1. 引言
食管癌(Esophageal carcinoma)是最常见的消化道肿瘤之一，全世界每年大约有30万人死于食管癌。我国作为食道癌的高发地区，年平均发病率约为17/10万人，男性发病率较女性高，约为女性的约2~4倍[1]。食管癌根据WHO分型可分为鳞状细胞癌型与腺细胞癌型，其中以鳞状细胞癌型为主(90%) [2]。目前，食管癌最常见的治疗方式包括手术切除、化疗和放疗。这些治疗方式对于恶性肿瘤患者预后效果差及患者生存率低[3]。因此，研究食管癌细胞分子机制且开发针对性的靶向治疗药物，对于食管癌患者生存预后意义重大。
胶霉毒素(Gliotoxin)是一种霉菌毒素分泌的次生代谢产物，分子量为326 Da，属于表聚硫代哌嗪二酮类化合物(ETP) [4]。作为烟曲霉产生的真菌毒素之一，其对哺乳动物细胞具有免疫抑制及促凋亡作用[5]。据报道胶霉毒素可以充当Wnt信号通路的抑制剂，从而抑制结直肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。也有研究表明胶霉毒素能诱导人宫颈癌和软骨肉瘤细胞凋亡[6] [7]。PI3K/AKT/mTOR信号通路参与各种重要的细胞功能调控，如细胞增殖、自噬、凋亡等。PI3K是信号通路中的关键蛋白激酶，AKT是其重要的下游激酶，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也是信号转导通路的核心，参与细胞增殖、代谢、存活、侵袭、迁移，是细胞凋亡和DNA修复的关键调节因子，其激活与肿瘤的发生、发展密切相关。mTOR是PI3K信号途径的下游元件，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其活化与肿瘤发生、进展相关，包括肿瘤复发、转移和预后不良，PI3K/AKT/mTOR通路的异常激活在致癌中发挥着重要作用[8] [9]。同时研究表明ETP可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR/信号通路抗肝细胞癌[10]。但目前关于胶霉毒素调控PI3K/AKT/mTOR通路在食管癌的研究鲜有报道，本研究主要探讨胶霉毒素是否通过PI3K/AKT/mTOR通路促进食管癌细胞凋亡从而抑制其增殖能力，旨在为胶霉毒素治疗食管癌提供理论基础。
2. 材料与方法
2.1. 主要试剂
食管癌细胞EC9706 (C1683)、EC109 (C1142)及KYSE-150 (C1015)购买于Whelab生物(上海，中国)；胶霉毒素(GTX, HY-N6727)，DMSO (HY-Y0320)购买于MCE (新泽西州，美国)；10%胎牛血清(C0226S)、MTT试剂检测盒(C0009S)、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(C1062S)、RIPA裂解缓冲液(ST507)、PVDF膜(FFP24)；RPMI-1640培养基(11875119)，青霉素–链霉素(15070063)购买于Gibco (马塞诸塞州，美国)；一抗Caspase-9 (AF6348)、Bax (AF0120)、Bcl-2 (AF6139)、PI3K (AF6241)、p-PI3K (AF3241)、AKT (AF0836)、p-AKT (AF0832)、mTOR (AF6308)、p-mTOR (AF3308)，二抗Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) HRP (S0001)和内参GAPDH (AF7021)购买于亲科生物(江苏，中国)。
2.2. 仪器
酶标仪购买于Bio-Rad (PR3100 TSC，美国)；光学显微镜(BX-50)购买于Olympus (东京，日本)；FACSCalibur流式细胞仪购买于BD Bioscience (新泽西州，美国)。
2.3. 方法
2.3.1. 细胞培养及处理
人食管癌细胞EC9706、EC109及KYSE-150在37℃，5% CO2的标准培养条件下，将3种细胞培养在含10%胎牛血清，并添加了100 ml青霉素和100 mg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中。
将3种食管癌细胞分别使用0，1，5，10，20，40 μM胶霉毒素(GTX)处理细胞。将食管癌细胞随机分为Control组(用等剂量的0.1% DMSO处理食管癌细胞)、GTX (10 μM)组(用10μM胶霉毒素处理食管癌细胞)，GTX (20 μM)组(用20 μM胶霉毒素处理食管癌细胞)以及GTX (20 μM) + Rapamycin组(20 μM胶霉毒素处理后再用2 µM mTOR抑制剂Rapamycin处理食管癌细胞)。
2.3.2. 集落形成实验
将EC9706、EC109与KYSE-150细胞以每孔1 × 103个细胞的密度接种到6孔板上后胶霉毒素处理48 h，并在适宜环境中孵育两周，在此期间每3天更换一次培养基。然后用PBS洗涤细胞，用4%多聚甲醛固定15分钟，并用0.1%结晶紫染色5分钟，在光学显微镜下手动计数可见的菌落。
2.3.3. 流式细胞术
分别收集胶霉毒素处理24小时或48小时后的食管癌细胞，并用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒进行染色。然后使用FACSCalibur 流式细胞仪分析细胞凋亡率。
2.3.4. Western Blot
使用RIPA裂解缓冲液从食管癌细胞中提取总蛋白。将30 μg总蛋白与12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)混合，通过凝胶电泳分离，然后转移到PVDF膜上。然后在室温下用5%脱脂牛奶封闭细胞膜，并与一抗Caspase-9 (1:1000)、Bax (1:1000)、Bcl-2 (1:1000)、PI3K (1:1000)、p-PI3K (1:1000)、AKT (1:1000)、p-AKT (1:1000)、mTOR (1:1000)、p-mTOR (1:1000)和GAPDH (1:3000)为内参在4℃下孵育过夜。在37℃条件下与二抗Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) HRP (1:3000)共孵育，用增强化学发光试剂在暗箱中曝光每个膜上的条带。最后使用Image J软件对条带的强度进行量化，以相应蛋白条带的灰度值/GAPDH蛋白条带的灰度值表示相对蛋白含量，实验重复三次取平均值。
2.3.5. 统计学处理
统计分析由GraphPad Prism 8软件(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)进行。组间差异采用非配对双尾t检验，并通过ANOVA分析多组之间的差异，然后进行Tukey事后检验。在所有统计分析中，P值 < 0.05被认为具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 胶霉毒素抑制食管癌细胞增殖
为研究胶霉毒素与食管癌之间的关系，我们通过集落形成实验检测了食管癌细胞增殖能力，结果显示相较于对照组，EC970细胞在10 μM与20 μM胶霉毒素处理后细胞克隆数分别减少为65.32 ± 5.21，40.33 ± 3.21 (P < 0.0001)。而EC109与KYSE-150经过上述处理后其克隆细胞数分别减少至62.35 ± 6.37，43.25 ± 5.11 (P < 0.0001)与66.71 ± 6.14，44.11 ± 3.88 (P < 0.0001)。(图1(A)~(C))。
注：A：集落形成检测胶霉毒素处理后的EC9706细胞克隆数量；B：集落形成检测胶霉毒素处理后的EC109细胞克隆数；C：集落形成检测胶霉毒素处理后的KYSE-150细胞克隆数。N = 3，数据以mean ± SD表示，ANOVA分析多组之间的差异，Tukey’s进行事后检验，*表示与对照组相比有显著性差异，P < 0.05。
Figure 1. Inhibition of esophageal cancer cell proliferation by gliotoxin
图1. 胶霉毒素抑制食管癌细胞增殖
3.2. 胶霉毒素促进食管癌细胞凋亡
接着我们探究了胶霉毒素对食管癌细胞的凋亡影响。通过流式细胞术检测10 μM与20 μM胶霉毒素处理24 h和48 h后各组食管癌细胞的凋亡情况，食管癌细胞在10 μM胶霉毒素处理24 h后其凋亡率明显增加(EC970: 19.45% ± 1.28%, EC109: 21.37% ± 2.31%, KYSE-150: 16.17% ± 1.21%; P < 0.0001)，而在20 μM胶霉毒素处理24 h后凋亡也明显增加(EC970: 27.66% ± 2.49%, EC109: 33.19% ± 3.14%, KYSE-150: 25.41% ± 2.23%; P < 0.0001) (图2(A))。而在10 μM与20 μM胶霉毒素处理48 h后其细胞凋亡率进一步升高(图2(B))。
注：A：流式细胞术检测三种食管癌细胞经胶霉毒素处理24 h后凋亡情况；B：流式细胞术检测三种食管癌细胞经胶霉毒素处理48 h后凋亡情况。N = 3，数据以mean ± SD表示，ANOVA分析多组之间的差异，Tukey’s进行事后检验，*表示与对照组相比有显著性差异，P < 0.05。
Figure 2. Gliotoxin promotes the apoptosis of esophageal cancer cells
图2. 胶霉毒素促进食管癌细胞凋亡
3.3. 胶霉毒素促进食管癌细胞中凋亡蛋白的表达
为了进一步研究胶霉毒素对食管癌细胞相关蛋白的影响，我们选择上述实验中对胶霉毒素最为敏感的EC109细胞进行后续研究。Western Blot实验结果显示10 μM胶霉毒素处理后的食管癌细胞中Caspase-9与Bax蛋白表达相较于对照组，增加了2.78倍 ± 0.31倍，2.32倍 ± 0.23倍(P < 0.0001)，而Bcl-2的表达显著减少0.51倍 ± 0.05倍(P < 0.0001)，而在20 μM胶霉毒素处理后的食管癌细胞中凋亡蛋白表达变化的更为明显。(图3(A)~(C))。
注：A：Western Blot实验检测胶霉毒素处理后的食管癌细胞中Caspase-9蛋白表达；B：Western Blot实验检测胶霉毒素处理后的食管癌细胞中Bax蛋白表达；C：Western Blot实验检测胶霉毒素处理后的食管癌细胞中Bcl-2蛋白表达。N = 3，数据以mean ± SD表示，ANOVA分析多组之间的差异，Tukey’s进行事后检验，*表示与对照组相比有显著性差异，P < 0.05。
Figure 3. Gliotoxin promotes the expression of apoptosis-related proteins in esophageal cancer cells
图3. 胶霉毒素促进食管癌细胞中凋亡蛋白的表达
3.4. 胶霉毒素通过PI3K/AKT/mTOR通路阻碍食管癌的发展
为验证胶霉毒素与PI3K/AKT/mTOR通路关系，通过Western Blot实验分别检测了不同浓度胶霉毒素对PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达的影响。Western Blot实验结果显示10 μM胶霉毒素在处理食管癌细胞后对PI3K，AKT，mTOR蛋白及其相对应的磷酸化PI3K，AKT，mTOR蛋白都明显减少。而在20 μM胶霉毒素处理后的食管癌细胞中其PI3K/AKT/mTOR信号通路相应的蛋白表达减少得更为显著(图4(A)~(C))。
4. 讨论
胶霉毒素作为一种真菌产生的活性次级代谢产物，具有广泛的生物活性，包括抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、免疫抑制、抗病毒及抗菌等[11]。大量研究表明，胶霉毒素通过诱导多种癌细胞凋亡发挥抗癌作用[12] [13]。Hung等人的研究表明胶霉毒素通过破坏线粒体膜电位和激活p53，利用线粒体依赖性途径诱导阿霉素耐药非小细胞肺癌细胞(A549/ADR)的凋亡[14]。也有研究表明胶质毒素能靶向人实体瘤细胞系中的核NOTCH2信号转导从而诱导癌细胞凋亡[15]。PI3K/Akt/mTOR作为细胞中最重要的信号通路
注：A：Western Blot实验检测胶霉毒素处理后食管癌细胞中PI3K及其磷酸化PI3K表达；B：Western Blot实验检测度胶霉毒素处理后食管癌细胞中AKT及其磷酸化AKT表达；C：Western Blot实验检测胶霉毒素处理后食管癌细胞中mTOR及其磷酸化mTOR表达。N = 3，数据以mean ± SD表示，ANOVA分析多组之间的差异，Tukey’s进行事后检验，*表示与对照组相比有显著性差异，P < 0.05。
Figure 4. Gliotoxin inhibits the development of esophageal cancer through the PI3K/AKT/mTOR pathway
图4. 胶霉毒素通过PI3K/AKT/mTOR通路阻碍食管癌的发展
之一，在促进肿瘤起始、进展和治疗反应中起着至关重要的作用[16]。Ediriweera等人探讨了PI3K/AKT/mTOR信号通路在卵巢癌肿瘤发生、增殖和进展中的重要性[17]。通过抑制乳腺癌细胞的生长和增殖，PI3K/AKT/mTOR信号通路在恶性细胞的死亡中发挥重要作用[18]。另有研究表明，PI3K-AKT-mTOR信号通路与前列腺肿瘤发生、侵袭性进展和疾病复发密切相关[19]。值得注意的是，胶霉毒素可以通过AMPK和PI3K/AKT/mTOR通路诱导结直肠癌细胞凋亡和自噬[20]。但目前胶霉毒素调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制食管癌细胞生长及促进其凋亡的研究未见报道。
为弄清胶霉毒素对食管癌细胞生物学功能的影响，我们首先使用不同浓度胶霉毒素处理3种食管癌细胞，利用集落形成实验证明10 μM与20 μM浓度胶霉毒素均能减少食管癌细胞的克隆数量。随后流式细胞术检测凋亡结果显示10 μM与20 μM胶霉毒素处理食管癌细胞24 h和48 h后的凋亡率都显著升高，而48 h处凋亡率增加得更为明显。Western Blot实验结果同样也表明食管癌细胞在经胶霉毒素处理后凋亡相关蛋白Caspase-9与Bax蛋白表达显著增加。
综上所述，胶霉毒素可以通过PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进凋亡相关蛋白的表达，抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，最终缓解食管癌的发生发展。本研究的结果为胶霉毒素治疗食管癌的分子调控机制提供了理论基础，为今后开发靶向治疗药物及临床应用提供了实验依据。
作者贡献声明
李耀星、赫晓媛、王子婧：实施研究、采集数据；李耀星、姚田岭：起草文章、对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、行政、技术或材料支持、支持性贡献。
基金项目
黑龙江省教育厅–基本科研业务费研究项目(2021-KYYWF-0513)。
NOTES
*通讯作者。