多孔淀粉益生菌微胶囊的制备及其对益生菌存活率的影响

Porous Starch Probiotic Preparation of Microcapsules and Their Effects on Probiotic Survival Rate

摘要: 益生菌是对人体健康有益的一类活性微生物。由于菌体对外界环境高度敏感，在生产、储存和使用过程中容易出现存活率低或生物活性差等问题，显著降低了益生菌的益生效果。而包埋技术可以在产品的加工和贮藏过程中为益生菌提供保护，提高其在产品中的存活率。因此，本文就益生菌包埋技术的作用、包埋材料的选择以及淀粉在益生菌包埋技术中的应用进行综述，其中介绍了淀粉的特性和多孔淀粉在益生菌包埋技术中的优势。最后提出需要进一步研究的问题与发展建议，旨在研制出具有实际应用价值的多孔淀粉/益生菌微胶囊，为后续研究提供参考。

Abstract: Probiotics are a class of active microorganisms that are beneficial to human health. Due to the high sensitivity of bacteria to the external environment, it is easy to have a low survival rate or poor biological activity during production, storage and use, which significantly reduces the probiotic effect. And the embedding technology can provide protection for probiotics during the processing and storage of products, enhancing their survival rate within the products. Therefore, in this paper, the effect of probiotics embedding technology, the selection of the embedding material and starch in the application of probiotics embedding technology were reviewed, which introduces the characteristics of starch and porous starch in the advantages of probiotic embedding technology. At last, it puts forward problems that need further study and development to develop practical application value for porous starch/probiotic microcapsules and provide a reference for further research.

1. 前言

2001年，FAO/WHO正式将益生菌定义为“活的益生菌，足量摄入后对宿主的健康有益”。2013年，国际益生菌和益生元科学协会(ISAPP)在FAO/WHO定义的基础上进行了简单修改，并强调了益生菌菌株鉴定和安全性评价的重要性[1]。迄今为止，益生菌已被证明对治疗胃肠道、口腔、阴道、皮肤等方面的疾病有积极效果并广泛应用于食品及其他领域。然而，益生菌的活力受到生产(温度、氧气、剪切力等)和储存(水分、氧气、与包装和储存相关的温度)的显著影响，并且仅当食用活菌的数量高于或等于每毫升或每克产品10⁷ CFU时，治疗效果才会显现。这就是为什么创造新的包埋和固定化技术并改进现有技术至关重要。因此，本文概述了微胶囊包埋益生菌技术的作用、包埋材料的选择以及淀粉在益生菌包埋技术中的应用，其中介绍了多孔淀粉的特性及其在益生菌包埋技术中的优势，旨在为后续研究提供参考。

2. 益生菌与微胶囊包埋技术

益生菌作为可定植于人体内，并起有益作用的活性微生物。益生菌能够调节肠道内的菌群平衡，降解生物大分子的同时促进消化吸收、抑制致病菌的增殖，因此普遍应用于食品行业与医疗行业[2]。

微胶囊技术系指使用天然或合成的高分子材料，将固体、液体或气体等小物质包裹涂层[3]。一般将包埋材料称作“壁材”，包裹在微胶囊内部的物质称为“芯材”。为解决益生菌在不利环境下(胃酸、消化酶、胆汁酸盐等)活性下降、定植时间短、吸收效率低等问题，微胶囊技术能够将益生菌嵌入在各种壁材中，在益生菌周围形成屏障，减少其与外界环境的反应[4]。益生菌的微胶囊化能够保护并增加益生菌的稳定性、促进益生菌粘附并延长停留时间、实现益生菌的控释等[5]。

近年来，各种生物材料(多糖、蛋白质、脂质、合成聚合物等)作为微胶囊壁材被应用于益生菌的包埋。如今制备微胶囊的技术有挤压法、乳化法、凝胶法、喷雾干燥等[6] [7]。但高温的使用会导致干燥过程中益生菌的热失活和同时脱水，这是需要解决的关键缺点[8]。微胶囊壁材所选择的材料应在环境中保持稳定，具有承受生产、运输、储存和应用过程等不利条件的机械强度；具有良好的理化性质以及足够的降解或溶解特性，以便控制释放至环境中。不同的壁材可能体现出不一样的效果[3]。益生菌的大小通常约1 μm~10 μm，包埋到过小或过大的胶体递送系统中，都会有许多不利的影响。

3. 独特的益生菌包埋材料——淀粉

Figure 1. Starch in the application of microbial embedding technology

图1. 淀粉在微生物包埋技术中的应用示意图

淀粉在益生菌等微生物包埋技术中的独特作用越来越受到关注，淀粉可以在产品的加工和贮藏过程中为益生菌提供保护，提高其在产品中的存活率，在食品、制药、化妆品和农业等领域中被广泛应用(图1)。目前所使用的淀粉分为两大类：天然淀粉和变性淀粉。通过淀粉改性不仅可改善淀粉原有性质，还可赋予其新的功能特性。多孔淀粉就属于近年来备受关注的功能性变性淀粉[5]。

3.1. 淀粉特性

3.1.1. 天然淀粉

淀粉是一种由直链淀粉和支链淀粉组成的天然多糖，以离散的颗粒形式存在于自然界中，其大小在1到100 μm不等。颗粒结构非常致密且不溶于水，在室温下仅在水中轻微溶解。当淀粉在水中加热到80℃左右时，颗粒结构就会不可逆地消失，要完全溶解颗粒就必须提供足够的热能和机械能。天然淀粉因其纯天然、价格低廉、含量丰富、可生物降解、可再生、无毒等优良特性而成为最广泛使用的天然生物聚合物之一，能够作为输送系统[9]。然而作为吸附剂的应用受到其天然低表面积和孔容积的限制。

3.1.2. 多孔淀粉

多孔淀粉的颗粒表面具有丰富的、延伸至中心的微米级孔隙，孔隙直径一般约1 μm，总体积约为淀粉的一半[10]，而且这些孔隙提供的空间，可作为封装益生菌等活性成分的保护微环境。多孔淀粉可通过物理、化学、生物酶法以及两种或多种方法同时使用的复合法制备得到[11] [12]，其中，生物酶法分为单一酶法和复合酶法，在复合酶处理中，不同类型的酶结合使用会产生协同效应，从而提高孔隙形成的有效性。相比于物理化学改性，酶法改性具有许多优点，包括副产物更少、产率更高，此外还可以更好地控制反应过程以获得特定性能。多孔淀粉所具有的高比表面积、高比孔容以及优异的吸附性能，显著提高了被包埋益生菌的存活率和环境耐受性，为益生菌的生产提供了巨大的可能性。

3.2. 淀粉在益生菌包埋技术中的应用

淀粉作为微胶囊包埋壁材，在益生菌包埋方面发挥着独特优势，如作为填充剂、干燥保护剂等。淀粉的独特优势主要体现在：一是淀粉的添加可以减少产品中的水分含量并增加干物质量，将益生菌与外界环境分离，提高益生菌的稳定性与存活率[9]；二是淀粉增加了产品内部的机械阻力，通过影响产品的结构特性进而控制益生菌逐步释放；三是淀粉可作为益生菌的碳源和物理屏障，保护益生菌免受外部压力[16]。并且已有研究发现并证实淀粉颗粒还为益生菌的附着提供了理想表面，益生菌对淀粉的粘附与特定的细菌表面蛋白有关，一些益生菌可以通过物理作用粘附在淀粉上(图2)，这种益生菌和淀粉结合作用的发现有利于扩大淀粉在益生菌包埋技术中的应用范围。

注：(A) 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) L1粘附于天然甘薯淀粉颗粒的扫描电子显微照片[13]；(B) 双歧杆菌(Bifidobacterium) PL2粘附于高直链玉米淀粉颗粒的扫描电子显微照片(比例尺2 μm) [14]；(C) 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CECT 230粘附于玉米多孔淀粉颗粒的扫描电子显微照片[15]。

Figure 2. Scanning electron micrographs of probiotic adherence to starch

图2. 益生菌粘附淀粉的扫描电子显微照片

3.2.1. 淀粉作为填充剂

使用淀粉作为益生菌包埋的基质填充剂，主要是利用淀粉来增加干物质比重、充当膨松剂或阻断孔隙来减缓水的流入和产品结构的含水量。这种策略可以使益生菌在基质中保持较高的保留率和存活率，并在长期储存和压力环境条件下保持稳定，这种功能在通过离子型凝胶化技术生产的凝胶珠中得以体现。Widaningrum等[17]的研究表明，玉米淀粉和西米淀粉可以通过堵塞海藻酸钙网络中的孔隙来减少干酪乳杆菌和长双歧杆菌与干燥过程中的空气、热量等外部环境的直接接触，从而获得高活性的益生菌发酵剂。Ta等[18]在使用挤压法将干酪乳杆菌01包埋在抗性淀粉/海藻酸盐水凝胶的研究中发现了相同的机制，即海藻酸盐网络的孔径随着淀粉的掺入而减小，讨论了由于这种碳水化合物颗粒存在于藻酸盐凝胶空腔中，因此在搅拌过程中提供了更高的益生菌保留率。此外，Kanmani和Lim等[19]利用普鲁兰多糖和不同来源的淀粉经浇铸技术制备的益生菌可食用薄膜表现出优良的物理和机械性能，可食膜的水蒸气渗透率和吸水率随着淀粉含量的增加而显著降低。总的来说，这些研究表明，使用淀粉作为填充剂可以改善包埋基质的特性，例如加工和储存期间的存活、干燥时的保护以及机械阻力的改善。

3.2.2. 淀粉作为干燥保护剂

淀粉的存在可以保护益生菌在包埋过程中不脱水，从而提高益生菌的存活率。当充满水的空间在干燥后生成空隙时，益生菌粘附淀粉的性能进一步增强，这种渗透保护可能与淀粉作为结构支撑物的作用有关。Dam等[20]将嗜酸乳杆菌ATCC 4356包埋在淀粉、甘油和海藻酸钠中制成微胶囊，在含有不同浓度淀粉的配方中，益生菌在储存期间都得到了更好的保护，并且所含淀粉浓度较高的微胶囊在冷冻干燥后和储存期间提供了更高的益生菌密度和更低的水分活度。淀粉的加入不仅提高了微胶囊的机械强度和稳定性，还有助于形成更加规则的微胶囊形状。此外，淀粉为益生菌提供了附着的表面，显著增加了微胶囊内部的细菌密度，同时促进了冷冻干燥过程中的稳定性，减少了结构破坏和细菌损伤。淀粉的吸湿性还有助于调节微胶囊的水分含量和水活性，从而延长产品的保质期和提高储存稳定性。

Donthidi等[21]使用糊化形式的不同淀粉(玉米、马铃薯、大米、糯玉米、糯米和小麦)制备干酪乳杆菌冻干珠，研究发现经淀粉包埋的益生菌存活率远高于未包埋的益生菌。此外，在冷冻干燥过程中，淀粉类型与包埋的干酪乳杆菌的存活率之间存在明显的对应关系，可根据其在冷冻干燥或储存过程中对益生菌活力的影响来选择合适的淀粉。通过深入对比不同淀粉类型对益生菌存活率的影响，为开发更有效的益生菌包埋技术提供了科学依据。

Hongpattarakere等[22]研究发现泰国Saba香蕉抗性淀粉在干燥过程中有效地保护了植物乳杆菌CIF17AN2，而未使用Saba香蕉抗性淀粉的情况下，真空干燥的植物乳杆菌CIF17AN2的存活率显著降低。当水分在干燥过程中被移除，形成空隙时，益生菌与淀粉的粘附性能得到进一步增强。添加Saba抗性淀粉的菌株在37℃的真空干燥条件下可实现最大存活率。Saba抗性淀粉不仅在真空干燥过程中保护了益生菌，而且在随后的室温储存过程中也稳定了益生菌的活力。Saba抗性淀粉在益生菌包埋过程起到关键作用，不仅提供了物理屏障，还通过其化学结构为益生菌提供保护。在Saba抗性淀粉的存在下，合生元产品的水分含量在常温和低温下的整个储存期内都非常稳定。这些研究探讨了淀粉作为干燥保护剂的作用，帮助益生菌在加工和储存过程中保持活力。

3.2.3. 淀粉作为涂层

淀粉既可以作为配方辅料，也可以作为产品的涂层。涂层的主要功能之一是将益生菌与外界环境分离，形成了一个更加封闭的环境，阻隔了益生菌与外界的物质交换，延缓变质与分解[23]。外部涂层使益生菌微胶囊更加致密，因此使用涂层材料可以进一步增强益生菌的稳定性。Ansari等[24]使用高直链玉米抗性淀粉和Eudragit S100纳米颗粒构建海藻酸钙水凝珠的双层包衣。研究发现，涂层对被包埋的嗜酸乳杆菌LA5提供了更好的保护，不仅提高了益生菌在乳清饮料和人体胃肠道中的活性，还可以避免产生有助于破坏益生菌并降低其生存能力的酸和代谢物。此外，Khorasani等[25]研究评估了在干燥和模拟胃肠道条件下，淀粉和羧甲基纤维素与益生菌纳米纤维素–果胶生物纳米复合材料的结合对凝结芽孢杆菌的保护作用。研究发现，与羧甲基纤维素涂层相比，淀粉涂层形成了光滑致密的表面，不仅提高了益生菌在干燥和模拟胃肠消化后的存活率，还增强了耐热性能。Benavent-Gil等[15]开发了一种基于多孔淀粉并使用糊化淀粉、瓜尔胶和黄原胶三种生物聚合物作为涂层材料的热稳定益生菌系统。结果显示，涂有糊化淀粉的多孔淀粉微胶囊中植物乳杆菌CECT 230的包埋率最高，达到了92%~100%。上述研究探讨了淀粉涂层的效果主要体现在产品经湿热处理后和储存期间对益生菌的保护。

3.2.4. 淀粉作为物理屏障和碳源

除了保护益生菌免受干燥过程影响外，淀粉的存在还为益生菌的存活和生长提供了良好的微环境。淀粉不仅可以作为益生菌的碳源和物理屏障以保护益生菌免受外部压力，还是一种能够帮助其生存的可代谢物质。淀粉提供保护的机制可能与直链淀粉的螺旋结构有关，直链淀粉能够与这些分子形成高度吻合的复合物[8] [26]。Ma等[27]使用乳化和离子凝胶化技术将嗜酸乳杆菌包埋在多孔淀粉和海藻酸盐复合壁材中，通过真空冷冻干燥技术制备微胶囊，观察到微胶囊的外表面显示出许多微孔，这些微孔可以保留和保护益生菌，提供合适的微环境，这对于确保获得更好的保护效果至关重要。淀粉为益生菌提供的这种物理屏障对于维持包埋过程中的活力、确保长期存活以及应对应用中所面临的不利环境条件很重要，例如益生菌在胃部条件下的存活以及在湿热环境下的存储。除了物理屏障外，益生菌还需要能量来源来保持活力，这可以通过使用淀粉等碳源来实现。Lan等[28]制作了羧甲基纤维素-玉米淀粉可食薄膜，并讨论了除了提供物理保护外，包埋的乳酸乳球菌还可以利用薄膜的活性成分获取能量。Ying等[29]以糊化木薯淀粉为基质，通过喷雾干燥技术包埋鼠李糖乳杆菌GG并讨论了淀粉作为可代谢物质的作用，鼠李糖乳杆菌GG能够将淀粉代谢为单糖，从而通过糖酵解途径形成包括乙酸在内的一系列产物。如今越来越多的研究将改性淀粉作为微胶囊化的物理屏障，保持其在恶劣环境中的生存能力[30]。

4. 结语

综上所述，益生菌包埋技术的研究近年来取得显著进展，尤其在淀粉作为益生菌保护剂或载体方面备受关注。基于当前研究现状，淀粉作为益生菌包埋载体的研究需从以下两个方面加强：一是相比于天然淀粉，变性淀粉的生产过程较为复杂，甚至某些生产过程会对环境造成负面影响，必须寻求更加简便、绿色的生产工艺；二是开发淀粉基合生元产品，探究淀粉结构特征对其作为益生菌保护剂或载体的影响机制，设计出优良的淀粉载体。因此，我们拟采用简便、绿色的制备方法，研制出具有实际应用价值的多孔淀粉/益生菌微胶囊冻干粉，为益生菌产品的研发与应用提供指导和帮助。

NOTES

^*通讯作者。