水凝胶微球载药方式在关节区软骨中的应用

Application of Drug-Loading Method Using Hydrogel Microspheres in Articular Cartilage

摘要: 关节软骨损伤是临床上常见的疾病，其修复与再生一直是医学领域的研究热点。传统的治疗方法如手术修复、药物治疗等存在一定的局限性，难以达到理想的修复效果。近年来，随着生物材料和组织工程技术的不断发展，水凝胶微球载物作为一种新型的治疗策略，逐渐受到研究者的关注。水凝胶微球是一种具有优良生物相容性和可降解性的药物载体，能够通过物理或化学方法将药物包裹在微球内部。药物释放机制方面，水凝胶微球通过溶胀、降解等方式实现外泌体的可控释放。这种释放机制能够使外泌体在关节区持续、稳定地发挥作用，提高治疗效果。本文对近年来水凝胶微球载细胞与非细胞(细胞因子、蛋白肽、药物、外泌体和RNA)在关节区软骨应用的研究进展进行了综述，通过梳理和分析相关文献，总结了当前研究的局限性和未来发展方向，为关节软骨损伤的治疗提供了新的思路和方法。

Abstract: Joint cartilage injury is a common disease in clinical practice, and its repair and regeneration have always been a research hotspot in the medical field. Traditional treatment methods such as surgical repair and drug therapy have certain limitations and are difficult to achieve ideal repair results. In recent years, with the continuous development of biomaterials and tissue engineering technology, hydrogel microspheres as a new therapeutic strategy have gradually attracted the attention of researchers. Hydrogel microsphere is a kind of drug carrier with excellent biocompatibility and degradability, which can wrap the drug inside the microsphere by physical or chemical methods. In terms of drug release mechanism, hydrogel microspheres achieve controlled release of exosomes through swelling, degradation and other ways. This release mechanism can enable extracellular vesicles to continuously and stably function in the joint area, improving treatment effectiveness. This article reviews the research progress of the application of cellular and non cellular (cytokines, protein peptides, drugs, exosomes and RNA) hydrogel microspheres in articular cartilage in recent years, summarizes the limitations of current research and future development direction by combing and analyzing relevant literature, and provides new ideas and methods for the treatment of articular cartilage injury.

1. 引言

在临床上，解决软骨再生是克服骨关节炎(OA)的关键。同时，由于软骨细胞再生能力的有限，为机体提供生长因子，成为了治疗中重要的一步。那么水凝胶可以作为载药平台的特点就使之较传统手术治疗体现出了优越性，考虑生物相容性和降解问题，则需要在水凝胶的形式和药物种类进行探究。同时，由于软骨的结构特殊性，我们考虑到水凝胶的另一优点，通过该水凝胶微球在水环境中的水合润滑作用，降低关节摩擦，从而减少软骨磨损[1]，从而在最大程度上保护软骨。本文主要从载细胞和非载细胞两方面来探究水凝胶载药平台对软骨再生的作用。其中，载细胞微球作为一种新型的干细胞培养和递送支架在再生医学领域颇受关注，它们具有尺寸小、比表面积大、可微创注射、能为细胞提供3D生长环境、可一体化体外扩增和体内移植等诸多优点[2]。非载细胞微球形式更为广泛，其中载药微球是较为直接的方式，控制药物靶向性到达损伤部位，而水凝胶微球载外泌体RNA药物在促进软骨修复的同时[3]，能够提高修复质量，减少并发症的发生[4]。载细胞因子微球优势性则与相关细胞因子功能息息相关，本文旨在探究水凝胶微球载药系统对软骨修复的促进作用。

2. 载细胞

扫描电子显微镜(SEM)观察显示水凝胶微球具有多孔隙结构，可用于细胞的装载[5]，并且无细胞毒性，这是载细胞微球实现临床应用的必要条件。毋庸置疑，搭载物质是至关重要的部分，为了能够稳定持续地对抗炎症发展，载细胞微球成为一大优势选项。例如，使用天然大分子材料构建细胞负载型凝胶微球载体，负载旁分泌细胞并维持其表型，创新性的构建出外源性旁分泌效应供给体系，能够用于可注射水凝胶敷料，为新型敷料在重大体表创伤中实现高效持久的炎症调节提供方案[6]。对于软骨损伤，间充质干细胞是一种在软骨组织工程中非常具有应用前景的种子细胞[7]。水凝胶微球可作为微载体，安全有效地包裹和递送药物和细胞等活性成分，并通过自身的降解特性、多孔结构等释放活性成分，达到治疗疾病的目的[8]。就目前的研究程度来看，提高微球上细胞的负载量是一个待解决的共性问题[2]。

3. 载非细胞

3.1. 载细胞因子

关节软骨无血液供应和神经支配，当软骨缺损较大时只依靠自身细胞再生很难达到完全修复。骨髓间充质干细胞具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，在特定的诱导条件下可分化为软骨细胞。基质细胞衍生因子1β和转化生长因子β1能趋化骨髓中的骨髓间充质干细胞定向迁移至软骨缺损区，并诱导未分化的骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞，促进软骨基质合成[9]。胰岛素样生长因子-1 (insulin-likegrowthfactor-1, IGF-1)与软骨发育和再生关系密切，在ADSCs定向分化为软骨细胞的过程中起到了非常关键的作用[10]，它能够促进软骨细胞增殖、再分化，保持软骨细胞的特异表型并抑制程序性凋亡，同时促进软骨基质合成代谢，抑制软骨基质的降解，是体内调节软骨蛋白聚糖合成最重要的生长因子[11]。基质细胞衍生因子-1 (Stromalcell-derivedfactor-1, SDF-1)又被称为“归巢趋化因子”，在启动和促进干细胞归巢方面具有重要的作用。PLGA-PEG-PLGA温敏型水凝胶在植入体内后能原位胶化定点持续缓释生长因子，并能为ADSCs提供适合其生长和分化的微环境，以其为载体搭载ADSCs、SDF-1和IGF-1PLGA缓释微球的水凝胶复合体能有效地促进软骨组织再生[12]。目前研究较为深入的包括IGF和TGF。TGF超家族包括TGF-β和骨形态发生蛋白。目前主要应用于软骨诱导分化[13] [14]。海藻酸钠和壳聚糖是组织工程领域常用的两种天然高分子。由于它们各自的阴离子和阳离子特点，它们已经组合用于制备支架、纤维、水凝胶和微球等。本论文拟将它们组合应用于制备核–壳结构的微球，力图装载两种活性因子以注射方式用于关节软骨损伤修复与重建。乳化法和层层自组装方法被用于制备核–壳结构的海藻酸钠/壳聚糖微球。直接乳化交联法制备的海藻酸钠/壳聚糖核–壳型微球可较好控制内核所载药物的释放。通过后续对壳层结构和壳层所加载活性分子的研究，海藻酸钠/壳聚糖核–壳型微球有望实现活性因子顺序释放，从而在软骨组织工程中具有潜在的应用价值[15]。有研究申请的水凝胶支架包埋了类软骨陷窝结构，类软骨陷窝结构为球形结构，粒径为50 μm~500 μm；类软骨陷窝结构中装载软骨相关细胞和/或促软骨生成的细胞因子，细胞载量为2~5000个细胞/软骨陷窝。该发明将海藻酸盐的凝胶–溶胶转化过程引入软骨水凝胶支架，再通过凝胶–溶胶转化过程，将海藻酸盐固态微球在生理条件下转变成液态溶液，形成水凝胶支架内部的球形空腔，并在空腔内原位载有软骨细胞。这一发明解决了在全生理条件致孔(模拟软骨陷窝结构)的问题，同时也确保细胞分布在模拟软骨陷窝的空腔中[16]。利用基于金表面微图案化技术构建MAPCs-PEG水凝胶并结合生长因子欲提高MAPCs分化效率以获得表型稳定的软骨种子细胞。对MAPC进行提取、纯化、扩增、鉴定，分析MAPC生物学特性，并优化培养基和培养方法，细胞表面标志物检测表明研究组所获得的大部分细胞为MAPC。以此为基础，诱导MAPC向软骨样细胞分化，甲苯胺蓝染色检测聚糖多聚体呈阳性反应，免疫荧光检测发现II型胶原表达增加，qPCR检测诱导后II型胶原mRNA表达增加，这些结果证明了MAPC向软骨分化的可行性。同时检测了β2微球蛋白在MAPC上的分布，并利用siRNA转染技术使β2微球蛋白的表达减少，减少其免疫原性，并对分化指标进行检测，发现其在降低种子细胞免疫原性的同时并不影响其向关节软骨分化，这表明MAPC在临床治疗软骨缺损等疾病上拥有很大潜力[17]。

3.2. 载蛋白肽

在软骨修复再生领域，水凝胶负载蛋白肽已经被用于改善加强原水凝胶的性能或者缓释蛋白降低毒副作用。潘西满以具有生物活性的甲基丙烯酰化明胶(Gelatin Methacryloyl, GelMA)冻胶为研究对象，利用含活性双键的丝素蛋白(SF-GMA)与GelMA复合在−20℃交联成型，经甲醇溶液诱导丝素蛋白构象转变后，复合冻胶的力学性能得到增强、降解周期有效延长且生物相容性良好[18]。黄晨光设计制备了负载鹿茸多肽(PAP)的温敏胶原基水凝胶，并在体外将骨髓间充质干细胞(BMSCs)包封于其中，然后植入到兔膝关节软骨缺损模型中，通过PLGA微球包载以及凝胶的包裹，在一定程度上有效延长了PAP的持续释放时间，实现了软骨缺损区新生组织的生成与PAP的控缓释放在时空方面完美匹配，观察到其在第12周时生成的新生组织与正常软骨极为相似，基本实现了完全修复[19]。姚俊用其水凝胶包裹蜂毒肽，将包裹较高浓度的蜂毒肽软骨水凝胶在室温环境下缓慢释放，负载蜂毒肽的软骨水凝胶减弱高浓度蜂毒肽对细胞的毒性和溶血作用，延长了释放时间，并且改善了骨关节炎对细胞活力、增殖能力的抑制作用，这些结果说明蜂毒肽–水凝胶可减弱蜂毒肽的毒性作用，并保留蜂毒肽在治疗骨关节炎上的作用，展示了其临床应用潜力[20]。林蛙胶原蛋白肽(Rana chensinensis skin peptides, RCSPs)是从中国林蛙皮中提取的混合物，主要由多肽和蛋白质组成[21]。冀璇将林蛙胶原蛋白肽(RCSPs)负载于海藻酸钙核壳微球，并将载药核壳微球包埋于聚乙烯醇–明胶水凝胶，构建复合支架可作为序贯给药释放系统持续缓慢释放RCSPs，以促进大鼠全层伤口快速愈合[22]。抗炎肽(KAFAK)是一种细胞穿透肽，通过抑制丝裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶2 (MK2)，能减少炎性因子IL-6和TNF-α的分泌[23]。秦晓平等人通过溶剂热法制备锆金属有机框架(Zr MOF)，并负载抗炎肽KAFAK，用紫外光交联法制备普鲁兰多糖/聚乙二醇复合水凝胶，将Zr MOF封装于水凝胶内部后，延长抗炎肽KAFAK的释放时间达到21 d，保证持续控制炎性微环境的能力，有利于营养物质的转运和代谢废物的排出和软骨再生[24]。

3.3. 载药

药物如非类固醇抗炎药等凭借减轻疼痛和炎症的功能成为治疗骨损伤的常用药物。传统的给药系统(如口服、局部注射、静脉注射等)由于需要高剂量多次给药和脱靶效应等存在很大的局限性。水凝胶微球由于小尺寸、高比表面积、高孔隙率、可注射等优势，能够以较好的效率封装因子/药物并进行微创注射，促进其向靶细胞或靶组织高效递送并可控释放，因此逐渐成为新型给药系统中必不可少的一部分。

HAN等将甲基丙烯酸酐化明胶微球表面包裹一层多巴胺甲基丙烯酰胺-2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和双氯芬酸钠，制备了表面润滑的GelMA @DMA -MPC @DS，用于大鼠骨关节炎治疗，组织学结果显示在8周的疗程中，GelMA @DMA-MPC @DS由于双氯芬酸钠的持续释放和多巴胺甲基丙烯酰胺-2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的润滑作用，有效促进了糖胺聚糖沉积，显著减少了关节间隙狭窄和炎症水平，治疗效果最好[25]。焦海胜等人研究可注射型透明质酸钠温敏水凝胶负载倍他米松微球关节腔注射治疗OA。这种新型的药物传递系统选用可生物降解的PLGA为囊材，制备可关节腔注射的载倍他米松缓释微球；同时利用壳聚糖的温敏胶凝性质，与透明质酸钠物理联合成为混合的水凝胶制剂；然后将倍他米松微球负载于壳聚糖透明质酸钠温敏水凝胶形成复合给药系统。不仅发挥两种药物的协同作用，而且减少单独给药的次数，降低潜在感染率[26]。桑亚以壳聚糖、羟丙基纤维素为有机基材，分别以氧化石墨烯、硅藻土、二氧化硅气凝胶无机物为填料，以戊二醛为交联剂，以五氟尿嘧啶(5-Fu)为模型药物采用化学交联法制备了三种有机无机复合凝胶微球GO/HPC/CS@5-Fu、DE/HPC/CS@5-Fu、SiO₂/HPC/CS@5-Fu，具有良好的球形形貌和多孔结构，且具有良好的热稳定性能[27]。扶晓明体外构建BMSCs-庆大霉素–藻酸钙三维缓释微球培养体系，并验证在体内复杂的环境下，BMSCs-庆大霉素–藻酸钙三维缓释凝珠的各成分之间具有良好的组织相容性，能给BMSCs的增殖和其向体外培养的BMSCs-庆大霉素–藻酸钙三维缓释凝珠，对关节软骨损伤动物模型的短期修复效果良好[28]。任朋创新性地用微流控技术构建了可注射的单分散水凝胶微球并成功负载IA-ZIF-8@HMs，缓慢释放IA-ZIF-8纳米颗粒。在体外细胞实验中，抗氧化应激和抗炎效果较明显。动物实验表明IA-ZIF-8@HMs在大鼠OA模型中具有长期有效的治疗作用[29]。

3.4. 载外泌体

外泌体是一种由细胞分泌的纳米级囊泡[30]，内含多种生物活性物质，如蛋白质、核酸和脂质等[31]。研究表明，外泌体在细胞间通讯、组织修复和再生等方面发挥重要作用[32]。在关节软骨修复中，外泌体可通过促进软骨细胞增殖、分化和基质合成[33]，抑制炎症反应和凋亡等途径[34]，实现关节软骨的再生修复[35]。

多项研究表明，水凝胶微球载外泌体药物在关节软骨修复中展现出良好的应用前景[35]。外泌体作为细胞间通讯的重要媒介[36]，含有丰富的生物活性物质，能够促进软骨细胞的增殖、分化和基质合成[37]。通过水凝胶微球的缓释作用，外泌体能够在关节区实现持续、稳定地释放[38]，从而有效促进软骨修复[39]。此外，水凝胶微球还具有良好的组织相容性和生物活性[40]，能够与关节软骨组织紧密结合[41]，为软骨细胞的生长和分化提供良好的微环境[42]。

3.5. 载RNA

RNA药物是一类具有特定序列和功能的RNA分子[43]，能够通过调控基因表达或干扰细胞信号通路来发挥治疗作用[44]，在关节软骨修复中，RNA药物可通过促进软骨细胞的增殖、分化和基质合成[45]，抑制炎症反应和凋亡等途径[46]，实现关节软骨的再生修复[47]，比如说miR-2a、miR-2b、miR-6、miR-11及miR-13b等，都起到了一定的效果[48]-[52]。与传统的蛋白质药物相比，RNA药物具有更高的稳定性和更低的免疫原性[53]，因此具有更广阔的应用前景。

水凝胶微球作为RNA药物的递送载体，能够实现RNA药物的精准递送和持续释放。通过关节腔内注射水凝胶微球载RNA药物，可以实现对关节软骨损伤部位的靶向治疗。RNA药物在水凝胶微球的保护下，能够稳定地到达靶细胞并发挥其生物学活性。研究表明，水凝胶微球载RNA药物能够促进软骨细胞的增殖和分化，增加软骨基质合成，改善关节软骨的结构和功能。此外，水凝胶微球载RNA药物还具有抗炎、抗凋亡等作用，能够减轻关节炎症反应，保护关节软骨免受进一步损伤。

4. 结语与展望

水凝胶微球以其独特的结构特点和优越的生物理化性质，并随着各种生物工程技术和交叉科学的发展，新型功能性水凝胶微球在骨组织工程与再生医学研究中展现出极大的潜能。

该综述总结了前人关于水凝胶微球用于骨组织工程的研究进展，从搭载细胞、搭载细胞因子、搭载药物、搭载蛋白肽、搭载外泌体与其他新型材料结合等方面多维度综述了现阶段水凝胶微球用于骨关节软骨组织修复的潜能和策略，并在此基础上通过对水凝胶的创新性设计，使其实现与碱性成纤维细胞生长因子的搭建，构建出一种创新性的、可搭载生物活性因子的温敏性水凝胶。同时我们总结了现阶段基于水凝胶微球材料的骨组织工程调控骨组织修复再生的机制，同时讨论了未来基于水凝胶微球的骨组织工程研究有可能面临的关键问题和挑战，并提出建议性的解决方法。同时我们构建了可载生物活性因子的温敏性水凝胶这一新型材料，为骨组织工程修复治疗提供了新的思路。

同时，本综述具有一定的局限性。该综述虽然总结了水凝胶微球现阶段在骨关节软骨组织修复的潜能和策略，但并未对其制备工艺进行全面讨论；未对水凝胶微球的毒性、体内代谢过程和潜在影响进行全面探讨，因此无法准确评估其安全性和长期作用效果；着重总结水凝胶微球在骨组织工程中的基础研究，未涉及其临床前研究或临床应用情况。

综上所述，基于对既往其他研究者们通过学科交叉的方法结合新的工程技术，所制备的用于骨组织工程的新型多功能水凝胶微球材料的研究与讨论，我们总结了水凝胶微球在骨损伤修复中的功能化与智能可控性，推动了水凝胶微球制备工艺的发展，同时为基于水凝胶微球的骨组织工程研究提供了新思路，并在修复软骨缺损的临床应用中提供了基于细胞水平的理论依据，在软骨组织工程中将具有广阔的应用前景。