1. 引言
芭蕉芋，学名蕉藕，是美人蕉科美人蕉属多年生单子叶草本植物，原产于南美等地，我国主要分布在贵州、云南、广西、广州等南部省区 [1] [2] [3] [4]，具有适应性广、喜温光、抗逆性强、产量高、易栽培、用途广等特点。芭蕉芋块茎含有高达60%的淀粉，近年来已有将芭蕉芋淀粉简单物化改性制备改性淀粉 [5]、生产粉丝、淀粉糖、代餐粉和甘油等产品 [4] [6] [7] [8]，也有将芭蕉芋淀粉经生物转化而获得乙醇 [9] [10]。普鲁兰酶是淀粉酶的一种，属于脱支类淀粉酶，用普鲁兰酶对淀粉适度处理能改变淀粉的分子结构和理化特性 [11] [12]。普鲁兰酶与双酶法结合应用到原料水解工艺中，可提高淀粉转化还原糖的效率，增加发酵速度，提高原料利用率 [13]。
来源于不同产地的同一品种，原料的成分也有所不同，成分不同会影响原料的出酒率，通过对其所含的水分、淀粉含量、蛋白质含量、脂肪、纤维素含量进行常规分析后，有针对性添加酶制剂，可有效促进原料的充分降解及利用。根据芭蕉芋淀粉的特性，本文在糖化、液化的不同阶段添加普鲁兰酶，并与α-淀粉酶及糖化酶相结合，对芭蕉芋淀粉的降解情况进行试验研究，以期为芭蕉芋淀粉制备燃料乙醇提供基础数据。
2. 材料与方法
2.1. 主要原材料
α-淀粉酶：上海晶抗生物工程有限公司，10,000单位
糖化酶：南宁庞博生物工程有限公司，20,000单位
普鲁兰酶：上海鼎好生物科技有限公司，2000单位
酿酒高活性干酵母：山东伟多丰生物技术有限公司
芭蕉芋淀粉：购于昭通市农贸市场。
2.2. 仪器设备
分析天平、台式高速离心机、分光光度计、可控温电炉、恒温水浴锅、酸度计、容量瓶、三角瓶、滴定、电热鼓风干燥箱等。
2.3. 测定项目及方法
还原糖、总糖检测：采用菲林试剂直接滴定法 [14] [15] 测定糖化前后和发酵后10 mL料液中还原糖和总糖含量。根据还原糖含量推算淀粉含量 [16]。
低聚糖的测定：采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法 [17]。
粗蛋白含量：采用海能全自动凯氏定氮仪测定芭蕉芋淀粉中蛋白质含量 [18]。
粗脂肪含量：利用索氏抽提法测定 [19]。
水分、灰分含量：采用常规测定方法 [10] 测定。
pH：采用pH计直接测定法测量糖化后和发酵后的料液pH值。
酒精体积分数的测定：取100 mL芭蕉芋发酵料，置于500 mL圆底烧瓶中，加100 mL水进行蒸馏，用100 mL容量瓶收集馏出液体，并定容至100 mL，采用比重瓶法测定酒精体积分数 [20]。
2.4. 试验方法
2.4.1. 不同阶段添加普鲁兰酶的作用效果
首先通过预实验确定了淀粉酶和糖化酶适合用量分别为5 µ/g及150 µ/g芭蕉芋淀粉。在此基础上共设4个处理方式，即在不同阶段按普鲁兰酶30 µ/g芭蕉芋淀粉添加：A组在淀粉酶液化前首先加入；B组与淀粉酶同时加入；C组与糖化酶同时加入；以不加入普鲁兰酶为对照(CK)。具体试验方法为：A组将芭蕉芋淀粉与水按1:3的量调成淀粉糊，在搅拌下水浴加热至90℃糊化，冷却至60℃时加入普鲁兰酶(30 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min ；再将温度升高至70℃，加入α-淀粉酶(5 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min；最后将温度降低至60℃，加入糖化酶(150 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min。B组将木薯淀粉与水按1:3的量调成淀粉糊，在搅拌下水浴加热至90℃糊化，再降低到70℃时加入淀粉酶(5 µ/g芭蕉芋淀粉)和普鲁兰酶(30 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min；再将温度降低至60℃，加入糖化酶(150 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min。C组将芭蕉芋淀粉与水按1:3的量调成淀粉糊，在搅拌下水浴加热至90℃糊化，再降低到70℃时加入淀粉酶(5 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min；再将温度降低至60℃，同时加入糖化酶(150 µ/g芭蕉芋淀粉)和普鲁兰酶(30 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min。D组为CK组不添加普鲁兰酶。各阶段结束后取样测定还原糖和总糖含量。
2.4.2. 添加不同剂量普鲁兰酶的降解效果
通过不同阶段添加普鲁兰酶的作用效果，确定了在液化前添加普鲁兰酶对芭蕉芋淀粉的降解效果更好。在500 ml三角瓶中，将芭蕉芋淀粉与水按1:3的量调成淀粉糊，在搅拌下水浴加热至90℃糊化，冷却至60℃时加入普鲁兰酶(设定添加的普鲁兰酶量分别为0 µ/g，5 µ/g，10 µ/g，15 µ/g，20 µ/g，25 µ/g，30 µ/g，35 µ/g和40 µ/g)，保持30 min；再将温度升高至70℃，加入α-淀粉酶(5 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min；最后将温度降低至60℃，加入糖化酶(150 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min；冷却至32℃左右，按0.5‰添加安琪酵母，按2‰添加尿素和磷酸二氢钾并拌匀 [21]，瓶口塞上发酵栓，于32℃恒温箱中进行酒精发酵60 h。发酵结束检测还原糖含量，总糖含量以及酒精质量分数。
3. 结果与分析
3.1. 原料基本特性测定结果
以购买于农贸市场的芭蕉芋淀粉为原料，经测定其基本成分如表1所示。
Table 1. Composition of Canna edulis Ker starch
表1. 芭蕉芋淀粉的成分
由表1可以看出，实验所用原料中的粗淀粉含量较高，达60%以上。同时还含有蛋白、纤维和脂肪等，其中脂肪含量较低，仅占0.35%。据文献报道 [5]，芭蕉芋淀粉的磷和结合磷含量接近于马铃薯淀粉，比玉米淀粉略高。
3.2. 不同阶段添加普鲁兰酶对糖含量的影响
以芭蕉芋淀粉为原料发酵制备乙醇的过程中，不同的处理阶段添加普鲁兰酶30 µ/g，即分别在淀粉酶液化前加入(A组)、与淀粉酶同时加入(B组)以及与糖化酶同时加入(C组)，对照组不添加普鲁兰酶，各阶段结束后分别测定体系中的还原糖和总糖含量，结果如表2、表3所示。
Table 2. Reducing sugar content of adding pullulanase to treat Canna edulis Ker starch at different stages (%)
表2. 不同阶段添加普鲁兰酶处理芭蕉芋淀粉后还原糖含量(%)
从表2可以看出，在芭蕉芋淀粉降解工艺中添加普鲁兰酶后，体系中还原糖含量均高于对照组，其中A处理(液化前添加普鲁兰酶)的还原糖含量增加较明显，糖化后还原糖含量比对照组提高了1.45%。这说明在液化前添加普鲁兰酶，对芭蕉芋淀粉进行预处理，更有助于后续糖化酶对淀粉的降解。
Table 3. Total sugar content of adding pullulanase to treat Canna edulis Ker starch at different stages (%)
表3. 不同阶段添加普鲁兰酶处理芭蕉芋淀粉后体系中总糖含量(%)
从表3可以看出，在芭蕉芋淀粉降解工艺中添加普鲁兰酶后，总糖含量有明显提高，在前两阶段C处理组中的总糖含量最高，B处理组次之，经过糖化阶段后，B处理组中总糖含量最高，C处理组次之。可以看出，普鲁兰酶的添加能提高体系中总糖的含量，但添加顺序对体系中总糖含量变化的影响并不明显。
从表2和表3可以看出，添加普鲁兰酶后，体系中还原糖和总糖含量都有不同程度的提高，其添加的顺序对体系还原糖含量有很大的影响，而对总糖含量影响并不明显。从经济性和实用性的角度考虑，B处理比较合理，即在液化阶段，添加普鲁兰酶对芭蕉芋淀粉进行降解的效果最好。
3.3. 普鲁兰酶添加量对芭蕉芋淀粉糖化及酒精体积分数的影响
为了进一步确定普鲁兰酶对芭蕉芋淀粉降解效果的影响，采取在液化阶段同时添加不同用量的普鲁兰酶(0 µ/g、5 µ/g、10 µ/g、15 µ/g、20 µ/g、25 µ/g、30 µ/g、35 µ/g和40 µ/g)，再糖化并继续发酵产乙醇，结束后对体系中还原糖、总糖含量以及酒精质量分数进行了测定，结果见表4。
Table 4. Effects of the addition amount of pullulan on the conversion rate of reducing sugar, total sugar and alcohol in the system
表4. 普鲁兰酶添加量对体系还原糖、总糖和酒精质量分数的影响
从表4中可以看出，随着普鲁兰酶用量的增加，体系中还原糖含量也在增加，普鲁兰酶用量在0 µ/g至10 µ/g，体系中还原糖含量缓慢增加；当用量在10 µ/g至20 µ/g，体系中还原糖含量增幅最为明显；当用量20 µ/g至30 µ/g，体系中还原糖含量缓慢增加，并在此范围内达到还原糖含量达到了最大值；超过30 µ/g时，体系中还原糖含量降低。普鲁兰酶的添加，对体系中总糖的影响趋势与对还原糖的类似，但没有对还原糖的影响明显。普鲁兰酶的添加，对酒精质量分数的影响较明显，与不添加普鲁兰酶发酵的结果相比，提高了1.3。因此，考虑成本问题，普鲁兰酶最适用量20 µ/g至30 µ/g之间。
4. 结论
1) 在液化前添加普鲁兰酶有助于芭蕉芋淀粉的降解。
2) 添加普鲁兰酶的量过少，达不到理想效果，糖化率偏低，若普鲁兰酶添加过多，将会增加成本。本实验条件下，普鲁兰酶的最适用量为30 µ/g芭蕉芋淀粉，可使还原糖的含量达到10.31%，比对照组提高1.29%，发酵结束后的酒精质量分数提高了1.3。
3) 普鲁兰酶辅助双酶法可有效提高芭蕉芋淀粉的降解率。
基金项目
云南省国际科技特派员项目(2015IA022)；云南省农村能源工程重点实验室基金项目(2017KF03)；云南省科技富民强县计划(2014EA006)和昆明市科技计划项目(2014-01-A-G-02-3059)联合资助。
NOTES
*通讯作者。