入了60名PE患者和60名健康孕妇。PE患者的诊断标准如下：1) 妊娠期超过20周；2) 单胎；3) 新发高血压(收缩压 ≥ 160 mmHg和(或)舒张压 ≥ 110 mmHg)；4) 蛋白尿(尿蛋白量 > 5 g/24小时)。或者伴有器官受累的表现，比如血小板降低、肝功能异常等，以及伴有胎儿生长受限等。健康孕妇是20周以上单胎妊娠的孕妇，血压 < 140/90 mmHg (SBP/DBP)，没有蛋白尿或其他医疗或产科并发症。有高血压、肾病或其他导致血压升高的病史的人被排除在外。此外，原发性脂质代谢异常、多胎妊娠、流产、死产、胎儿畸形、妊娠期糖尿病、甲状腺疾病妊娠以及肝肾疾病妊娠的病例也被排除在外。健康孕妇与PE组孕妇在年龄、身高体重指数、孕周等方面匹配。收集PE患者围产期不良心血管事件，包括心肌病、不明原因的心动过速、心力衰竭、冠心病。本研究已通过医院伦理委员会的批准，所有患者均签署知情同意书。
2.3. 标本收集
外周血和脐带血清的制备使用无菌注射器吸出外周血及脐带静脉血，放入无菌离心管中，在37℃下孵育4小时。然后将血液样本在DL-8000R低温离心机(百鸥)中以4000 rpm离心30分钟，收集血清并在−20摄氏度下储存。
2.4. 细胞培养
人心肌细胞AC16购自中科院细胞库(北京，中国)。常规培养中，使用添加10%的胎牛血清(Gibco，美国)的DMEM/F12 (1:1)培养基(Gibco，美国)培养。考察PE对心肌细胞的影响时，采用添加20%的人脐带血清的DMEM/F12 (1:1)培养基(Gibco，美国)。
2.5. FAS及B7-H4表达水平检测
血清中FAS及B7-H4表达水平以及心肌细胞中的ANP、BNP、β-MHC和COL1A1的检测采用实时定量PCR (RT-qPCR)。首先，使用Trizol (日本TARAKA)从血清和细胞中提取总RNA。提取的RNA使用NanoDrop微量分光光度计测定OD260/OD280值。合格的RNA使用PrimeScriptRT试剂盒(日本TARAKA)进行逆转录。RT-qPCR使用SYBR Green Kit在LC480 PCR系统(美国罗氏)上进行。最终的相对表达水平通过2−ΔΔCt法计算。
2.6. 统计方法
采用SPSS 26.0和Graphpad Prism 9.0软件进行数据的统计分析。组间的差异比较采用Student t检验(P < 0.05)。受试者操作曲线(ROC)用于评估FAS或者B7H4对PE的诊断潜力和心血管不良结局的预测能力；然后经过二元logistics回归计算两个因子的预测概率值，然后使用预测概率值进行ROC，评估二者组合对PE的诊断潜力和心血管不良结局的预测能力。以P < 0.05表示差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. FAS和B7H4在PE中的表达水平及诊断意义
经过分析GSE234729数据集后，发现FAS和B7-H4 (VTCN1)在sPE胎盘组织中异常表达(图1(A))。通过RT-qPCR检测，发现FAS在sPE血清中的表达水平明显高于正常血清的表达水平(P < 0.001，图1(B))。而且，B7-H4在sPE血清中的表达水平明显高于正常血清的表达水平(P < 0.001，图1(C))。
Figure 1. Expression levels of FAS and B7H4 in sPE: (A) Volcanic map of gene expression in GSE234729 dataset; (B) RT-qPCR method was used to detect the expression levels of FAS mRNA in sPE and normal serum; (C) RT-qPCR method was used to detect the expression levels of B7-H4 mRNA in sPE and normal serum
图1. FAS和B7H4在sPE中的表达水平：(A) GSE234729数据集基因表达的火山图；(B) RT-qPCR法检测sPE和正常血清中FAS mRNA的表达水平；(C) RT-qPCR法检测sPE和正常血清中B7-H4 mRNA的表达水平
经过ROC分析后，发现FAS表达水平可以区分sPE患者和健康个体(AUC = 0.877，敏感度78.33%，专属性88.33%；图2(A))；B7-H4也可以区分sPE患者和健康个体(AUC = 0.883，敏感度88.33%，专属性71.67%；图2(B))。经过二元logistics回归分析预测概率值，二者联合可以有效区分sPE患者和健康个体(AUC = 0.954，敏感度90.00%，专属性91.67%；图2(C))。
Figure 2. Diagnostic value of FAS and B7-H4 in sPE: (A) ROC curve based on FAS expression level; (B) ROC curve based on B7-H4 expression level; (C) ROC curve based on predicted probability values from binary logistics regression calculation
图2. FAS和B7-H4在sPE中的诊断价值：(A) 基于FAS表达水平的ROC曲线；(B) 基于B7-H4表达水平的ROC曲线；(C) 基于二元logistics回归计算的预测概率值的ROC曲线
3.2. FAS和B7-H4对心血管不良结局的预测价值
通过随访发现，26名sPE病例出现围产期心肌病或者不明原因心动过速。出现不良心血管结局的血清FAS (P < 0.01，图3(A))和B7-H4 (P < 0.001，图3(B))相对表达水平明显高于无不良结局的血清。
Figure 3. Expression levels of FAS and B7H4 in the serum of PE cases with different cardiovascular outcomes: (A) RT-qPCR method was used to detect the expression level of FAS mRNA; (B) RT-qPCR method was used to detect the expression level of B7-H4 mRNA
图3. FAS和B7H4在不同心血管结局的PE病例血清中的表达水平：(A) RT-qPCR法检测FAS mRNA的表达水平；(B) RT-qPCR法检测B7-H4 mRNA的表达水平
经过ROC分析后，发现FAS表达水平可以预测sPE患者围产期心血管事件(AUC = 0.852，敏感度80.77%，专属性82.31%；图4(A))；B7-H4也可以预测sPE患者围产期心血管事件(AUC = 0.924，敏感度84.62%，专属性85.29%；图4(B))。经过二元logistics回归分析预测概率值，二者联合可以有效地预测sPE患者围产期心血管事件(AUC = 0.971，敏感度99.98%，专属性91.18%；图4(C))。
Figure 4. Predictive value of FAS and B7-H4 for cardiovascular adverse outcomes in PE cases: (A) ROC curve based on FAS expression level; (B) ROC curve based on B7-H4 expression level; (C) ROC curve based on predicted probability values from binary logistics regression calculation
图4. FAS和B7-H4对sPE病例心血管不良结局的预测价值：(A) 基于FAS表达水平的ROC曲线；(B) 基于B7-H4表达水平的ROC曲线；(C) 基于二元logistics回归计算的预测概率值的ROC曲线
3.3. PE血清对人心肌细胞的影响
我们尝试探索PE对围产期心血管不良事件的影响机制。在使用sPE血清培养心肌细胞后发现心肌细胞中的肥大基因mRNA，例如ANP mRNA (图5(A))、BNP mRNA (图5(B))和β-MHC mRNA (图5(C))表达水平显著上升。而且，心肌细胞中纤维化基因COL1A1 mRNA的表达水平显著上升(图5(D))。
Figure 5. Relative expression of ANP (A), BNP (B), β-MHC (C) and COL1A1 mRNA (D) was evaluated by RT-qPCR
图5. RT-qPCR检测ANP (A)、BNP (B)、β-MHC (C)和COL1A1 mRNA (D)的相对表达
4. 讨论
PE是妊娠期特有的病症，在全球范围内对孕产妇和围产期发病率和死亡率有重大影响[12]。有效的PE早期诊断方法能有针对性地监测孕期子痫状态和及时介入分娩。测量血压是一种已经使用了一个多世纪的PE筛查测试。然而，高血压通常只有在PE已经开始发展时才有用，在预测晚期PE方面表现平平[5]。一项研究建立了一种早期妊娠筛查算法，用于预测早产先兆子痫，但是该算法对负担最大的足月PE的适用性较差。sFlt-1和胎盘生长因子等生物标志物现在也在临床上用于疑似早产先兆子痫的病例，但敏感性欠缺[13]。需要更多的研究，以确定可能改善预测的潜在新型生物标志物。这些主要来源于参与先兆子痫发病机制的器官，包括胎盘、心血管和血清生物标志物[14]。本研究通过GEO数据库数据集的分析，发现FAS和B7-H4在PE病例的胎盘组织中异常表达。因此，我们测定了sPE病例血清中FAS和B7-H4的表达水平，发现FAS和B7-H4的表达水平在PE血清中上调。而且，上调的FAS或者B7-H4可以区分sPE病例与健康者。这些结果暗示FAS和B7-H4可以作为sPE的潜在诊断因子。
流行病学研究显示PE患者的心血管病发生风险会显著增加[7]。一项荟萃分析显示，与正常妊娠女性相比，子痫前期患者产后3年内主要心血管事件发生风险显著增加[9]。另一项荟萃分析显示，子痫前期显著增加心力衰竭和冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生风险[15]。此外，子痫前期还可促进高血压、心肌病、微血管疾病、心律失常等发生[16]。子痫前期患者心血管病发生风险和子痫前期严重程度及分型密切相关，其中重度子痫前期，且伴有其他脏器功能障碍、早发型(34周以前发病)或早产(37周前分娩)的子痫前期患者往往更易发生心血管病[17]。围产期心肌病在子痫前期人群中的发生率显著增加，同时，子痫前期又可促进产后心肌病的发生[18]。一项美国的研究表明，2367例分娩中只有4%的心肌病发生在产前，18%发生在围产期，78%的心肌病在产后被确诊[19]。Melamed等人的观察表明，17%~46%的妊娠高血压妇女患有先兆子痫，而在没有高血压的患者中，数据显示为5%~8% [20]。本研究发现，FAS和B7-H4对sPE患者的围产期不良心血管事件有预测潜力。
许多高血压患者的BNP水平升高，而且BNP可能是先兆子痫病理生理变化的后遗症的重要病因[21]。ANP是调节血压的一种因子，是PE心血管疾病的调节因子之一[22]。β-MHC、ANP和BNP都是心肌肥大的标志物[23]。本研究发现，sPE血清可以升高心肌细胞中的β-MHC、ANP和BNP表达水平。COL1A1是重要的纤维化因子[24]。本研究发现，sPE血清可以升高心肌细胞中的COL1A1表达水平。这些结果表明PE血清可能引起心肌细胞的肥大和纤维化。
5. 结论
总之，本研究发现sPE血清中FAS和B7-H4表达水平上调。上调的FAS和B7-H4可作为sPE的诊断生物标志物和围产期心肌病的预测因子。sPE血清可以引起心肌细胞肥大和纤维化。然而，需要更多的研究来充分验证FAS和B7-H4的诊断和预测意义。
基金项目
潍坊市科技发展计划项目：《B7-H4联合Fas对子痫前期的预测价值》(2021YX091)。
NOTES
*通讯作者。