MARCH2和CFTR在结直肠癌中的表达及临床意义

Expression and Clinical Significance of MARCH2 and CFTR in Colorectal Carcinoma

摘要: 目的：探讨MARCH2和CFTR在结直肠癌中的蛋白表达及与临床病理参数的相关性。方法：采用免疫组织化学SP法检测125例结直肠癌和30例正常结直肠黏膜组织中MARCH2和CFTR的表达，并复习相关文献。结果：在125例结直肠癌组织中，MARCH2和CFTR的阳性表达率分别为84.8%和8.8%，而在非肿瘤性肠组织中，这两种表达率的阳性率分别为6.7%和90.0%。MARCH2的阳性表达与肿瘤大小、深部浸润、淋巴结转移和TNM分期密切相关。此外，CFTR表达的缺失与分化不良、淋巴结转移和TNM分期显著相关。此外，MARCH2和CFTR表达之间存在显著负相关。结论：MARCH2在结直肠癌中高度表达，与肿瘤大小、深部浸润、淋巴结转移和TNM分期等预后不良参数有关。相比之下，CFTR在结直肠癌中几乎不表达，CFTR表达缺失与分化不良、淋巴结转移和TNM分期显著相关。MARCH2可能通过与CFTR的相互作用在结直肠癌的发展中发挥重要作用。它们可能成为结直肠癌诊断、治疗和预后评估的分子标志物。

Abstract: Aims: This study aimed to investigate whether the expressions of MARCH2 and CFTR in colorectal carcinomas were associated with clinicopathological parameters. Methods: The expressions of MARCH2 and CFTR were examined in 125 cases of colorectal carcinomas and 30 normal colorectal tissues using immunohistochemical staining. Results: The positive rates of MARCH2 and CFTR expressions in 125 cases of colorectal carcinoma were 84.8% and 8.8% respectively, whereas the positive expression rates of MARCH2 and CFTR in non-tumor colorectal tissues were 6.7% and 90.0% respectively. The positive expressions of MARCH2 were closely related to tumor size, deep invasion, lymph node metastasis and advanced TNM stage. In addition, loss of expression of CFTR was significantly associated with poor differentiation, lymph node metastasis and advanced TNM stage. Furthermore, there were significant negative correlations between MARCH2 and CFTR expression. Conclusions: MARCH2 is highly expressed in colorectal carcinomas, and is associated with poor prognostic parameters such as tumor size, deep invasion, lymph node metastasis and advanced TNM stage. In contrast, CFTR barely expressed in colorectal carcinomas, and loss of expression of CFTR was significantly associated with poor differentiation, lymph node metastasis and advanced TNM stage. MARCH2 may play an important role in the development of colorectal carcinoma through interaction with CFTR. They may become molecular markers for diagnosis, treatment and prognostic evaluation of colorectal carcinomas.

1. 引言

结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，虽然癌症的联合检查诊断和靶向治疗技术有了很大的发展，但在全球范围内，结直肠癌的发病率和死亡率仍在上升[1] [2]。结直肠癌的发病是一个多因素的过程，涉及多种细胞功能的变化。

MARCH2 (Membrane-Associated RING-CH Protein 2，膜相关环指蛋白2)是MARCH家族的11个成员之一，它含有发挥E3泛素连接酶活性的RING结构域。近来，Liu等人研究[3]表明E3泛素连接酶MARCH2通过负调控PGAM5/MAVS/NLRP3轴抑制心肌焦亡，保护心肌缺血再灌注损伤。Chathuranga研究团队[4]报道E3连接酶MARCH2是细菌或病毒感染时NEMO介导的信号传导的新型负向调节因子，MARCH2在感染后期直接与NEMO相互作用，并催化NEMO上Lys326的K-48连接泛素化，从而导致其降解。MARCH2的缺失导致对细菌/病毒感染的抵抗力及体内外先天免疫反应的显著增强。此外，由于细胞因子的大量产生，MARCH2-/-小鼠更易接受LPS挑战。总之，这些发现为NEMO的分子调控提供了新的见解，并表明MARCH2在先天免疫反应的稳态控制中发挥着重要作用。Guggino研究小组发现[5]，在CFBE细胞中MARCH2通过与CAL和STX6结合，促进了CFTR的泛素化和降解。

CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)是一种cAPMP依赖的氯离子通道，在多种上皮组织、平滑肌、内皮细胞中广泛表达。CFTR在包括胃肠道、气道的分泌和吸收中起着重要的作用。CFTR基因突变会引起氯离子和水分的异常运输，以及肠道液体分泌的紊乱，从而导致分泌性腹泻。此外，CFTR基因突变，可造成蛋白质功能异常，引起分泌物黏稠，会堵塞呼吸道，导致肺囊性纤维化[6]。近年来的研究发现，CFTR除了是一个离子通道，也是一个与癌症进程相关的多个信号通路的重要调节器，它的突变能增加胃肠道、胰腺等的患癌风险[7]-[11]。

我们先前的研究结果显示，MARCH2通过PDZ结构域与CFTR相互作用[12]，促进其泛素化、降解，从而抑制CFTR介导的肿瘤细胞自噬。然而，MARCH2与CFTR在肿瘤中的相关性尚不清楚。

鉴于MARCH2是CFTR的E3泛素连接酶，我们推测MARCH2有可能通过与CFTR相互作用从而参与肿瘤的发生、发展与演进。本研究中，我们使用免疫组织化学染色检测了125例结直肠癌中MARCH2和CFTR的表达，并评估了这两种生物标志物与临床病理参数的相关性。

2. 材料与方法

2.1. 临床标本

选取2005年1月至2021年12月在山东医学高等专科学校附属医院和北京大学第三医院存档的原发性结直肠癌手术切除标本125例及正常结直肠黏膜组织标本30例。所有的患者术前均没有接受放、化疗及生物治疗。病理检查均证实为原发性结直肠癌。男性62例，女性63例，年龄51~83岁。临床病理分期采用AJCC第八版癌症分期标准。

2.2. 抗体和试剂

MARCH2抗体和CFTR抗体购自美国Abcam公司；浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥公司；SP免疫组织化学染色试剂盒购自福州迈新公司。

2.3. 实验方法

应用免疫组织化学SP法进行染色，一抗MARCH2 (1:150)、CFTR (1:300)，严格按试剂盒说明书操作步骤进行。

2.4. 结果判读

由3位病理专家分别评估MARCH2和CFTR蛋白表达水平：根据阳性染色强度按未着色、淡褐色、褐色、棕褐色分成4个等级，分别计分为0、1、2、3分；将阳性面积占比按≤5%、6%~25%、26% ~50%、51%~75%、≥76%分成5个等级，分别计分为0、1、2、3、4分。将两项评分结果相乘视为总评分：0~3分为(−)，4~6分为(+)，7~9分为(++)，10~12分为(+++)。其中(−)判定为阴性，(+~+++)判定为阳性，(++~+++)判定为强阳性。

2.5. 统计学分析

数据分析采用SPSS26.0统计软件，采用χ²检验计算分类变量的组间差异，两变量之间的相关性采用Spearman等级相关性分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. MARCH2和CFTR在结直肠癌组织中的表达

MARCH2染色主要位于肿瘤细胞胞质和(或)胞核，呈弥漫棕色颗粒状(图1)。125例结直肠癌组织中MARCH2阴性19例，弱阳性22例，中度阳性56例，强阳性28例。MARCH2在结直肠组织中的阳性率为84.8% (106/125)。30例正常结直肠黏膜组织中MARCH2阴性28例，弱阳性2例。MARCH2在正常结直肠黏膜组织中的阳性率为6.7% (2/30)。与正常结直肠黏膜组织相比较，MARCH2的蛋白表达在结直肠癌组织中的阳性率显著升高(P < 0.01，见表1)。

Table 1. Expression of MARCH2 and CFTR in colorectal cancer and normal colorectal mucosal tissues

表1. 结直肠癌及正常结直肠黏膜组织中MARCH2和CFTR的表达

免疫组织化学染色	标本类型
MARCH2	正常结直肠黏膜组织	结直肠癌组织
−	28	19
+	2	22
++	0	56
+++	0	28
合计	30	125
阳性率(%)	6.7%	84.8%
CFTR	正常结直肠黏膜组织	结直肠癌组织
−	3	113
+	7	11
++	12	1
+++	8	0
合计	30	125
阳性率(%)	90.0%	8.8%

Figure 1. Immunohistochemical staining of MARCH2 and CFTR in colorectal cancer tissue and normal intestinal mucosal tissue. In colorectal cancer tissues, MARCH2 expression is significantly increased and CFTR expression is significantly decreased

图1. 结直肠癌组织和正常肠黏膜组织中MARCH2和CFTR的免疫组织化学染色。在结直肠癌组织中，MARCH2表达显著增高，CFTR表达显著降低

CFTR染色主要位于肿瘤细胞胞质和(或)胞膜(图1)。125例结直肠癌组织中CFTR阴性113例，弱阳性11例，中度阳性1例，强阳性0例。CFTR在结直肠组织中的阳性率为8.8% (11/125)。30例正常结直肠黏膜组织中CFTR阴性2例，弱阳性7例，中度阳性12例，强阳性8例。CFTR在正常结直肠黏膜组织中的阳性率为90% (27/30)。CFTR在结直肠癌组织中的阳性率明显高于正常结直肠黏膜组织，差异有统计学意义(P < 0.01，表1)。

3.2. MARCH2、CFTR的蛋白表达与临床病理特征的相关性

MARCH2的蛋白表达与结直肠癌的大小、肿瘤的分化程度、肿瘤的浸润深度、淋巴结的转移情况以及TNM分期呈密切相关(P < 0.05，见表2)，而与年龄、性别因素无相关性(P > 0.05，见表2)。CFTR的蛋白表达与肿瘤的分化程度、淋巴结的转移情况以及TNM分期呈显著相关(P < 0.01，见表2)，而与年龄、性别、肿瘤的直径及浸润深度无相关性(P > 0.05，见表2)。

Table 2. Correlation between MARCH2 and CFTR expression and clinical pathological features

表2. MARCH2和CFTR表达与临床病理特征的相关性

临床病理参数	MARCH2		X^2	P	CFTR		X^2	P
	−	+			−	+
性别
男	9	53	1.39	>0.05	54	8	2.58	>0.05
女	10	53			60	3
年龄
<60	9	51	0.11	>0.05	55	5	0.03	>0.05
≥60	10	55			59	6
肿瘤大小
≤5 cm	14	46	5.92	<0.05	52	8	2.99	>0.05
>5 cm	5	60			62	3
分化程度
中–高分化	5	24	4.97	<0.05	25	4	65.7	<0.01
低分化	14	82			89	7
浸润深度
T1~T2	2	9	7.08	<0.01	10	1	0.2	>0.05
T3~T4	17	97			104	10
淋巴结转移
有	10	75	79.6	<0.01	78	7	7.7	<0.01
无	9	31			36	4
TNM分期
Ⅰ~Ⅱ	9	28	9.3	<0.01	33	4	6.6	<0.01
Ⅲ~Ⅳ	10	78			81	7

3.3. 结直肠癌中MARCH2与CFTR表达的相关性

免疫组化结果表明，MARCH2阳性为细胞质和(或)细胞核有中等或强的棕色颗粒，MARCH2的表达与CFTR的表达呈正相关(P < 0.05，表3)。

Table 3. Correlation between MARCH2 and CFTR expression in colorectal cancer

表3. 结直肠癌中MARCH2与CFTR表达的相关性

CFTR	MARCH2		合计	rs值	P值
	+	−
+	3	8	11	−0.27	0.032
−	103	11	114
合计	106	19	125

^*Spearman test.

4. 讨论

MARCH2是一种双跨膜蛋白，由N端RING结构域、中间两个跨膜结构域和C端PDZ结构域组成。在我们之前的研究中[12]，MARCH2通过PDZ结构域与CFTR相关，通过RING结构域促进CFTR的泛素化和降解，通过CFTR信号传导负调控自噬。此外，CFTR在肿瘤进展和转移中起着重要作用。根据肿瘤的类型[13]-[19]，CFTR基因变异可能会增加或降低肿瘤发生的风险，表明CFTR是一个肿瘤抑制因子或促进因子。在卵巢癌[13] [14]和宫颈癌[15]中，CFTR的高水平表达与肿瘤恶性程度和演进密切相关。在非小细胞肺癌[16]和乳腺癌[17]中，CFTR显著下调，并且CFTR的低表达与肿瘤的演进和转移显著相关。Sun等人[18]报道，破坏CFTR和AF-6/afadin之间的相互作用加重了结肠癌的恶性表型。在前列腺癌[19]中，CFTR通过靶向PLAU (纤溶酶原激活剂，尿激酶)的MIR193B抑制肿瘤进展。由于MARCH2是CFTR的E3泛素连接酶，我们推测MARCH2通过CFTR参与肿瘤的发展。

在这项研究中，我们使用免疫组织化学染色检测了125例结直肠癌中自噬负调控因子MARCH2和CFTR的表达，评估了MARCH2和CTFR与临床病理参数的相关性，并分析了MARCH2与CFTR之间的相关性。我们发现，与正常肠黏膜组织相比，结直肠癌中的MARCH2染色升高，这表明其可能参与了癌症的发展。特别是，我们的结果显示，MARCH2阳性染色在肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移或TNM分期的结直肠癌中更常见，表明其可能在肿瘤进展中起作用。相比之下，与正常肠黏膜组织相比，结直肠癌中的CFTR染色减少，CFTR表达缺失与分化不良、淋巴结转移和TNM分期显著相关。此外，MARCH2表达与CFTR表达呈负相关。这些结果表明，MARCH2过表达和CFTR表达降低与结直肠癌的发生和进展有关。MARCH2和CFTR表达的联合检测可以为肠癌的诊断、治疗和预后评估提供参考。

基金项目

本研究由国家自然科学基金项目(81702776)；山东省医药卫生科技项目(202304010866)；临沂市重点研发计划(医学类) (2023YX0096)；山东省自然科学基金项目(ZR2020QH041)；山东省医药卫生科技项目(20230206735)；徐州医科大学附属医院发展基金项目(XYFM202348)资助。

NOTES

^*通讯作者。