血清中NSE、S100β、NT-proCNP与大鼠脓毒症相关性脑病的相关性分析

Correlation Analysis of Serum NSE, S100β, NT-proCNP and Rat Sepsis-Associated Encephalopathy

摘要: 目的：探讨神经元特异性烯醇化酶(NSE)、C型利钠肽及其氨基末端前肽(NT-proCNP)和中枢神经特异蛋白(S100β)与脓毒症相关性脑病(SAE)的相关性。方法：SD大鼠共计36只，随机数字表法分为两组(n = 18)，即假手术组(Sham组)和脓毒症相关性脑病组(SAE组)，每组分别在12 h、24 h和48 h进行神经行为学评分并取材。取大鼠心室血离心取上清液，Elisa法检测血清中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、NSE、NT-proCNP、S100β的水平。HE染色观察两组海马组织形态学变化。结果：与Sham组同时间相比，SAE组在24 h和48 h时行为学评分明显降低(SAE组平均数 ± 标准差vs Sham组平均数 ± 标准差，P < 0.05；SAE组平均数 ± 标准差vs Sham组平均数 ± 标准差，P < 0.05)。Elisa法结果显示，相较于Sham组，SAE组TNF-α表达在12 h、24 h和48 h均明显提高(SAE组平均数 ± 标准差vs Sham组平均数 ± 标准差，P < 0.01)，SAE组NSE的表达在24 h和48 h时明显提高(SAE组平均数 ± 标准差vs Sham组平均数 ± 标准差，P < 0.05)；SAE组NT-proCNP的表达在24 h和48 h时明显提高(SAE组平均数 ± 标准差vs Sham组平均数 ± 标准差，P < 0.05)；SAE组S100β的表达在24 h和48 h时明显提高(SAE组平均数 ± 标准差vs Sham组平均数 ± 标准差，P < 0.05)；SAE组内相较于12 h，S100β的表达在24 h和48 h时明显提高(SAE组24 h平均数 ± 标准差vs SAE组48 h平均数 ± 标准差，P < 0.01)。HE结果显示，与Sham组相比，SAE组脑区海马区域组织明显水肿，空泡状增多。结论：大鼠血清中NSE、NT-proCNP和S100β水平的升高与SAE发生具有相关性，动态监测脓毒症患者血清中水平的变化有助于早期发现和诊断SAE。

Abstract: Objective: To explore the correlation between neuron specific enolase (NSE), soluble protein-100β (S100β), amino-terminal pro-C-type natriuretic peptides (NT-proCNP) and sepsis-associated encephalopathy (SAE). Methods: A total of 36 Sprague-Dawley rats were equally distributed into two groups (n = 18), namely the Sham group (undergoing Sham surgery) and the SAE group (with sepsis-associated encephalopathy). At 12 h, 24 h, and 48 h, each group underwent neurobehavioral scoring and tissue collection. The serum was extracted from rat ventricular blood through centrifugation for subsequent measurement of tumor necrosis factor-α (TNF-α), NSE, NT-proCNP, and S100β levels using Elisa. HE staining was employed to examine the structural alterations within the hippocampal tissues of the two groups. Results: Compared with the Sham group, the SAE group showed a significant decrease in neurobehavioral score at 24 h and 48 h (SAE group mean ± SD vs Sham group mean ± SD, P < 0.05; SAE group mean ± SD vs Sham group mean ± SD, P < 0.05). Elisa results showed that compared to the Sham group, TNF-α expression in the SAE group was significantly increased at 12 h, 24 h, and 48 h (SAE group mean ± SD vs Sham group mean ± SD, P < 0.01), NSE expression in the SAE group was significantly increased at 24 h and 48 h (SAE group mean ± SD vs Sham group mean ± SD, P < 0.05); NT-proCNP expression in the SAE group was significantly increased at 24 h and 48 h (SAE group mean ± SD vs Sham group mean ± SD, P < 0.05); S100β expression in the SAE group was significantly increased at 24 h and 48 h (SAE group mean ± SD vs Sham group mean ± SD, P < 0.05); within the SAE group, compared to 12 h, S100β expression was significantly increased at 24 h and 48 h (SAE group 24 h mean ± SD vs SAE group 48 h mean ± SD, P < 0.01). HE staining results showed that compared with the Sham group, the brain region of the hippocampus in the SAE group showed obvious edema and increased vacuolation. Conclusion: The increased levels of NSE, NT-proCNP and S100β in serum of rats are correlated with the occurrence of SAE. Dynamic monitoring of serum levels in sepsis patients is helpful for early detection and diagnosis of SAE.

1. 引言

脓毒症是宿主对感染的反应严重失调后产生的可能导致死亡的器官功能障碍[1]。全球范围内，脓毒症及其引发的脓毒性休克构成了一个严重的公共健康挑战。根据世界卫生组织的数据，每10万例医院内脓毒症病例中，大约有189例最终死亡[2]。脓毒症相关性脑病(Sepsis-associated encephalopathy, SAE)定义为由脓毒症触发的广泛性脑功能紊乱，该状况并非由中枢神经系统的直接感染引起[3]。在临床监测中，这种脑功能的损害呈现多样的症状，包括但不限于意识模糊、谵妄，以及进而发展到重度昏迷等各个阶段[4]。当患者发生脓毒症，并随之出现脑部功能受损时，这将极大地提高他们面临的健康风险，包括更高的死亡风险以及潜在的长期认知损害[5]，根据危重程度不同死亡率为26%~63%，70%的脓毒症幸存者在出院时存在神经认知障碍，45%的患者在1年时存在神经认知障碍[6]。目前，脓毒症相关性脑病的病理生理机制尚未完全明确。一些研究表明它可能与以下机制有关：神经系统炎症及血脑屏障的破坏、脑微循环功能障碍和脑组织灌注障碍、神经递质释放的紊乱和信号的异常传递、氧化应激造成损伤、补体的作用、线粒体功能紊乱以及细胞因子作用[7]。在临床上SAE没有特征表现，目前临床诊断SAE主要依靠病情评估和排除其他诊断。脓毒症相关性脑病的诊断目前确实存在一些挑战，因为尚未发现任何确切的工具或方法来协助诊断。然而，有一些辅助检查可以提供一定的帮助，例如脑电图、磁共振成像、血清生物标志物检测和经颅多普勒超声等[3]。这些检查方法可以提供一些线索，但不能单独用于确诊脓毒症相关性脑病。由于缺乏特异性的诊断手段，目前临床上还没有确切且公认的脓毒症相关性脑病诊断标准。在发生脓毒症时，全身炎性反应会导致体内炎症因子水平升高，但这些因子的升高并不特异于脓毒症相关性脑病，因此不能作为确诊的唯一依据。综上所述，对于疑似脓毒症相关性脑病的患者，医生需要综合评估其临床表现以及各种辅助检查结果，以尽可能准确地进行诊断。但相较于昂贵且耗时的辅助检查及神经精神检查，血清生物标志物具有价格低廉、监测简便、客观性强等优点，是理想的诊断SAE、评估病情程度及评估预后的方法。

在脓毒症发作期间，人体将经历涉及多个器官和系统的炎症反应，这会引起体内炎症标志物的水平上升。然而，就SAE的诊断而言，这些标志物并不具有足够的特异性。最近研究已经识别出几个与继发性脑损伤关联的生物标志物，包括增加的中枢神经系统特定蛋白(Soluble protein-100β, S100β)和神经元特异性的烯醇化酶(Neuron-specific enolase, NSE)、C型利钠肽及其氨基末端前肽(C-type natriuretic peptide and its amino terminal propeptide, NT-proCNP)、同型半胱氨酸、泛素C末端水解酶L1、Tau蛋白和神经丝蛋白等[8]-[10]。但作为血清生物标志物来诊断SAE仍存在争论。

NSE是一种酸性蛋白酶，主要存在于神经元和神经内分泌细胞的细胞质中[11]，参与慢速轴浆运输。NSE被证明同时具有破坏性和保护性作用，有研究表明它积极参与神经炎性反应、神经变性和神经保护[12]。S100β主要在中枢神经系统内表达，并借助与钙离子的结合作用，充当刺激星形胶质细胞活化及促进神经再生过程中细胞增殖和迁移的因子[6]。因此，它被认为是一个衡量中枢神经系统损害程度的量化指标，并且是反映脑部损伤的灵敏病理标志物[13]。NT-proCNP是源自内皮细胞的旁分泌分子，属于利钠肽的一种，在肾脏及中枢神经系统中有表达。当中枢神经系统出现炎性疾病时，患者的NT-proCNP水平往往上升，且该分子在外周血液中的浓度增加时，脑脊液中的相应浓度也呈现上升趋势[14]。S100β和NSE的浓度上升与脓毒症相关性脑病(SAE)的发生有显著关联，它们可以在某种程度上提示SAE的发生，被视为评估SAE风险的重要生物指标[15]-[17]。Ehler等人[17]发现，相比NSE和S100β，检测SAE患者血浆中NT-proCNP的敏感性明显更高，在脓毒症早期，血清NT-proCNP浓度会迅速升至最高点，因此，在外周血中测定NT-proCNP水平对于早期识别脓毒症相关的神经功能障碍提供了重要的临床价值。本研究主要探讨脓毒症相关性脑病大鼠血清中NSE、S100β及NT-proCNP与脓毒症相关性脑病的相关性。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

2.1.1. 实验动物

清洁级成年雄性SD (Sprague Dawley)大鼠共计36只，体重250~300 g，购自济南朋悦有限公司，许可证号SCXY(鲁)2022 0006。大鼠始终饲养在12小时明暗交替、温度及湿度适宜的动物房内，可自由进食、进水。本研究经毓璜顶医院伦理委员会批准。

2.1.2. 试剂与仪器

1) 主要药品及试剂：10%水合氯醛购自青岛大学附属医院，多聚甲醛购自北京兰杰柯科技有限公司，大鼠NSE酶联免疫试剂盒、大鼠S100β酶联免疫试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，大鼠NT-proCNP酶联免疫试剂盒购自南京博研生物科技有限公司，大鼠TNF-α酶联免疫试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。2) 主要设备与仪器：恒温摇床购自Eppendorf，高速冷冻离心机、酶标仪购自Thermo，全自动倒置荧光显微镜购自蔡司，超低温保存箱购自海尔，石蜡切片机购自徕卡，摊烤片一体机购自华速

2.2. 试验方法

2.2.1. 动物分组及模型构建

大鼠随机数字表法分为两组，分别为假手术组(Sham组)和脓毒症相关性脑病组(SAE组)，每组各18只，两组内根据取材时间又随机分为12 h、24 h和48 h三个亚组，每个亚组6只。动物适应性饲养1周，术前12小时禁食，自由饮水，术前大鼠尾巴编号便于区别、称取体重并记录。SAE组首先接受10%水合氯醛腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后，将其仰卧并固定在手术台上。进行皮肤准备、消毒和铺巾，然后在腹正中线剑突下切开2 cm，探查盲肠并暴露出来。在距离盲肠尾部1/3处用丝线结扎，并用18号针头穿孔结扎盲肠一次。从穿孔处挤出适量粪便后，将盲肠放回腹腔，然后进行逐层缝合。结束后，给予适量生理盐水进行液体复苏。大鼠在12小时明暗交替的饲养笼内可以自由进食和饮水。Sham组仅进行开腹盲肠探查，不进行盲肠结扎穿孔，余操作同SAE组。

2.2.2. 脓毒症大鼠模型评价

造模后大鼠表现出一系列病理特征，包括活动量减少、被毛倒立、出现颤抖以及眼睛和口部周围可见血性分泌物。此外，术后经过12小时、24小时及48小时的腹部手术探查，观察到盲肠的结扎区域出现坏死并伴有组织粘连现象，腹腔内积累血性渗出液，并且散发出难闻的异味，这些征象均提示了脓毒症模型的成功建立。

2.2.3. 取材

各个亚组于各时间点行大鼠神经行为学评分评价大鼠、翻正反射、甩尾反射和逃避反射改变。0分为无反射，1分为反射减弱(10 s以内缺乏反射)，2分为正常反射。每只大鼠最高评分为10分，评分越低说明脑损伤越严重。对实验大鼠进行称重并记录数据。以10%水合氯醛进行腹腔注射以实现麻醉效果，待麻醉达到理想状态后，将大鼠置于手术台上，保持仰卧姿势并固定。用剪刀沿肋骨剪开，以暴露胸腔。采用静脉采血针从心尖部位置插入，抽取3毫升的心室血液。所采集的血液在室温下静置后进行离心处理，收集上层清液并进行标记，将其存放于−80℃的冷冻环境中，以备后续的Elisa检测。通过左心室插入一根细针至主动脉，同时剪开右心耳以放出血液。通过主动脉注入4%的多聚甲醛缓冲液，直至观察到无血色的透明液体从右心耳流出，并且肝脏颜色变为白色为止。最后，切开大鼠的头皮和颅骨，取出大脑组织。利用直镊小心地揭开大脑皮层，位于底部的海马组织呈月牙形状。在海马组织暴露后，谨慎地分离并取出海马体，将其置于4%的多聚甲醛缓冲液中固定，并存放于4℃的冷藏环境中，以便进行后续的石蜡切片病理检测。

2.2.4. 大鼠血清TNF-α、NSE、S100β、NT-proCNP水平的测定

取血清用ELisa试剂盒检测TNF-α、NSE、S100β、NT-proCNP，酶标仪检测560 nm波长处吸光度值，根据标准曲线计算各组大鼠血清中各因子水平。实验操作严格按照说明书步骤进行。

2.2.5. HE染色观察脑组织病理变化

组织固定48 h后，常规梯度酒精脱水，透明，包埋；切片4微米用于染色。切片先经苏木素染色1 min，流水冲洗3 min，然后伊红染色10 s，再经过脱水，封片后，于倒置荧光显微镜下观察海马CA1区损伤情况。

2.2.6. 统计学分析

所有数据采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料采用均数 ± 标准差($\overline{x}\pm s$ )表示，单因素两组以上的均数间差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P < 0.05表示差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 行为学评分

评分均在取材之前进行。神经行为学评分显示，与Sham组同时间相比，SAE组在24 h、48 h神经学评分均明显降低，差异有统计学意义(P < 0.01)。SAE组内与12 h相比，24 h、48 h神经学评分均明显降低，差异有统计学意义(P < 0.05) (见图1)。

Figure 1. Neurobehavioral scores in each group of rats at corresponding time points (* indicates P < 0.05, ** indicates P < 0.01)

图1. 各组大鼠相应时间点的神经行为学评分(*代表P < 0.05，**代表P < 0.01)

3.2. SAE组血清中TNF-α、NSE、NT-proCNP、S100β的表达均明显升高

Elisa结果显示，与Sham组同时间相比，SAE组TNF-α水平在12 h、24 h和48 h均明显提高，差异有统计学意义(P < 0.05)；SAE组内12 h、24 h、48 h随时间进展TNF-α水平随之提高，差异有统计学意义(P < 0.01) (见图2)。

Figure 2. Levels of TNF-α in each group of rats at corresponding time points (* indicates P < 0.05, ** indicates P < 0.01)

图2. 各组大鼠相应时间点的TNF-α的水平(*代表P < 0.05，**代表P < 0.01)

Elisa结果显示，与Sham组同时间相比，SAE组NSE水平在24 h和48 h均明显提高，差异有统计学意义(P < 0.05) (见图3)。

Figure 3. Levels of NSE in each group of rats at corresponding time points (* indicates P < 0.05)

图3. 各组大鼠相应时间点的NSE的水平(*代表P < 0.05)

Figure 4. Levels of S100β in each group of rats at corresponding time points (* indicates P < 0.05, ** indicates P < 0.01)

图4. 各组大鼠相应时间点的S100β的水平(*代表P < 0.05，**代表P < 0.01)

Elisa结果显示，与Sham组同时间相比，SAE组S100β水平在24 h和48 h均明显提高，差异有统计学意义(P < 0.01)。SAE组内与12 h相比，S100β水平在24 h、48 h明显升高，差异有统计学意义(P < 0.05) (见图4)。

Elisa结果显示，与Sham组同时间相比，SAE组NT-proCNP水平在24 h和48 h均明显提高，差异有统计学意义(P < 0.05) (见图5)。

Figure 5. Levels of NT-proCNP in each group of rats at corresponding time points (* indicates P < 0.05)

图5. 各组大鼠相应时间点的NT-proCNP的水平(*代表P < 0.05)

Figure 6. Histological results of the hippocampal tissues in each group of rats (HE staining, ×20) (Note: A represents the Sham group, B~D represent the SAE group at 12 h, 24 h, and 48 h post-operation, respectively)

图6. 各组大鼠海马组织病理结果(HE染色，×20) (注：A为Sham组，B~D为SAE组术后12 h、24 h、48 h)

3.3. HE染色

HE染色结果显示，Sham组脑区海马区域组织形态正常，无水肿；SAE组脑区海马区域组织水肿，空泡状坏死细胞随时间延长而增多(见图6)。

4. 讨论

脓毒症是一种由宿主对感染反应失调甚至会发生威胁生命的器官功能障碍严重疾病[1]。它是一种全身性失调的炎症反应，对各个器官系统都有重要的影响。脓毒症中常见的受累部位之一是中枢神经系统。在排除位于中枢神经系统感染或其他可能引起脑功能障碍的因素的情况下，感染引起的弥漫性脑功能障碍被称为脓毒症相关性脑病[3]。目前常用的脓毒症造模方法有脂多糖注射模型和盲肠结扎穿刺模型。有实验已经证实在脓毒症造模中给予不同梯度剂量的脂多糖具有中枢神经系统保护作用[18]。因此本研究选择的是盲肠结扎穿刺模型。TNF-α作为一种促炎细胞因子，是在各种疾病的病理过程中被诱导产生的。本研究SAE组各时间点大鼠血清TNF-α水平较Sham组升高，差异有统计学意义(P < 0.05)，且SAE组各时间点间TNF-α水平比较，差异有统计学意义(P < 0.01)，提示脓毒症大鼠模型建立成功。本研究通过大鼠神经反射行为学评分以及海马病理结构改变进一步证实脓毒症相关性脑病模型建立成功。在脓毒症造成的神经行为学评分中，分数越低代表脑损伤的程度越严重[19]。因此在CLP手术后可以通过异常的神经行为检测到SAE的急性期[20]。本研究术后24 h、48 h脓毒症相关性脑病组大鼠神经学评分与假手术组相比均明显减低，差异有统计学意义(P < 0.05)。24 h、48 h脓毒症相关性脑病组大鼠大脑组织的病理形态为：脑组织明显水肿，可见较多深染的细胞核，空泡状坏死增多。提示SAE组24 h、48 h脓毒性相关性脑病组大鼠模型建立成功。SAE组12 h大鼠神经行为学评分与假手术组比较，差异无统计学意义(P > 0.05)，海马病理形态可见脑组织轻度水肿，少量深染的细胞核，少量空泡状坏死，提示尚未出现脓毒症相关性脑病。

NSE主要由神经元、神经内分泌细胞合成[11]，参与人体内包括氧化应激、能量代谢、炎性反应等多种病理生理过程。NSE仅有一种亚型存在于红细胞和血小板中，且浓度极低，因此在神经系统疾病中具有很高的特异性，对颅脑损伤[21]尤其是心脏骤停[22]患者神经预后不良有良好的预测能力。根据2021年欧洲复苏委员会和欧洲重症监护医学学会发布的指南，对于心脏骤停后的缺血和缺氧性脑损伤患者，可以通过连续监测血清中NSE水平来评估其神经功能的预后情况[23]。本研究发现，SAE组24 h和48 h大鼠血清中NSE水平较假手术组同一时间点升高，差异有统计学意义(P < 0.05)，SAE组各时间点大鼠血清中NSE水平均值有升高趋势，但差异无统计学意义(P > 0.05)。本研究结果提示脓毒症相关性脑病大鼠血清NSE水平明显升高，但无明显时间相关性。

S100β蛋白是一种低分子量的酸性钙结合蛋白，它在神经系统中具有多重功能，包括刺激轴突生长、为神经细胞提供营养、以及促进神经细胞的再生。在正常情况下，血清和脑脊液中的S100β表达水平是比较低的。然而，当脑部遭受到如病毒性脑炎或脑出血等损伤时，S100β的含量会迅速上升。这种上升与一氧化氮的生成有关，一氧化氮是一种具有神经毒性的分子，它会导致神经细胞发生凋亡和坏死，从而加剧疾病的进程[24]。因此S100β常用来评估脑损伤的严重程度，预测脑卒中、创伤性脑损伤、脑病和谵妄的预后[25]。本研究发现，SAE组24 h和48 h大鼠血清中S100β水平较假手术组同一时间点升高，差异有统计学意义(P < 0.01)；SAE组各时间点大鼠血清中S100β水平均值有升高趋势，24 h、48 h亚组与12 h亚组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)，24 h和48 h亚组间比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。本研究结果提示脓毒症相关性脑病大鼠血清S100β明显升高，有一定时间相关性。

NT-proCNP作为利钠肽的活性形式之一，主要由血管内皮产生，在中枢神经系统和肾脏中有表达[26]。NT-proCNP是一种生物标志物，与炎症性疾病有关，一定程度上可以提示脓毒症[17]。在脓毒症患者中，NT-proCNP的水平会明显升高，这可能与并发的颅内感染和中毒性脑病有关。更值得注意的是，在脓毒症的早期阶段，血浆中NT-proCNP的高峰浓度可能预示着神经系统的损害、症状的出现以及神经功能障碍的风险[17]。本研究发现SAE组24 h和48 h大鼠血清中NT-proCNP水平较假手术组同一时间点升高，差异有统计学意义(P < 0.05)，SAE组各时间点大鼠血清中NT-proCNP水平均值有升高趋势，但差异无统计学意义(P > 0.05)。本研究结果提示脓毒症相关性脑病大鼠血清NT-proCNP水平明显升高，但无明显时间相关性。

综上，大鼠血清中S100β、NSE和NT-proCNP水平的升高与SAE发生具有相关性，动态监测脓毒症患者血清中水平的变化有助于早期发现和诊断SAE。本研究目前仅在动物实验阶段，尚未研究临床样本血清中的表达。

基金项目

烟台市科技创新发展计划项目(2022YD020)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。