1. 引言
近年来，随着人们对中药需求的不断增加，中药的研究也逐渐成为热点，中药的有效成分主要是有机化合物，如生物碱、皂苷、黄酮、有机酸等，此外也有研究表明无机成分也是中药的有效成分 [1] ，如微量元素和宏量元素。中药所含丰富的微量元素含量与中药功能有一定的相关性，对人类的健康有重要作用 [2] 。但在相当长一段时间内，学术界对中药的化学成分研究主要侧重于有机成分，对中药的微量元素研究不多。近年来随着中药药理学研究的不断深入，人们认识到微量元素对疾病的防治起着重要作用 [3] ，中药微量元素的研究逐渐成为新热点 [4] [5] ，揭示了微量元素在中药功效中确实占有一定的地位。微量元素与活性分子在人体内起着相互协同、互相补充、互相渗透、互相制约的作用，并参与体内各种生化反应，促进机体的自身调节，达到新的阴阳平衡，从而达到治疗疾病的目的 [6] [7] 。随着医学与尖端分析技术的发展，大量研究证明，许多微量元素皆为机体中构成酶、激素和维生素的重要辅因子，参与机体的正常代谢，直接影响机体的生长发育 [8] [9] [10] [11] 。论文通过不同处理方法处理四种中药材，利用ICP-AES技术测定四种补肾中药材中14种微量元素的含量。综合分析四种中药材常见微量元素含量的关系，利用因子分析等分析方法结合SPSS16.0统计软件对中草药微量元素进行分析，并对各微量元素进行分析比对，给出四种补肾中药材客观合理的综合评价标准。
2. 实验部分
2.1. 实验材料
枸杞、黄精、巴戟天、肉苁蓉(四种中药材均购买自云南省昆明市福林堂中药饮片有限公司)。
仪器：VISFA-MPX型电感耦合等离子体发射光谱仪：美国Varian公司；电热恒温鼓风干燥箱：GZX-GF101-3-BS-II/H，上海跃进医疗器械有限公司；电子天平：BS224S，北京赛多利斯仪器系统有限公司；微波消解仪：MDS-2002A，上海新仪微波化学科技有限公司。
试剂：钙、镁、铁、锌、钾等标准储备溶液(国家钢铁材料测试中心)；硝酸和双氧水为优级纯(国药集团化学试剂有限公司)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 样品的制备
水解法制备中药提取液：准确称取中草药各2.000 g，分别放250 mL锥形瓶中，加入50 mL超纯水，放置浸泡30 min后，置于电炉上加热，加热时间分别为10 min、20 min、30 min、40 min取下冷却后，过滤并定溶至100 mL，每个处理条件3个平行。
微波消解法制备样品：分别精确称取0.500 g中草药样品于聚四氟乙烯罐中，加5 ml浓硝酸，放到电热板上碳化15 min，随后补加4 ml浓硝酸和1 ml H2O2，然后把聚四氟乙烯罐置于微波消解仪中。按一下步骤进行消解：
1) 压力0.2 MPa运行4 min；
2) 压力0.2 MPa运行3 min；
3) 压力1.0 MPa运行2 min；
4) 压力1.5 MPa运行2 min；
5) 压力1.8 MPa运行5 min。
消解完成后冷却至室温，将消解罐中的液体转移到50 ml容量瓶中，用5%硝酸定容。平行做空白试验。
2.2.2. 微量元素检测
仪器：VISFA-MPX型电感耦合等离子体发射光谱仪(美国VARIAN公司)；波长范围：175~785 nm波长连续覆盖，完全无断点；焦距0.4 m，中阶梯光栅刻线97.4线∙mm−1，RF发生器频率40.68 MHz；等离子体输出功率700~1700 W；等离子体冷却气0~22.5 L∙min−1可调。其他仪器工作参数如表1所示。
2.2.3. 因子分析
因子分析是研究观测变量变动的共同原因和特殊原因，从而达到简化变量结构的目的。
2.2.4. 方差分析
用变量在各组的均值与该组内变量值之偏差平方和的总和表示，记作SSw，组内自由度dfw。实验
Table 1. Instrument operating parameters
表1. 仪器工作参数
条件，即不同的处理造成的差异，称为组间差异。用变量在各组的均值与总均值之偏差平方和表示，记作SSb，组间自由度dfb。总偏差平方和SST = SSb + SSw。
2.2.5. 相关分析
相关表和相关图可反映两个变量之间的相互关系及其相关方向，但无法确切地表明两个变量之间相关的程度。相关系数是用以反映变量之间相关关系密切程度的统计指标。相关系数是按积差方法计算，同样以两变量与各自平均值的离差为基础，通过两个离差相乘来反映两变量之间相关程度；着重研究线性的单相关系数。依据相关现象之间的不同特征，其统计指标的名称有所不同，用SPSS等软件分析 [12] [13] [14] ，将反映两变量间线性相关关系的统计指标称为相关系数(相关系数的平方称为判定系数)；将反映两变量间曲线相关关系的统计指标称为非线性相关系数、非线性判定系数；将反映多元线性相关关系的统计指标称为复相关系数、复判定系数等。
3. 结果与讨论
3.1. 四种补肾中药材微量元素分析
本文采用直接消解法和水煮法提取四种补肾中药内的微量元素，并检测提取液内14种微量元素含量，结果见表2~表5 (注：“-”代表低于检测线)。
从总体上看(表2、表3、表4、表5)直接消解法提取含量和稳定性优于水煮法。单从提取效率分析，直接消解法有利于中药微量元素的提取，但是直接消解法成本高于水解法。水解法提取的四个处理组(水煮10 min、20 min、30 min、40 min)中，水煮30 min处理组微量元素的提取率高于其它三个处理组，表明水煮时间与微量元素的提取效率有一定关系。检测的四种中药材的微量元素中：枸杞的Fe含量最高，Cu含量最低，Mo含量检测不到；肉苁蓉的Fe含量最高，Cu含量最低，Mn和Mo含量检测不到。检测的四种中药材的常量元素中：枸杞的K含量最高，P含量最低；黄精的Ca含量最高，P含量最低；巴戟天的Ca含量最高，P含量最低；肉苁蓉的Na含量最高，P含量最低。由此可见，四种中药材微量元素中Fe和Cu含量较高，常量元素中K，Ca，Na含量较高，P含量最低。
Table 2. The content of 14 elements in Lycium barbarum
表2. 枸杞微量元素含量
3.2. 不同提取条件对四种中药中14种元素提取含量的方差分析
四种中药中常量元素和微量元素用方差分析比较在不同测定方法下微量元素的差异，测定方法(有5个水平)：A1——直接消解，A2——水煮10分钟后测水溶液，A3——水煮20分钟后测水溶液，A4——水煮30分钟后测水溶液，A5——水煮40分钟后测水溶液，结果见表6~表9。
Table 3. Content of 14 elements in Polygonatum sibiricum
表3. 黄精微量元素含量
Table 4. The content of 14 elements of Morinda officinalis
表4. 巴戟天微量元素含量
由表6~表9可以看出：从提取的含量方面比较，不同方法提取四种中药材中14种元素含量差异是极其显著的，直接消解法提取的各种元素的含量除个别元素外均显著高于水煮法。因此，直接消解法提取法优于水煮法。从提取元素含量的稳定性方面比较，直接消解法较水煮法稳定。不同的元素用水煮法提取时，测得最高含量的时间不一定，这就使得操作上难以统一计时，使得试验复杂化。基于以上两点直接消解法提取含量和稳定性优于水煮法。除此之外我们还可以看出这14种元素中Ca和Na元素在用水煮法提取过程中随时间变化量小。
Table 5. Contents of 14 elements in Cistanche deserticola
表5. 肉苁蓉微量元素含量
Table 6. Analysis of variance of 14 elements in Lycium barbarum under different measuring methods
表6. 不同测定方法对枸杞14个元素的方差分析
注：相同大写或小写字母代表差异不显著，不同小写字母代表差异显著(P < 0.05)，不同大写字母代表差异极显著(P < 0.01)；-代表未检测出。
Table7. Analysis of variance of 14 elements in Polygonatum sibiricum by different methods
表7. 不同测定方法对黄芪14个元素的方差分析
注：相同大写或小写字母代表差异不显著，不同小写字母代表差异显著(P < 0.05)，不同大写字母代表差异极显著(P < 0.01)；-代表未检测出。
Table 8. Variance analysis of 14 kinds of elements between different determination methods of Morinda officinalis
表8. 不同测定方法组间14种元素的方差分析
注：相同大写或小写字母代表差异不显著，不同小写字母代表差异显著(P < 0.05)，不同大写字母代表差异极显著(P < 0.01)；-代表未检测出。
3.3. 四种补肾中药的特征元素分析
用因子分析方法 [15] [16] 分析补肾类中药内14种微量元素的特征元素，描述14种微量元素间的联系,结果见表10~表12。
由表10可以看出，近80.1%的相关系数的绝对值大于0.3，说明变量之间有较好的相关性，所以能综合反映这些变量的共同特征的少数公因子变量。
Table 9. Variance analysis of 14 elements in Cistanche deserticola under different methods of determination
表9. 不同测定方法组中14种元素的方差分析
注：相同大写或小写字母代表差异不显著，不同小写字母代表差异显著(P < 0.05)，不同大写字母代表差异极显著(P < 0.01)；-代表未检测出。
Table 10. Analysis of characteristic elements of various trace elements in Chinese herbal medicine for tonifying kidney
表10. 补肾中药中各种微量元素的特征元素分析
由表11可以看出，前3个主因子的累积贡献率达到100%，前3个因子能解释原始数据100%的信息，因此选取前3个主因子来表示原始微量元素在分析样本中的主要信息。选取前三个因子进行成分矩阵和旋转成分矩阵分析。
由表12可看出，第一公因子F1：在变量Ca (0.817)、Cu (0.833)、Fe (0.809)、Mg (0.847)、Si (0.997)、Zn (0.971)元素上有高的载荷系数，即变量Ca、Cu、Fe、Mg、Si和Zn与第一公因子高度正相关，是F1的特征元素。第二公因子F2：在变量B (0.961)、K (0.886)、Mo (0.772)、S (0.779)元素上有高的载荷系数，
Table 11. Total variance was explained by factor analysis of Chinese herbal medicine for tonifying kidney
表11. 补肾类中草药因子分析的解释的总方差
即变量B、K、Mo和S与第二公因子高度正相关，是F2的特征元素。第三公因子F3：在变量Na (0.729)、Sr (0.922)元素上有高的载荷系数，即变量Na和Sr与第三公因子高度正相关，是F3的特征元素。所以可以说明补肾类中药可以提取三个独立的公共因子变量，三个公因子变量从不同方面体现了补肾类中药的本质特征。
3.4. 加标回收实验
选取枸杞进行加标回收实验，评估本次检测分析结果的准确性和可靠性。各待测元素的标准溶液按一定的量分别加入到试验样品中，按消解样品的方法进行消解，重复测定5次，按我们的试验方法消解样品，各元素的相对标准偏差(RSD)在0.15%~3.65%之间，各元素的回收率在94%~105.5%之间，表明本文测量结果可准确评估四种中药材中14种微量元素的含量。
3.5. 讨论
通过水解法和直接消解法提取四种补肾中药材内14种元素含量，结果显示不同的提取方法对14种微量元素有显著影响，在低成本前提下水煮30 min提取效果最佳，但直接消解法能更真实地反应样品中各元素的含量。因此，本试验认为直接消解法就其提取率和稳定性来说都优于水煮法。四种中药材内14种微量元素含量差异明显，同时也存在相似之处，四种中药材内Mo均低于检测线，原因可能是这四种中药材中Mo含量较低，在这两种检测方法下无法检测到。今后试验如需检测Mo可以加大实验材量或者选择精度更高的方法检测。在这四种中药材中Na、K和Ca三种元素含量最高，且占14种元素含量的87.3% (枸杞)、75.3% (黄精)、84% (巴戟天)、92.2% (肉苁蓉)。四种中药中单种元素最高分别为K (枸杞)、Ca (黄精)、Ca (巴戟天)、Na (肉苁蓉)。
补肾类中药可以提取三个独立的公共因子变量，三个公因子变量从不同方面体现了补肾类中药的本质特征。变量Ca、Cu、Fe、Mg、Si和Zn与第一公因子F1高度正相关，是F1的特征元素；变量B、K、Mo和S与第二公因子F2高度正相关，是F2的特征元素；变量Na和Sr与第三公因子F3高度正相关，是F3的特征元素。
直接消解法就其提取率和稳定性来说都优于水煮法。本文通过四种补肾中药内14种元素的研究，显示四种补肾中药材的微量元素具有相似性，支持微量元素在中药材中起重要作用这一观点。未来的研究中通过更多种类补肾中药中微量和常量元素分析，将有助于开拓微量和常量元素在中药材中的功能新领域。
基金项目
云南省教育厅科学研究基金项目(2014Y329)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。