摘要: 目的：通过网络药理学方法探讨萹蓄–瞿麦药对治疗尿路感染的作用机制。方法：运用TCMSP数据库和Unit Prot数据库筛选萹蓄–瞿麦药对的活性成分和对应靶点，从GeneCards、Drug Bank和TTD数据库获取尿路感染的疾病靶点。利用Venny (韦恩)平台获取药物活性成分与疾病交集靶点。通过Cytoscape软件，建立“中药–活性成分–靶点–疾病”的网络模型。利用String数据库构建蛋白质相互作用网络，筛选核心靶点，建立核心靶点网络图。在David数据库中进行交集靶点的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。结果：获得10个萹蓄–瞿麦药对主要活性成分及169个对应靶点；尿路感染对应靶点1170个，交集靶点104个，核心靶点26个。主要活性成分有(+)–儿茶素、槲皮素、山奈酚等。核心靶点有AKT1、TNF、IL6等。GO功能富集分析结果主要涉及细胞增殖正调控、基因表达正调控、凋亡过程负调控等过程；KEGG通路富集分析主要集中于癌症通路、糖基化终末产物–
β–淀粉样蛋白信号通路与糖尿病并发症、脂质与动脉粥样硬化等多条信号通路。结论：本研究初步揭示了“萹蓄–瞿麦”药对以结合多成分、多靶点，多通路调控的特征发挥治疗UTI作用。
Abstract: Objective: Exploring the mechanism of action of Bianxu-Qumai medication in the treatment of urinary tract infections through a network pharmacology approach. Method: The TCMSP and Unit Prot databases were used to screen the active ingredients and corresponding targets of Bianxu-Qumai drug pair, and the Gene Cards, Drug Bank and TTD databases were used to obtain the disease targets of urinary tract infections. The Venny platform was utilized to obtain drug active ingredients and disease intersecting targets. Using Cytoscape software, the network model of “TCM-active ingredient-target-disease” was established. The String database was used to construct the protein interaction network, screen the core targets, and establish the core target network diagram. Conduct GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of the intersected targets in David database. Result: Ten main active ingredients of Bianxu-Qumai pairs and 169 corresponding targets were obtained; 1170 corresponding targets acting on urinary tract infections, 104 intersecting targets and 26 core targets. The main active ingredients were (+)-catechin, quercetin, and kaempferol. The core targets were AKT1, TNF, IL6, etc. The results of GO functional enrichment analysis mainly involved the positive regulation of cell value-added, positive regulation of gene expression, negative regulation of apoptotic process, etc. The KEGG pathway enrichment analysis mainly focused on multiple signaling pathways, such as cancer pathway, glycosylation end-product-beta-amyloid signaling pathway with diabetic complications, lipids and atherosclerosis. Conclusion: This study initially reveals that the drug pair “Bianxu-Qumai” plays a therapeutic role in the treatment of UTI by combining the characteristics of multi-components, multi-targets, and multi-pathway modulation.
1. 引言
尿路感染(Urinary tract infection, UTI)是由病原体在尿路中生长、增殖而导致的感染性疾病，是临床上常表现为尿频、尿急、尿痛和腰腹痛等症状的常见泌尿系统疾病，好发于育龄女性，男女比例约为1:8 [1]，但目前对于UTI的临床诊断、分类及治疗尚无统一标准[2]。德国的尿路感染占所有医院感染的21.6%，其中超过60%的病例与导尿管相关[3]；而我国泌尿系统感染在医院感染中的发病率为20.8%~31.7%，严重影响患者的日常工作和生活[4]。多数UTI病人的预后较好，但如果感染时间较长，且反复发作，则会发展成慢性肾盂肾炎等多种疾病，严重时导致肾功能不全或者死亡[5]，这给临床医生和患者都造成极大的困扰。目前西医多采用抗生素治疗UTI，有一定的效果，但随着抗生素的滥用，容易诱发病原微生物产生耐药性[6]。祖国医学以整体观念和辨证论治为特点，中医药通过调节相关脏腑功能及体质治疗尿路感染，不仅能缓解症状，减轻病人痛苦，还能减少西药副作用，规避抗药性，降低复发率等，展现出明显优势[7]，被广泛应用到治疗中。
基于中医学理论体系，中医将尿路感染称为“淋证”。《金匮要略·消渴小便不利淋病脉证并治》对此病的症状有论述：“小便赤，小腹紧而痛于脐中者，即为淋”[8]。《诸病源候论·诸淋病候》中将其分为七种证型，其中以热、石淋最为多见，并提出“诸淋，都是肾虚、膀胱湿热所致”[6]；揭示了淋证的病因病机主要是下焦湿热，热邪、热毒、湿热是重要致病因素，病于肾与膀胱，涉及心肝脾等脏腑[9]。八正散作为治疗热淋的典型代表方剂，其中萹蓄和瞿麦作为主药，核心药对，皆性寒，味苦，萹蓄入膀胱经，瞿麦入小肠经。中医五行理论研究中，水克火，水火既济，说明了心肾两者的关系。命门学说是中医基础理论的重要组成内容，陈士铎提出“命门者，水火之府，阴阳之所”之说[10]。萹蓄–瞿麦功专清热利尿通淋，临床常相须为用，体现了中医治病优势。现代药理学研究显示，萹蓄中含有黄铜及其苷类等物质，具有影响泌尿系统、抑菌杀虫、抗炎、抗氧化等作用[11]；瞿麦中主要含皂苷类及环肽类物质，具有抗菌、保护肾脏、神经，抑制免疫的作用[12]。近年来，中医药研究逐步趋向与现代医学和网络药理学等相融合，孵化了一种基于基因组学和蛋白组学的新兴科研方法，通过关系网络预测中药潜在药理作用及分子机制，评估药物疗效及副作用等[13]。基于此，本研究以萹蓄–瞿麦为研究对象，采用网络药理学方法，对其活性成分和作用靶点进行预测，探讨治疗尿路感染的潜在作用机制。
2. 资料与方法
2.1. 萹蓄–瞿麦药对活性成分及对应靶点筛选
在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/)以萹蓄、瞿麦为检索词，检索化学成分，以口服生物利用度(OB) ≥ 20%，类药性(DL) ≥ 0.1，获取主要活性成分；用MOL ID号在TCMSP数据库对相应靶点进行预测，剔除未找到相关靶蛋白的靶点。在Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)选择Reviewed、Human，将得到靶蛋白转化为官方基因靶点名称，将结果进行标准化、去重，得到萹蓄–瞿麦药对基因靶点。
2.2. 疾病相关靶点的获取
在人类基因数据库(GeneCards, https://www.genecards.org/)、生物信息学和化学信息学数据库(Drug Bank, https://go.drugbank.com/)和靶点数据库(Therapeutic Target Database, TTD, https://idrblab.net/ttd/)以“Urinary tract infection”为检索词，检索UTI对应靶点，以Score值大于中位数为条件筛选，然后通过UniProt数据库将疾病的对应靶点转换为基因靶点名称，整理、去重，最终得到与尿路感染相关的靶点。
2.3 萹蓄–瞿麦药对与疾病靶点交集
将药对活性成分和疾病相关靶点基因名称上传至Venny2.1.0平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，取药物与疾病交集靶点，画出韦恩图。
2.4. 构建“药物有效活性成分–靶点–疾病”网络
将萹蓄–瞿麦有效活性成分、作用靶点以及交集靶点导入Cytoscape软件构建“药对–有效活性成分–靶点–UTI”网络图；进行网络分析。
2.5. 构建蛋白质相互作用(PPI)网络
将2.3得到的药对与疾病交集靶点导入STRING数据库(https://cn.string-db.org)，限定物种为“人”(Homo sapiens)，筛选置信度大于0.4的靶点信息，得到PPI关系网络图。将上述STRING分析得出的数据导入Cytoscape软件，进行拓扑分析，筛选DC (Degree)、BC (Betweenness)、CC (Closeness)值大于阈值的靶点构建核心靶点网络图。
2.6. (GO)功能富集分析与(KEGG)通路富集分析
应用DAVID (https://david.ncifcrf.gov)数据库，将萹蓄–瞿麦药对与UTI交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，将物种限定为“Homo sapiens”，以P < 0.05为筛选标准，对GO功能富集结果分别进行生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)分析；将三个条目的前20个结果利用微生信网站(https://www.bioinformatics.com.cn)中富集气泡图功能绘制GO富集气泡图；带颜色富集条形图功能绘制KEGG富集条形图，进行可视化分析。
3. 结果
3.1 萹蓄–瞿麦药对活性成分及对应靶点筛选结果
在TCMSP数据库中满足OB ≥ 20%、DL ≥ 0.1筛选条件的活性成分有73个，其中萹蓄30个、瞿麦43个；剔除未预测到对应靶点的5个有效活性成分(MOL000554, MOL007386, MOL003510, MOL003511, MOL003515)，筛选获得萹蓄有效活性成分9个、瞿麦有效活性成分6个，合并去重获得10个有效活性成分，结果详见表1。通过TCMSP数据库预测有效活性成分的靶点，检索到萹蓄对应靶点295个，瞿麦对应靶点58个，共353个，合并去重后剩余229个。利用UniProt数据库将获得的229个靶蛋白，转换成官方基因名称，得到192个主要靶点基因(37个靶蛋白未能找到基因名称)，去重得到最终药对靶点基因169个。
Table 1. Table of active ingredients of Bianxu-Qumai medicinal pairs
表1. 萹蓄–瞿麦药对有效活性成分表
药物 |
Mol ID |
活性成分 |
OB (%) |
DL |
萹蓄 |
MOL000359 |
Sitosterol |
36.91 |
0.75 |
萹蓄 |
MOL003840 |
1'-Methoxy-2'-hydroxydihydromollugin |
26.76 |
0.35 |
萹蓄 |
MOL000422 |
kaempferol |
41.88 |
0.24 |
萹蓄 |
MOL000492 |
(+)-catechin |
54.83 |
0.24 |
萹蓄 |
MOL000006 |
Luteolin |
36.16 |
0.25 |
萹蓄 |
MOL000741 |
(2S, 3S)-3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl) chroman-4-one |
24.15 |
0.24 |
萹蓄 |
MOL000098 |
quercetin |
46.43 |
0.28 |
瞿麦 |
MOL001442 |
phytol |
33.82 |
0.13 |
瞿麦 |
MOL000472 |
emodin |
24.40 |
0.24 |
瞿麦 |
MOL000476 |
Physcion |
22.29 |
0.27 |
3.2. 尿路感染相关靶点
在GeneCards、Drug Bank和TTD数据库，以“Urinary tract infection”为检索词，一共检索到疾病对应靶点10,611个(GeneCards 10,449个，Drug Bank 145个，TTD 17个)，其中GeneCards提取的数据较多，将Relevance score进行降序，并计算中位数，三次中位数分别为3.86、7.58、12.31，三次筛选大于中位数的靶点剩余1305个，最后将3个数据库疾病靶点合并去重，剔除无Gene Name的疾病靶点，得到1170个尿路感染对应疾病靶点。
3.3. 萹蓄–瞿麦药对与尿路感染交集靶点
将169个药对靶点基因与1170个疾病靶点基因比对，再进行合并去重，得到萹蓄–瞿麦与尿路感染交集靶点共104个，将所得数据导入Venny平台得到萹蓄–瞿麦药对与尿路感染的交集靶点Venn图，见图1。
Figure 1. Bianxu-Qumai medicamentus-urinary tract infection intersection target Venn diagrams
图1. 萹蓄–瞿麦药对–尿路感染交集靶点Venn图
3.4. 药物–有效活性成分–靶点–疾病网络
将萹蓄–瞿麦药对有效活性成分、药物靶点与疾病的交集靶点导入Cytoscape软件，构建“药对–有效活性成分–靶点–UTI”网络图，见图2。该网络图中有114个节点、129条边。图中六边形分别代表萹蓄、瞿麦，绿色圆形代表萹蓄活性成分，红色圆形代表瞿麦活性成分，橙色菱形代表104个共同靶点基因，蓝色方形代表疾病(UTI)。从该图中可以发现，多个靶点可以与同一个活性成分相关联，一个靶点也可关联单或多个活性成分，这说明萹蓄–瞿麦药对可能是通过多成分、多靶点联合治疗UTI。利用Cytoscape软件计算工具计算连接度(Degree)值，即节点连接的边的数量，Degree值越大表示该节点与其他节点越密集，表明该节点在此网络中越重要。由图可知，萹蓄–瞿麦药对作用于UTI的主要成分为NR3C2、PTGS1、PTGS2，排名前3位的化合物详见表2。
Figure 2. Bianxu-Qumai medicinal pairs-active ingredients-targets-UTI network diagrams
图2. 萹蓄–瞿麦药对–有效活性成分–靶点–UTI网络图
Table 2. Table of information on the top 3 active ingredients in the connectivity of Bianxu-Qumai drug pairs
表2. 萹蓄–瞿麦药对中连接度排名前3活性成分信息表
MOL编号 |
英文名称 |
中文名称 |
连接度 |
紧密度 |
MOL000359 |
Mineralocorticoid receptor |
盐皮质激素受体 |
30 |
0.24248927 |
MOL003840 |
Prostaglandin G/H synthase 1 |
前列腺素G/H合酶1 |
21 |
0.288265306 |
MOL003840 |
Prostaglandin G/H synthase 2 |
前列腺素G/H合酶2 |
10 |
0.265258216 |
3.5. PPI蛋白相互作用网络构建
Figure 3. Bianxu-Qumai medicinalis pair-UTI intersection target PPI network map
图3. 萹蓄–瞿麦药对–UTI交集靶点PPI网络图
在STRING数据库中上传104个交集靶点，限定物种“Homo sapiens”，筛选交互置信度 > 0.4的靶点，剔除游离靶点，得到萹蓄–瞿麦药对与UTI的交集靶点PPI网络图(见图3)。该图有103个节点(去掉一个游离靶点)，2277条边。保存交集靶点关系网络结果tsv表格，并导入Cytoscape软件中进行可视化分析，得到103个节点，2277条边；利用其中CentisCape2.2插件进行分析，得到Degree (DC)阈值44.21359223，Betweenness (BC)阈值60.52427184，Closeness (CC)阈值0.00632449，筛选获得大于阈值的核心靶点26个，将新的26个核心靶点再次构建“核心靶点PPI网络图”(见图4)图中包含26个节点，325条边。26个核心靶点中RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、细胞肿瘤抗原p53、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子、基质金属蛋白酶-9、白细胞介素-1β位居前列，其Degree值分别为89、88、88、88、83、83，提示这些靶点可能为萹蓄–瞿麦治疗尿路感染的关键靶点。
Figure 4. Core target PPI network diagram
图4. 核心靶点PPI网络图
3.6. GO功能富集分析与KEGG通路富集分析
Figure 5. BP function enrichment analysis bubble diagram
图5. BP功能富集分析气泡图
Figure 6. CC function enrichment analysis bubble diagram
图6. CC功能富集分析气泡图
Figure 7. MF function enrichment analysis bubble diagram
图7. MF功能富集分析气泡图
将药对与疾病的104个交集靶点导入DAVID数据库进行GO功能和KEGG通路富集分析，得到GO富集797个结果，KEGG通路分析156个结果，以P < 0.05为筛选标准，得到506条BP条目，42条CC条目，90条MF条目，149条KEGG条目。分别选取前20条BP、CC、MF条目，绘制GO富集气泡图，见~7。图中气泡面积与目标基因集中于term的基因成正比，气泡颜色与富集程度成正比。选取KEGG分析前20条通路名称、基因数量，绘制KEGG富集条形图，见图8；图中红色程度与富集程度成正比。
Figure 8. Bar graph of KEGG pathway enrichment analysis
图8. KEGG通路富集分析条形图
4. 讨论
尿路感染是仅次于呼吸系统感染的第二大感染性疾病，全世界每年有超过一亿五千万人因此而遭受痛苦，造成了巨大的医疗经济压力[14]。目前，抗感染是西医主要治疗方法，但由于抗生素耐药问题日益严重及不良反应增多，长期应用弊端明显，给尿路感染的治疗增加了难度[15]。2014~2019年全国细菌耐药监测网中尿标本分离细菌的耐药性监测结果报告[16]显示大肠埃希菌在女性尿标本中占57%以上，在男性中占34%左右，而大肠埃希菌对头孢曲松的耐药率已超过47%，且细菌数量呈逐年上升趋势。中医中药治疗源远流长，而尿路感染属“淋证”范畴，“淋”一词在《素问·六元正纪大论》中已有记载，寒、湿、热、气郁、瘀、虚等是病理因素；其中正虚是尿路感染的内因，湿热贯穿疾病始终[17]，而尿路感染的病位多在肾与膀胱，治以清热利尿通淋。
中药是由多成分、多靶点、多生物学过程组成的复杂体系，明确药用活性成分并探索其最优药效是目前的研究热点。网络药理学作为一种相对比较新的研究方式，具有整体性和系统性的特点，可从生物网络以及分子层面理解中药的作用机制，这对于临床应用非常重要，而网络药理学的兴起，为人们提供了一个新角度和技术手段来揭示疾病的发病机理，并阐明药物作用的网络结构[18]。
本研究对萹蓄–瞿麦药对活性成分及其作用靶点进行分析，结果显示，萹蓄–瞿麦药对治疗尿路感染的有效活性成分为(+)–儿茶素、槲皮素、山奈酚等；关键靶点为AKT1、TNF、IL6、TP53；主要涉及癌症通路、高级糖基化终末产物—受体(AGE-RAGE)通路、脂质与动脉粥样硬化通路、流体切应力与动脉粥样硬化通路、磷脂酰肌醇3激酶–蛋白激酶B信号通路等生物学过程中多条信号通路。有研究[19]发现EGCG等8种儿茶素具有较强的体外抗炎、抗癌活性，但其功能活性因分子结构不同而异，而这几种活性得益于其与多靶点的相互作用。D环没食子酰基和B环儿茶酚型结构能够增强儿茶素与IL6、TNF及AKT1等多个炎症、癌症靶点的调控与相互作用，从而促进儿茶素体外抗炎、抗癌活性的发挥[19]。槲皮素是一种具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用的天然黄酮类多酚类化合物，可通过抑制核转录因子NF-κB激活，减少释放促炎细胞因子等抗炎途径进行细胞损伤的保护[20]。山柰酚是一种黄酮类物质，具有很好的抗癌作用，其主要机制如调控细胞周期、氧化应激、细胞凋亡、增殖、转移和血管生成等[21]，由此得出(+)-catechin、quercetin、kaempferol等炎症反应相关的基因，是通过抗炎作用来达到治疗UTI的目的。
核心靶点中AKT1是AKT激酶之一，AKT1主要参与细胞的生存通路和生长控制[22]；而AKT通过PI3K激活，即PI3K/AKT信号通路，在炎症疾病中发挥着重要作用[23]。UTI患者感染早期炎症反应程度会出现明显增高，并随着病情进展而发生变化，TNF-α能作用于中性粒细胞，起阳性趋化作用，从而启动机体的炎症反应，还能加强中性粒细胞和单核巨噬细胞的吞噬功能和增加其过氧化物酶的生成[24]，导致炎症反应。IL-6是一种由α链和β链组成的多肽，IL-6升高表明患者感染严重[25]，IL6过度表达可诱导局部炎性病变，由此得出，UTI感染的严重度与TNF和IL6表达水平成正相关。作为基因组的守护者，最常见的癌症突变基因，TP53对肿瘤转化和肿瘤进展具有重要的阻挡作用[26]，在细胞周期、凋亡及基因组稳定性等方面起着关键调节作用[27]；PD-L1在癌症通路中的表达以及PD-1检查点、T细胞受体等信号通路都密切参与了免疫和炎症级联反应，并可调节炎症因子的表达[28]。AGE与RAGE相结合，可激活核因子-κB和二核苷酸磷酸氧化酶，活化多个炎症基因的转录[29]，同时，核因子-κB能促进促炎细胞因子的表达，并促进多种与动脉粥样硬化有关的基因表达[30]；而AGE-RAGE信号通路的激活可导致炎症反应、氧化应激、血管平滑肌的细胞代谢[31]；其中流体剪切力与动脉粥样硬化通路可使血管平滑肌细胞变短[32]。上述研究表明，萹蓄–瞿麦中的有效活性成分可能通过以上途径调控炎症反应、抗氧化应激、氧化应激、调节细胞周期等方面参与治疗尿路感染。
5. 总结
因此，本研究采用网络药理学的方法，分析萹蓄–瞿麦药对治疗尿路感染的活性成分、靶点及通路，推测萹蓄–瞿麦可能通过(+)–儿茶素、槲皮素、山奈酚等核心成分，作用于AKT1、TNF、IL6、TP53等核心靶点，通过癌症通路、糖基化终末产物-β-淀粉样蛋白信号通路与糖尿病并发症、脂质与动脉粥样硬化等核心通路，起到治疗尿路感染的效果。本研究从网络药理学的角度探讨了萹蓄–瞿麦药对通过多成分、多靶点、多通路协同抗炎抗菌的潜在机制治疗尿路感染，为进一步研究药理学作用及其配伍的临床应用提供参考依据，但有一定的局限性，未来有待基础和临床试验进一步研究及验证。
NOTES
*通讯作者。